Multimodal Doğrusal Olmayan Optik Mikroskopi Kullanılarak Nanopartiküllerin Hücresel Alımının Biyomoleküler Görüntülenmesi
16 Mayıs 2022
Bu makalede, altın nanopartiküllerin ve kanser hücrelerinin hızlı hiperspektral görüntülenmesini sağlayan spektral odaklama modülü ve çift çıkışlı darbe lazerinin entegrasyonu sunulmaktadır. Bu çalışma, multimodal doğrusal olmayan optik tekniklerin ayrıntılarını standart bir lazer tarama mikroskobu üzerinde göstermeyi amaçlamaktadır.
Protokolümüz multimodal, doğrusal olmayan, optik bir mikroskopi sunar ve kanser hücrelerinde altın nanopartiküllerin kimyasal olarak spesifik görüntülemesini gerçekleştirmek için uygular. Görüntüleme sistemimizin temel avantajı, hücresel yapıların ve altın nanopartiküllerin biyomoleküler kontrastını multimodal bir şekilde gözden geçirmek için kullanılabilmesidir. Başlamak için, uzaktan kumanda kutusu hariç tüm ekipmanların fişlerini açın.
Ardından, kutunun arkasını açın ve kontrol kutusundaki uzak ışık mavi yandıktan sonra İşlemi Başlat'a basın. Daha sonra, lazer tarama mikroskobunun PC'sini açın ve konfokal mikroskop yazılımını çalıştırın. Ardından, bilgisayar yazılımını kullanarak mikroskopun ışık yolunu kontrol edin ve odağı dokunmatik ekrandan veya uzaktan kumanda düğmelerinden veya bilgisayar yazılımından kontrol edin.
Yakınlaştırma, piksel cinsinden Görüntü Boyutu ve piksel bekleme süresi dahil olmak üzere yazılımda istediğiniz görüntü ayarlarını seçin ve pikselin bekleme süresinin entegrasyon süresinden daha büyük olmasını sağlayın. Lazer ışınlarını numuneye odaklayan suya daldırma hedefinin üzerine ve görüntüleme için kondenser ile numune arasına bir damla damıtılmış su damlacığı yerleştirin. Ardından, maksimum ışık miktarını toplamak için kondenserin yüksekliğini numunenin yaklaşık bir milimetre yukarısına ayarlayın ve hareketli bir montaj üzerine yerleştirilen SRS dedektörünü beyaz ışık kullanarak numuneye odaklanmak için ışın yolundan dışarı doğru hareket ettirin.
Yazılım ayarlarını kullanarak, pompa ışınını seçin ve lazer dalga boyunu CH titreşimleri için 802 nanometre ve amid I zirvesi için 898 nanometre olarak değiştirin ve Raman kaymasındaki büyük değişiklikleri hesaba katın. Raman kaymasında küçük ayarlamalar yapmak için, SFTRU birimindeki gecikme aşamasını makalede açıklandığı gibi tarayın. Hiperspektral veri kümesi için Tetikleyici sekmesini seçin, ttl tetikleyicisiyle başlat'a tıklayın ve ardından Her kareyi tetikle'yi seçin.
Ardından, Seri sekmesinde, zaman serisini açık ve Z serisini kapalı olarak ayarlayın. Ayrıca, zaman serisindeki kare sayısını ATM yazılımındaki adım sayısıyla eşleşecek şekilde ayarlayın. Ardından, ATM yazılımındaki Çalıştır sekmesine gidin ve CH için gecikme aşaması konumlarını 90.25 ve 92.25 olarak ayarlarken, amide I bölgesi için hiperspektral taramanın başlatma ve durdurma konumuna karşılık gelen 89 ve 91 milimetre olarak, adım sayısının bilgisayar yazılımındaki kare sayısıyla eşleşmesini sağlayın.
Doğru ayarları kontrol ettikten sonra, önce Al'a gidip ardından Taramayı başlat'a tıklayarak bilgisayar yazılımındaki hiperspektral yığını başlatın. Ardından, ATM yazılımında, seçilen başlangıç ve bitiş konumları arasındaki gecikme aşaması konumunda artımlı artışlarla bir dizi görüntünün toplanmasını başlatan Başlat'a tıklayın. Ardından, hiperspektral bir tarama oluşturmak için farklı gecikme aşaması konumlarında bir dizi görüntü alın.
Analog üniteyi kullanarak, görüntü alımını ve gecikme aşamasının hareketini senkronize etmek için SFTRU sistemine ttl sinyalleri gönderin ve alın. CH titreşim bölgesindeki görüntüleme ile amid I titreşim bölgesi arasında geçiş yapmak için, lazer yazılımındaki pompa dalga boyunu 802 nanometreden 898 nanometreye değiştirin. Ayrıca, ATM yazılımındaki Stokes dağılım ayarını 30 milimetreden 5 milimetreye değiştirin.
SFTRU kutusunun içindeki pompa ışını dağılım yolundaki aynaya küçük bir ayar yapmak için ayna yuvasındaki alt düğmeyi ayarlayarak ayna açısını artımlı bir miktarla değiştirin. Polistiren mikrosferlerinin kimyasal seçiciliğini doğrulamak için, hiperspektral uyarılmış Raman saçılması ve spontan Raman spektrumları kaydedildi. Spektrumlar, göreceli yoğunlukta gözlenen fark dışında aynıydı.
4T1 kanser hücrelerinin uyarılmış Raman saçılma görüntülemesi, lipid, protein ve DNA biyomoleküllerinin karbon-hidrojen germe titreşim bandına karşılık gelen 2, 852, 2, 930 ve 2.968 dalga numaralarında gerçekleştirildi. Kanser hücrelerindeki nanopartikül dağılımlarını araştırmak için altın nanopartiküllerle dozlanan 4T1 kanser hücrelerinin multimodal görüntülemesi yapıldı. CH2 ve CH3 kanalı, LysoTracker floresan probları ve rezonans dışı uyarılmış Raman saçılma kanalı için elde edilen uyarılmış Raman saçılma görüntüleri elde edildi.
Hatırlanması gereken en önemli şey, lazer yazılımındaki titreşim bölgesini, pompa referansını ve ayrıca protokol sırasında Stokes dağılım ayarını değiştirmektir. Bu sistem, optik hizalamayı etkilemeden femtosaniyeden pikosaniye bölgesine kolayca değiştirilebilir. Bu yetenek, çoklu foton tutarlı Raman saçılması ve pompa probu spektroskopisi ve uygulamalarını gerçekleştirmemizi sağlar.
Bu multimodal görüntüleme platformu, nanotıp hakkında yeni bilgiler sağlar ve hücrelerin, dokuların ve altın nanopartiküllerin moleküler olarak görüntülenmesinin yolunu açar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, kanser hücrelerindeki altın nanoparçacıkların kimyasal olarak özgün görüntülenmesi için multimodal, doğrusal olmayan bir optik mikroskopi tekniği sunmaktadır. Görüntüleme sistemi, hücresel yapılarda biyomoleküler kontrast incelemesine izin verir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyofizik
- Biyomedikal Görüntüleme
Arka Plan
- Altın nanoparçacıklar, kanser araştırmalarında görüntüleme ve terapötik uygulamalar için kullanılmaktadır.
- Doğrusal olmayan optik teknikler, görüntüleme yeteneklerini artırır.
- Multimodal görüntüleme, hücresel yapılar hakkında detaylı bilgiler sağlar.
- Standart lazer taramalı mikroskoplar, gelişmiş görüntüleme teknikleri için uyarlanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Spektral-odaklaştırma modülünü çift çıkışlı bir darbeli lazerle entegre etmek.
- Altın nanoparçacıkların ve kanser hücrelerinin hızlı hiperspektral görüntülemesini sağlamak.
- Multimodal doğrusal olmayan optik tekniklerin uygulamasını göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Ekipman ve kontrol kutusunun açılması.
- Görüntüleme için konfokal mikroskop yazılımının kullanılması.
- Çeşitli arayüzler aracılığıyla ışık yolunun ve odaklama kontrolü.
- Biyomoleküler kontrastı değerlendirmek için görüntüleme yapmak.
Ana Sonuçlar
- Görüntüleme sistemi, kanser hücrelerindeki altın nanoparçacıkların detaylı görüntülerini başarıyla yakalıyor.
- Multimodal görüntüleme, önemli biyomoleküler kontrastı ortaya çıkarıyor.
- Entegre sistemle hızlı hiperspektral görüntüleme elde ediliyor.
- Çalışma, mikroskopide doğrusal olmayan optik tekniklerin etkinliğini gösteriyor.
Sonuçlar
- Gelişmiş görüntüleme tekniklerinin entegrasyonu, kanser hücrelerinin çalışmasını geliştiriyor.
- Bu yaklaşım, hücresel yapıların daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.
- Gelecekteki uygulamalar, biyomedikal araştırmanın diğer alanlarına genişleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Multimodal nonlinear optical microscopy enables chemically specific imaging of gold nanoparticles within cancer cells, providing high-resolution biomolecular contrast critical for nanomedicine R&D. This platform supports the precise localization and characterization of nanoparticle uptake, informing the design and optimization of functionalized nanomaterials for targeted delivery. Integrating multiple nonlinear optical signals enhances predictive confidence at the interface of discovery biology and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of nanoparticle-cell interactions for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of nanoparticle targeting and uptake in relevant cellular contexts.
- Provides spatial and chemical mapping to clarify biological pathways of nanoparticle distribution.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated imaging assays for nanoparticle localization and trafficking.
- Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative evaluation of nanoparticle formulations.
- Supports assay standardization and scalability for high-content screening of nanomaterial candidates.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cellular models for translational continuity.
- Enables assessment of nanoparticle biodistribution in pericellular and intracellular compartments.
- Provides molecular imaging data to inform preclinical advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This multimodal imaging method bridges early discovery and preclinical research by enabling high-content, chemically specific visualization of nanoparticle uptake and distribution in cancer cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on nanoparticle-cell interactions and pathway engagement.
- Screening: Provides quantitative, reproducible imaging data for candidate comparison.
- Analytics: Generates hyperspectral and multimodal readouts for robust statistical analysis.
- Translational Research: Connects in vitro imaging to preclinical model validation of nanomedicine candidates.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform capability for ongoing nanomaterial and cellular imaging studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in nanoparticle targeting and uptake mechanisms.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable imaging workflows for cross-project application.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for nanomedicine candidates by reducing mechanistic ambiguity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of nanoparticle formulations for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nonlinear optical microscopy and hyperspectral imaging.
- Demands advanced instrumentation, including tunable lasers and synchronized detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis workflows.
- Adaptation may be needed for different cell types or nanomaterial systems.
- Imaging throughput and sample preparation must be balanced with analytical depth.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Operating on the Laser Scanning Microscope
1:30
Mounting a Sample in the Microscope Stage
2:05
Changing the Raman Shift and Collecting a Hyperspectral Data Stack
5:01
Results: Hyperspectral Imaging of Gold Nanoparticles and Cancer Cells
6:16
Conclusion
