Name: RNA Girişiminin Çam Ağacı Nematodunda Uygulanması, Bursaphelenchus xylophilus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Öğrenin, Bursaphelenchus xylophilus nematodunda RNA girişimi için ıslatma yöntemini. Bu teknik, gen fonksiyonu çalışmaları ve patojen nematod biyolojik kontrol stratejileri için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31870637, 31200487) tarafından finanse edildi ve Zhejiang Anahtar Araştırma Planı (2019C02024, LGN22C160004) tarafından ortaklaşa finanse edildi.

Çalışma, Zhejiang Tarım ve Ormancılık Üniversitesi hayvan deneyleri konseyi tarafından onaylandı. B. xylophilus izolatı NXY61, başlangıçta Çin'in Zhejiang eyaletinin Ningbo bölgesindeki hastalıklı bir Pinus massoniana'dan çıkarıldı11.
1. Gen klonlama
NOT: Bu protokolde kullanılan astarlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
<ol><li>Nematodları toplayın.<ol><li>Kültür B. xylophilus , 3-5 gün boyunca 25 ° C'de Patates Dekstroz Agar (PDA) plakaları üzerindeki Botrytis cinerea'nın miselyası üzerinde gerilir.</li>
		<li>Bellman huni yöntemi14'ü kullanarak nematodları toplayın.<ol><li>Bir huninin altına kelepçelenmiş bir lastik tüp yerleştirin ve huninin ağzına iki kat filtre kağıdı yerleştirin. Mantar kültürlerini huniye aktarın ve mantar paspasını batırmak için su ekleyin. 2 saat bekleyin, ardından nematodları toplayın.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki adımlara göre, toplam RNA ekstraksiyon reaktifi kullanarak nematodlardan toplam RNA'yı çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız)11 .<ol><li>2 mL'lik bir santrifüj tüpüne 500 μL ekstraksiyon reaktifi ve 100 μL manyetik boncuk ekleyin. Nematodların 20 μL'sini aspire edin ve numuneyi 30 s için 9.000 × g'da öğütmek üzere bir öğütücüye aktarın. 5 dakika boyunca inkübe edin ve ardından 12.000 × g ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.</li>
		<li>Süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. 100 μL kloroform ekleyin, tüpü kapatın ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın. 3 dakika boyunca inkübe edin ve ardından 4 ° C'de 12.000 × g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.</li>
		<li>Süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. 250 μL izopropil alkol ve vorteksi kuvvetli bir şekilde ekleyin. 10 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj.</li>
		<li>Süper natantı atın. RNA'yı yıkamak için 500 μL% 75 etanol ekleyin ve ardından numuneyi vorteksleyin. 12.000 × g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüj yapın.</li>
		<li>RNA peletini 5 dakika boyunca hava ile kurutun.</li>
		<li>Peleti 30 μL RNaz içermeyen suda yeniden askıya alın.</li>
		<li>Formülü kullanarak RNA konsantrasyonunu hesaplayın: A260 × seyreltme × 40 = μg RNA / mL. A260/A280 oranını hesaplayın. NOT: ~2 oranı saf olarak kabul edilir.</li>
	</ol></li>
	<li>cDNA şablonunu elde etmek için kaliteli RNA'nın ters transkripsiyonunu gerçekleştirin.<ol><li>B. xylophilus'taki Bx-ppm-1 geninin kısmi kodlama dizisini yükseltmek için ppm-1-F / R (Malzeme Tablosuna bakınız) bir çift spesifik primer tasarlayın ve kullanın (GenBank katılım numarası QTZ96795). </li>
		<li> ppm-1 gen dizilerini, standart bir klonlama protokolü11'i izleyerek T7 promotörünü içeren pGEM-Teasy vektörüne klonlayın.<ol><li>PCR reaksiyonlarını aşağıdaki gibi ayarlayın: 2 μL cDNA, 25 μL 2x Ex Taq Polimeraz Premiks, her astardan 2 μL (10 pmol / l) ve steril damıtılmış su 50 μL'lik son hacme kadar.</li>
			<li>Amplifikasyon prosedürünü aşağıdaki gibi uygulayın: 94 ° C'de 5 dakika; bunu 94 °C'de 30 sn, 55 °C'de 30 s ve 72 °C'de 1 dk'lık 35 döngü izledi; ve 5 dakika boyunca 72 °C'de son bir uzatma adımı.</li>
			<li>Güçlendirilmiş ürünleri sıralama için bir pGEM-T Kolay vektöre klonlayın.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. dsRNA sentezi
<ol><li>Her iki uca T7 promotör bölgeleri eklemek için tasarlanmış primerlerle PCR kullanarak dsRNA sentezi için DNA şablonunu hazırlayın. T7 promotör dizisini astarların 5' ucuna ekleyin.</li>
	<li>PCR şablonu olarak ppm-1 gen fragmanını (894 bp) içeren plazmidi kullanın ve T7 promotörü11'i içeren parçayı kurtarın. Yukarıda açıklanan PCR prosedürünü ve sistemini kullanın.</li>
	<li>DsRNA11'i sentezlemek için bir in vitro transkripsiyon kiti kullanın.<ol><li>Dondurulmuş reaktifleri buz üzerinde çözün.</li>
		<li>Bir santrifüj tüpüne 2 μL 10x reaksiyon tamponu, 2 μL enzim karışımı ve 1 μg DNA ekleyin. Standart bir 4 μL reaksiyon üretmek için nükleaz içermeyen su ekleyin. Daha sonra, dört ribonükleotid çözeltisinin (ATP, CTP, GTP ve UTP) eşit hacimlerini karıştırın ve karışımın 8 μL'sini tüpe ekleyin. İyice karıştırın ve 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>1 μL DNaz ekleyin, iyice karıştırın ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Reaksiyonu durdurun ve RNA'yı çökeltmek için 30 μL nükleaz içermeyen su ve 30 μL LiCl çökeltme çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın. Gece boyunca -20 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>12.000 × g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüj. Süper natantı atın.</li>
		<li>RNA'yı yıkamak için 1 mL% 75 etanol ekleyin. Numuneyi vorteksleyin ve 12.000 × g ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.</li>
		<li>RNA peletini 3 dakika boyunca hava ile kurutun.</li>
		<li>Peleti 30 μL RNaz içermeyen suda yeniden askıya alın.</li>
		<li>Bir spektrofotometre kullanarak dsRNA'nın kalitesini analiz edin. Ölçüm kaidesine dsRNA numunesinin 1 μL'lik pipeti ve dalga boyunu 340 nm olarak ayarlayın. Ürünleri %1.0'lık bir agaroz jeli üzerinde görselleştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sırılsıklam ederek RNAi
<ol><li>Toplam 20 μL hacim ve 0,8 μg / mL'lik bir son RNA konsantrasyonu üretmek için dsRNA ve ddH 2 O ile 4 μL 5x ıslatma tamponunu (% 0,05 jelatin, 5,5 mM KH 2PO 4, 2,1 mM NaCl, 4,7 mM NH4Cl, 3 mM spermidin) karıştırın.</li>
	<li>J2 larvalarını edinin.<ol><li>Nematodları mantar kültürlerinden toplayın ve 6 cm çapında bir cam Petri kabına aktarın. Nematodların serbestçe yüzebilmelerini sağlamak için yemeğe 10 mL su ekleyin. Nematodları 30 dakika boyunca tabakta tutun ve yumurtaların dibe yapışmasını bekleyin.</li>
		<li>Yumurtaları rahatsız etmediğinizden emin olarak suyu ve nematodları dikkatlice çıkarın. Tüm larvalar ve yetişkinler çıkarılana kadar adımları tekrarlayın, sadece yumurtaları tabakta bırakın.</li>
		<li>J2 larvalarını elde etmek için toplanan yumurtaları karanlıkta 25 ° C'de 24 saat boyunca yumurtadan çıkarın. J2 larvalarını toplayın, bir tüpe yerleştirin ve RNAi deneyi15 için ddH2O ile üç kez yıkayın.</li>
		<li>J2 larvalarını dsRNA çözeltisini içeren 2 mL tüpe aktarın ve% 1.0'lık bir nihai konsantrasyon üretmek için resorsinol çözeltisi (infoil içine sarılmış ve suda çözülmüş) ekleyin. Larvaların dsRNA'yı etkili bir şekilde emmesini sağlamak için larvaları 25 ° C'de 24 saat boyunca sallanan bir masada 15 × g'de santrifüjleme ile inkübe edin. </li>
		<li>Aynı miktarda nematodları, dsRNA probu olmadan veya kontrol olarak bir GFP dsRNA probu ile ıslatma tamponuna batırın. GFP genini (gfp, M62653.1) endojen olmayan bir kontrol olarak kullanın ve gen-spesifik primerler T7-GFP-F / R kullanarak gfp'nin dsRNA'sını sentezleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. qPCR algılama
<ol><li>J2 larvalarını, hedef gen girişimi, GFP gen girişimi ve bozulmamış kontrol grubu olanlar da dahil olmak üzere ddH2O ile temizleyin. Yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak her gruptan toplam RNA'ları çıkarın.</li>
	<li>qPCR'yi başlatın.<ol><li>İstenilen yazılımı kullanarak q-ppm-1-F/R astarlarını tasarlayın (bkz.</li>
		<li>qPCR reaksiyonunu 1 μL cDNA, 6 μL floresan premiks, her astarın 0,4 μL'si (10 pmol/l) ve steril damıtılmış su içeren 12 μL'de ayarlayın.</li>
		<li>qPCR'yi aşağıdaki gibi gerçekleştirin: 95 °C'de 2 dakika; bunu 95 °C'de 10 sn, 55 °C'de 30 sn ve 72 °C'de 1 dk'lık 40 döngü izledi.</li>
		<li>RNAi15'ten sonra gen ekspresyon seviyesindeki değişiklikleri değerlendirmek için actb genini (GenBank katılım numarası EU100952) ve tbb-2 genini (GenBank katılım numarası MT769316) veya diğer genleri dahili referans genleri olarak kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Döngü eşiği (Ct) değerine ve çözünme eğrisine göre, hedef genin göreceli ekspresyon seviyesini tahmin etmek ve girişim verimliliğini doğrulamak için 2-ΔΔCt yöntemini kullanın.<ol><li>ΔCt değerini elde etmek için her numunenin iç referans geninin Ct değerini hedef genin Ct değerinden çıkarın. Ardından, ΔΔCt değerini elde etmek için girişim grubunun ΔCt değerini kontrol grubunun ΔCt değerinden çıkarın. NOT: 0'dan büyük bir ΔΔCt değeri, girişimin etkili olduğunu gösterir.</li>
	</ol></li>
</ol>5. RNAi'yi takip eden nematod yetişkinlerinin vücut uzunluğunu değerlendirin
<ol><li>RNAi'den sonra, J2 larvalarını yetişkinliğe kadar PDA plakalarındaki B. cinerea çimlerinde 25 ° C15'te 60 saat boyunca kültürleyin.</li>
	<li>Bellman huni yöntemini kullanarak yetişkinleri toplayın (bkz. adım 1.1.2.1)14.</li>
	<li>Yetişkin nematodların görüntülerini mikroskop altında elde edin ve vücut uzunluklarını ölçmek için ImageJ yazılımını (veya başka bir ölçüm yazılımını) kullanın.<ol><li>Analiz Et'i seçerek ImageJ'yi kullanarak uzunluğu ölçün | Ölçeği ayarlayın. Mesafe biliniyorsa, çizilen düz çizginin uzunluk değerini girin. Uzunluk birimini girin.</li>
		<li>Genel onay kutusunu işaretleyin (tüm resimler için bu standardı kullanın) ve ölçülecek görüntü üzerinde düz bir çizgiyle ölçülecek uzunluğu seçmek için Tamam'ı tıklatın.</li>
		<li>Sonuçları görüntülemek ve sonuçlar penceresine kaydetmek için Ctrl+M (ölçüm) komutunu kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>İstatistiksel analiz için 50 erkek ve 50 dişi nematodun ölçümlerini alın12.</li>
	<li>Her numune için ortalama ve standart sapmayı hesaplayarak verileri analiz edin. Öğrencinin t-testini kullanarak farklı gruplardan örneklerin araçlarını karşılaştırın.</li>
</ol>

<ol><li>Nicol, J. M., et al. Current nematode threats to world agriculture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicol%2C+JM+%22Genomics+and+Molecular+Genetics+of+Plant-Nematode+Interactions%22">Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions</a>. Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C. , Springer. Dordrecht. 21-43 (2011).</li>
<li>Jones, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+plant-parasitic+nematodes+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).</li>
<li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+insights+into+the+origin+of+parasitism+in+the+emerging+plant+pathogen+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219(2011).</li>
<li>Megen, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phylogenetic+tree+of+nematodes+based+on+about+1200+full-length+small+subunit+ribosomal+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences.</a> Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).</li>
<li>Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+technology+extends+its+reach%3A+Engineering+plant+resistance+against+harmful+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes.</a> African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+novel+traits+in+plants+through+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Engineering novel traits in plants through RNA interference.</a> Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).</li>
<li>Marmonier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+acquisition+of+specific+small+interfering+RNAs+inhibits+the+expression+of+some+target+genes+in+the+plant+ectoparasite+Xiphinema+index%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266(2019).</li>
<li>Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attempt+to+silence+genes+of+the+RNAi+pathways+of+the+root-knot+nematode%2C+Meloidogyne+incognita+results+in+diverse+responses+including+increase+and+no+change+in+expression+of+some+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 328(2020).</li>
<li>Zhou, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+akt-1+in+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Forest+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Forest Pathology. 51 (1), 12647(2021).</li>
<li>Zhou, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mab-3+in+spermatogenesis+and+ontogenesis+of+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).</li>
<li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bxy-fuca+encoding+%CE%B1-L-fucosidase+plays+crucial+roles+in+development+and+reproduction+of+the+pathogenic+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Bxy-fuca encoding α-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).</li>
<li>Wang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+daf-8+in+the+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forestry+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Journal of Forestry Research. , (2021).</li>
<li>Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+methodology+of+nematode+extraction+from+field+samples%3A+Baermann+funnel+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nematology%22%5BJournal%5D)">On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications.</a> Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).</li>
<li>Zhu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+and+quantification+of+mating+behavior+in+the+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842(2016).</li>
<li>Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+reliable+reference+genes+for+RT-qPCR+analysis+of+Bursaphelenchus+mucronatus+gene+expression+from+different+habitats+and+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages.</a> Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA-mediated+interference+of+dumpy+genes+in+Bursaphelenchus+xylophilus+by+feeding+on+filamentous+fungal+transformants%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants.</a> International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).</li>
<li>Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+cellulose+gene+of+the+pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%2C+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%3A+GMR%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference.</a> Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).</li>
<li>Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cellulase+gene+knock+down+by+dsRNA+interference+on+the+development+and+reproduction+of+the+pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).</li>
<li>Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+L-like+cysteine+proteinase+genes+are+associated+with+the+development+and+pathogenicity+of+pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215(2019).</li>
<li>Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+in+C.+elegans%3A+Soaking+in+the+genome+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence.</a> Science. 282 (5388), 430-431 (1998).</li>
<li>Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+double-stranded+RNA+by+pre+parasitic+juvenile+cyst+nematodes+leads+to+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).</li>
<li>Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+of+dual+oxidase+in+the+plant+nematode+Meloidogyne+incognita%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).</li>
<li>Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+RNA+interference+to+root-knot+nematode+genes+encoding+esophageal+gland+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).</li>
<li>Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+pathogenicity+proteins+of+the+potato+cyst+nematode+Globodera+rostochiensis+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).</li>
<li>Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+clone+and+its+RNAi+interference+effect+analysis+of+mapk+gene+in+Bursaphelenchus+xylophilus+%28+in+Chinese%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Phytopathologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese).</a> Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).</li>
<li>Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Bxpel1+gene+silencing+by+dsRNA+interference+on+the+development+and+pathogenicity+of+the+pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125(2016).</li>
<li>Dulovic, A., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+knockdown+of+daf-12+in+the+model+parasitic+nematode+Strongyloides+ratti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti.</a> PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705(2019).</li>
<li>Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+of+gene+editing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Research%22%5BJournal%5D)">Research progress of gene editing technology.</a> Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).</li>
<li>Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-generated+double+stranded+RNA+induces+RNAi+in+plant-parasitic+nematodes+and+protects+the+host+from+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).</li>
<li>Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+insect-resistant+plants%3A+RNAi-mediated+crop+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection.</a> Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması ilan edilmedi.

B. xylophilus'un yaşam öyküsü ve paraziter ortamı diğer nematodlarınkinden farklı olmasına rağmen, bu bitki patojeninin moleküler patogenezi hakkında sınırlı araştırma yapılmıştır. C. elegans ve diğer nematodlarda CRISPR / Cas9 genom düzenleme teknolojisinin uygulanmasında büyük ilerleme kaydedilmesine rağmen, bugüne kadar sadece B. xylophilus'a uygulanan RNAi teknolojisiyayınlanmıştır 17. RNAi, nematodların gen fonksiyonunu incelemek için mevcut en güçlü araçlardan bir...

<a href="https://app.jove.com/t/6669">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/63645-v">10.3791/63645-v</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63645">Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus</a>. The Abstract and Protocol section was updated.

Erratum: Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Bitki-paraziter nematodlar (PPN'ler) gıda güvenliği ve orman ekosistemleri için devam eden bir tehdittir. Her yıl tahmini 100 milyar ABD doları ekonomik kayba neden olurlar1, bunların en sorunlu olanları öncelikle kök-düğüm nematodları, kist nematodları ve çam ağacı nematodlarıdır. Çam ağacı nematodu Bursaphelenchus xylophilus, çam solgunluğu hastalığının nedensel patojeni olan göçmen, endoparaziter bir nematoddur2. Dünya çapında çam ormanlarına büyük zarar vermiştir3. Van Megen ve ark.4'ün terminolojisini kullanarak, B. xylophilus Parasitaphelenchidae'nin bir üyesidir ve klad 10'a aittir, oysa diğer büyük bitki parazitlerinin çoğu klad 12'ye aittir.
Bağımsız ve yakın zamanda evrimleşmiş bir bitki paraziti olan B. xylophilus , karşılaştırmalı çalışmalar için çekici bir modeldir. Bugüne kadar, zorunlu, sedanter endoparazitler olan ve en yoğun çalışılan nematodlardan bazıları olan klad 12'ye ait kök-düğüm nematodları ve kist nematodları hakkında önemli araştırmalar yapılmıştır. Bununla birlikte, bu önemli alanda daha fazla araştırma yapmak büyük bir zorlukla birlikte gelir: parazitizm genlerinin işlevi bir araştırma darboğazıdır. Fonksiyonel çalışmalar genellikle ektopik ekspresyon ve nakavt / çıkış deneylerini içerir, ancak nematod için etkili genetik dönüşüm protokollerine dayanır. Sonuç olarak, PPN'lerdeki ters genetik neredeyse sadece RNAi tarafından gen susturulmasına dayanır.
Ökaryotik hücrelerde yaygın olarak bulunan bir mekanizma olan RNAi, çift sarmallı RNA (dsRNA)5 ekleyerek gen ekspresyonunu susturur. Bugüne kadar, dsRNA tarafından indüklenen posttranskripsiyonel gen susturma mekanizması, çalışılan tüm ökaryotlarda bulunmuştur ve fonksiyonel genomik araştırmaların ve diğer uygulamaların bir aracı olarak RNAi teknolojisi, birçok organizmada hızla gelişmiştir. 1998 yılında Caenorhabditis elegans'ta RNAi makinesinin keşfinden bu yana6, RNAi teknikleri nematodların gen fonksiyonunu tanımlamak için etkili yöntemler haline gelmiştir ve patojenik nematodları etkili bir şekilde kontrol etmenin yeni bir yolu olarak önerilmiştir7.
RNAi teknik olarak gençleri dsRNA'ya batırmak yeterli olabilir; Bununla birlikte, bu yaklaşımın etkinliği ve tekrarlanabilirliği, nematod türleri ve hedef gen8 ile büyük ölçüde değişmektedir. Kök-düğüm nematodunun RNAi yollarında yer alan 20 genin susturulması, Meloidogyne incognita, tetikleyici olarak uzun dsRNA'lar kullanılarak araştırıldı ve bazı genlerin ekspresyonunda bir artış ve hiçbir değişiklik olmaması da dahil olmak üzere çeşitli tepkilerle sonuçlandı9. Bu sonuçlar, hedef genlerin RNAi nakavtına farklı tepki verebileceğini ve RNAi yoluyla nematod kontrolü için hedef olarak uygunluklarının kapsamlı bir değerlendirmesini gerektirdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, şu anda B. xylophilus'un gelişim ve üreme biyolojisi üzerine araştırma yetersizliği vardır.
Önceki çalışmanın devamı olarak10,11,12,13, burada dsRNA sentezi, sentetik nörostimülan ıslatma ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) tespiti dahil olmak üzere B. xylophilus'un ppm-1 geninin işlevini incelemek için RNAi'nin uygulanması için bir protokol açıklıyoruz. Bu deneysel yaklaşımdan elde edilen bilgiler muhtemelen temel biyolojik sistemlerin anlaşılmasına ve çam solgunluğu hastalığının önlenmesine önemli ölçüde katkıda bulunacaktır.

<table><tbody><tr><td>Baermann hunisi</td><td>N/a</td><td>N/a</td><td>nematodları izole etmek için</td></tr><tr><td>Beacon Designer 7.9</td><td>Şanghay Kangyusheng Bilgi Teknolojileri Şirketi.</td><td>N/a</td><td>qPCR primerleri tasarlamak için</td></tr><tr><td>Botrytis cinerea</td><td>N/a</td><td>N/a</td><td>nematodlar için besin olarak</td></tr><tr><td>Bursaphelenchus xylophilus</td><td>N/a</td><td>N/a</td><td>numarası NXY61 olup, Çin'in Zhejiang eyaletindeki Ningbo'daki hastalıklı Pinus massoniana'dan çıkarılmıştır.</td></tr><tr><td>Sabit sıcaklık kuluçka makinesi</td><td>Şanghay Jing Hong Laboratuvar Enstrümanlar Şirketi.</td><td>H1703544</td><td>Kultur nematodlarına</td></tr><tr><td>Elektroforez cihazı</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1704466</td><td>elektroforetik analiz elde etmek için</td></tr><tr><td>Etanol, %75</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Şirketi.</td><td>80176961</td><td>RNA çıkarmak için</td></tr><tr><td>Ex Taq Polimeraz Premix</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR030A</td><td>PCR için</td></tr><tr><td>Ex Taq Polimeraz Premix</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR390A</td><td>PCR için</td></tr><tr><td>Jel görüntüleyici</td><td>LongGene Bilimsel Aletler Şirketi.</td><td>LG2020</td><td>nükleik asit bantlarını görünür kılmak için</td></tr><tr><td>GraphPad Prizması 8</td><td>GraphPad Prizması</td><td>N/a</td><td>verileri analiz etmek ve figürler yapmak</td></tr><tr><td>Yüksek Hızlı Santrifüj</td><td>Hangzhou Allsheng Enstrümanlar Şirketi.</td><td>AS0813000</td><td>Santrifüj</td></tr><tr><td>Yüksek akışlı doku öğütücüsü</td><td>Bertin</td><td></td><td>RNA çıkarmak için</td></tr><tr><td>ImageJ yazılımı</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri</td><td>N/a</td><td>vücut uzunluklarını ölçmek için</td></tr><tr><td>İzopropil alkol</td><td>Şanghay Aladdin Biyokimyasal Teknoloji Şirketi.</td><td>L1909022</td><td>RNA çıkarmak için</td></tr><tr><td>Leica DM4B mikroskobu</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td>nematodları gözlemlemek</td></tr><tr><td>manyetik boncuklar</td><td>Aoran bilim teknolojisi şirketi.</td><td>150010C</td><td>RNA çıkarmak için</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Yüksek Verimli Transkripsiyon Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>AM1333</td><td>in vitro dsRNA'yı sentezlemek için</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-2000 spektrofotometresi</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>NanoDrop 2000/2000C</td><td>dsRNA'nın kalitesini analiz etmek</td></tr><tr><td>PCR Amplifikatörü</td><td>Bio-Rad Life Tıbbi Ürünler Şirketi.</td><td>1851148</td><td>nüklein asit dizisini güçlendirmek için</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>N/a</td><td>N/a</td><td>Kultur nematodlarına</td></tr><tr><td>pGEM-T Kolay vektör</td><td>Promega Şirketi</td><td>A1360</td><td>klonlama için</td></tr><tr><td>Patates Dekstroz Agar (Orta)</td><td>N/a</td><td>N/a</td><td>to cultur Botrytis cinerea</td></tr><tr><td>Prime Script RT reaktif kiti gDNA Silgili</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR047B</td><td>sentetik cDNA'ya</td></tr><tr><td>Primer Premier 5.0</td><td>PREMIER Biosoft</td><td>N/a</td><td>PCR primerleri tasarlamak için</td></tr><tr><td>primerler:ppm-1-F/R</td><td>Tsingke Biyoteknoloji Şirketi.</td><td>N/a</td><td>F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3</td></tr><tr><td>q-ppm-1-F/R</td><td>Tsingke Biyoteknoloji Şirketi.</td><td>N/a</td><td>F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'</td></tr><tr><td>Gerçek zamanlı termal döngü cihazı&nbsp; qTOWER 2.2</td><td>Analytique Jena Instruments (Pekin) Şirketi.</td><td></td><td>qPCR için</td></tr><tr><td>sallanma masası</td><td>Shanghai Zhicheng analitik alet üretim şirketi.</td><td></td><td>nematodları emdirmek için</td></tr><tr><td>Stereoskopik mikroskop</td><td>Chongqing Optec Enstrüman Şirketi.</td><td>1814120</td><td>nematodları gözlemlemek</td></tr><tr><td>T7-GFP-F/R</td><td>Tsingke Biyoteknoloji Şirketi.</td><td>N/a</td><td>F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; T7 organizatörü</td><td>Tsingke Biyoteknoloji Şirketi.</td><td>N/a</td><td>TAATACGACTCACTATAGGG</td></tr><tr><td>Takara MiniBEST Agarose Jel DNA Çıkarma Kiti</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>9762</td><td>DNA'yı geri kazanmak için</td></tr><tr><td>TaKaRa TB Yeşil Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR820A</td><td>qPCR için</td></tr><tr><td>trikloroetan</td><td>Şanghay LingFeng Kimyasal Reaktif Şirketi.</td><td></td><td>RNA çıkarmak için</td></tr><tr><td>TRIzol Reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>15596026</td><td>RNA çıkarmak için toplam RNA ekstraksiyon reaktifi</td></tr></tbody></table>

rna girişiminin Çam ağacı nematodunda uygulanması, bursaphelenchus xylophilus

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Çam ağacı nematodu Bursaphelenchus xylophilus, dünya çapında en yıkıcı istilacı türlerden biridir ve çam ağaçlarının solmasına ve nihayetinde ölümüne neden olur. Ekonomik ve çevresel önemlerinin tanınmasına rağmen, geleneksel ileri genetik ve transgenik yöntemler kullanarak bitki-parazitik nematodların (PPN'ler) ayrıntılı gen fonksiyonlarını incelemek şimdiye kadar imkansız olmuştur. Bununla birlikte, ters genetik bir teknoloji olarak, RNA girişimi (RNAi), B. xylophilus da dahil olmak üzere nematodların fonksiyonel genlerinin incelenmesini kolaylaştırır.
Bu makalede, diğer patojenik nematodların gelişiminde ve çoğaltılmasında önemli rol oynadığı bildirilen B. xylophilus'taki ppm-1 geninin RNAi için yeni bir protokol özetlenmektedir. RNAi için, T7 promotörü polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile hedef fragmanın 5'-terminaline bağlandı ve çift sarmallı RNA (dsRNA) in vitro transkripsiyon ile sentezlendi. Daha sonra, dsRNA dağıtımı, nematodların sentetik nörostimülanlarla karıştırılmış bir dsRNA çözeltisine batırılmasıyla gerçekleştirildi. B. xylophilus'un senkronize yavruları (yaklaşık 20.000 kişi) yıkandı ve 25 ° C'de karanlıkta 24 saat boyunca ıslatma tamponunda dsRNA'ya (0.8 μg / mL) batırıldı.
Aynı miktarda nematod, kontrol olarak dsRNA olmadan ıslatıcı bir tampona yerleştirildi. Bu arada, aynı miktarda nematod, kontrol olarak yeşil floresan protein (gfp) geni dsRNA ile ıslatma tamponuna yerleştirildi. Islattıktan sonra, hedef transkriptlerin ekspresyon seviyesi gerçek zamanlı kantitatif PCR kullanılarak belirlendi. RNAi'nin etkileri daha sonra fenotiplerin mikroskobik gözlemi ve yetişkinler arasındaki vücut büyüklüğünün karşılaştırılması kullanılarak doğrulandı. Mevcut protokol, genetik mühendisliği yoluyla kontrol stratejileri geliştirmeye yönelik B. xylophilus ve diğer parazitik nematodların genlerinin işlevlerini daha iyi anlamak için araştırmaların ilerlemesine yardımcı olabilir.

RNAi sonrası B. xylophilus'un ppm-1 ekspresyonunun analizi GFP dsRNA ile ıslatılmış ve hedef gen dsRNA ile ıslatılmış olan B. xylophilus'un ppm-1 geninin göreceli ekspresyon seviyesi sırasıyla 0.92 ve 0.52 idi (ddH2O ile tedavi edilen kontrol grubunun ppm-1 gen ekspresyon seviyesi 1 olarak ayarlandı) (Şekil 1). Bu nedenle, eksojen dsRNA'nın B. x...

Burada, gen fonksiyonlarının incelenmesini kolaylaştırmak için Bursaphelenchus xylophilus'ta RNA girişiminin ayrıntılı bir ıslatma yöntemini tanıtıyoruz.

RNA Girişiminin Çam Ağacı Nematodunda Uygulanması, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

RNAi, nematodlardaki genlerin işlevini tanımlamak için etkili bir yöntem haline gelmiştir ve patojenik nematodları etkili bir şekilde kontrol etmenin yeni bir yolu olarak önerilmektedir. RNAi, nematodları dsRNA'ya batırıyor, prosedür için yeterli olabilir. Başlamak için, nematodları Baermann huni yöntemiyle toplayın.Bunun için, bir huninin altına kelepçelenmiş bir lastik tüp yerleştirin ve huninin ağzına iki kat filtre kağıdı yerleştirin. Botrytis cinerea mantar kültürlerini huniye aktarın ve mantar paspasını batırmak için su ekleyin. Nematodlar toplandığında, iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne 500 mikrolitre ekstraksiyon reaktifi ve 100 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin.Nematodların 20 mikrolitresini aspire edin ve numuneleri 30 saniye boyunca 9.000 x g'de öğütün. Beş dakika boyunca kuluçkaya yatın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı taze bir santrifüj tüpüne aktarın.100 mikrolitre kloroform ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Üç dakika boyunca kuluçkaya yatın ve daha sonra dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın. Yine, süpernatantı taze bir santrifüj tüpüne aktarın.250 mikrolitre izopropil alkol ve vorteksi kuvvetlice ekleyin. 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj ve vorteks. Süpernatantı atın ve RNA'yı yıkamak için 500 mikrolitre% 75 etanol ekleyin.Vorteks numunesi ardından dört santigrat derecede beş dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüjleme ile takip edin. RNA peletini beş dakika boyunca hava ile kurutun ve 30 mikrolitre RNaz içermeyen suda tekrar askıya alın. Bu formülü kullanarak RNA konsantrasyonunu hesaplayın ve A260 - A280 oranını hesaplayın.Daha sonra, BX ppm-1 geninin kısmi kodlama dizisini B.xylophilus'tan yükseltmek için bir çift primer kullanın. Daha sonra ppm-1 bir gen dizilerini T7 promotörünü içeren bir pGEM-T Easy vektörüne klonlayın. 894 baz çifti uzun ppm-1 gen fragmanını, klonlanmış plazmidi pcr şablonu olarak kullanarak kurtarın.Ardından, dsRNA'yı sentezlemek için bir in vitro transkripsiyon kiti kullanın. Bir spektrofotometre kullanarak dsRNA'nın kalitesini analiz edin ve% 1'lik bir agaroz jeli üzerindeki ürünleri görselleştirin. Dört mikrolitre 5X ıslatma tamponu ekleyin ve mililitre başına 0.8 mikrogramlık son bir RNA konsantrasyonu elde etmek için çift damıtılmış su ile 20 mikrolitreye kadar hacmi oluşturun.Daha sonra nematodları 30 dakika boyunca tabağa yerleştirin ve yumurtaların dibe yapışmasını bekleyin. Sadece yumurtalar tabakta kalana kadar yumurtaları rahatsız etmeden suyu ve nematodları dikkatlice çıkarın. J2 larvalarını elde etmek için toplanan yumurtaları karanlıkta 25 santigrat derecede 24 saat boyunca yumurtadan çıkarın.Larvaları bir tüpte toplayın ve üç kez çift damıtılmış suyla yıkayın. Daha sonra larvaları dsRNA çözeltisini içeren tüpe aktarın. Buna,% 1'lik bir çözelti elde etmek için resorsinol çözeltisi ekleyin.DsRNA'nın larvalara yeterli emilimini sağlamak için larvaları sallanan bir masaya yerleştirin. Kontroller için, aynı miktarda nematodları dsRNA probu olmadan veya bir GFP dsRNA probu ile ıslatma tamponuna batırın. Gen ekspresyon seviyesindeki değişiklikleri değerlendirmek için actB ve tbb-2 genlerini dahili referanslar olarak kullanarak bir qPCR gerçekleştirin.Çözünme eğrisinden ve Ct değerinden göreceli gen ekspresyon düzeyini tahmin etmek için delta delta Ct yöntemini kullanın. RNAi'den sonra, J2 larvalarını yetişkinliğe kadar Botrytis cinerea çimlerinde PDA plakaları üzerinde kültürleyin. Birinci bölümde gösterildiği gibi Baermann huni yöntemini kullanarak yetişkinleri toplayın.Yetişkin nematodların görüntülerini mikroskop altında elde edin ve 50 erkek ve 50 dişi nematodun vücut uzunluğunu ölçmek için ImageJ yazılımını kullanın. Her numune için ortalama ve standart sapmayı hesaplayarak verileri analiz edin. Farklı gruplardan örneklerin araçlarını karşılaştırmak için Student's t testini uygulayın.RNAi'den sonra göreceli gen ekspresyon analizi, ppm-1 dsRNA'nın B.Xylophilus'un ppm-1 bir geninin ekspresyonunu etkili bir şekilde inhibe edebileceğini göstermiştir. Oysa eksojen GFP dsRNA'nın ppm-1 ekspresyonu üzerinde hiçbir etkisi yoktu. RNAi'den sonra, yetişkinlerin büyüklüğü, küçük vücut büyüklüğü mutant fenotipine neden olan cinsel olgunluğa ulaşmasına rağmen belirgin şekilde azalmıştır.Mutant dişilerin ve erkeklerin ortalama vücut uzunluğu, kontrol grubu için 971 ve 912 mikrometreye kıyasla 544 ve 526 mikrometre idi En önemli şey, nematodları çift iplikli RNA çözeltisine aktarmak ve nematodları beslenmeye teşvik etmek için başka bir reaktif eklemektir. Bu yöntem büyük ölçekli gen taraması için uygundur ve hücre araştırmalarında yaygın olarak kullanılır. B.Xylophilus'un gen fonksiyonunun bu yöntemle incelenmesi, B.Xylophilus'un biyolojik kontrolü için yol gösterici bir değere sahiptir.

application-rna-interference-pinewood-nematode-bursaphelenchus

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz hedef genler ve skoru vücut büyüklüğüne fenotipi yıkmak için RNAi besleme tekniği nasıl kullanılacağını...

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı<em&gt; C. elegans</em

RNA enterferans (RNAi) tabanlı gen demonte teknikleri Tribolium araştırma özünde vardır. Burada, biz Tribolium castaneum'ların bizim larva RNAi tekniğinin bir bakış sağlar. Larva RNAi araştırmacılar farklı bağlamlarda gen fonksiyonlarını incelemek için izin, kayıp fonksiyon-fenotiplerine hızlı erişim sağlayan basit, ama güçlü bir tekniktir.

Kırmızı Un Beetle Larva RNA Girişim, Tribolium castaneum

RNA girişimi (RNAi), gen fonksiyonunu ortaya çıkarmak için son derece değerli bir araçtır. Bununla birlikte, yetişkinlik öncesi aşamalarda RNAi kullanarak genleri hedefleme yeteneği, başlıca insan sıtma vektörü Anopheles gambiae'de sınırlıdır. Pupa gelişimi sırasında doğrudan enjeksiyon yoluyla gen fonksiyonunu azaltmak için bir RNAi protokolü tanımladık.

içine RNAi Tetik Teslimat<em&gt; Anofel gambiae</em&gt; Pupa

Çam ağacı nematodu Bursaphelenchus xylophilus'un çiftleşme davranışını araştırmak için bir protokol sunulmuştur. B. xylophilus'un davranışsal özellikleri çiftleşme sürecinde açıklanmaktadır.

Pinewood Nematodu gözlem ve Çiftleşme Davranış miktarının belirlenmesi, Orijinli olanlar

Burada, laboratuarda bir ara-germ böceği, Dermestes maculatus (D. maculatus) yetiştirme için protokolleri sunuyoruz. Biz de bu türün gen fonksiyonunu incelemek için embriyonik fenotipleri analiz etmek için embriyonik ve ebeveyn RNAi için protokolleri ve yöntemleri paylaşır.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı, Dermestes maculatus

Bu makalede damar doku bitkiler için RNA müdahale (RNAi) böcekler besleme phloem sap ile çift iplikçikli RNA (dsRNA) oral teslimat için geliştirilen roman tekniklerini gösterir.

Phloem ve Hemipteran böcekler bitki su besleme RNA müdahale ikna etmek için çift iplikçikli RNA Oral teslim yöntemleri

Entomopatojenik nematodlar bakterilerle simbiyoz içinde yaşarlar ve birlikte doğuştan gelen bağışıklık sistemlerini zayıflatarak böcekleri başarılı bir şekilde enfekte ederler. Nematod enfeksiyonunun genetik temeli üzerine araştırmaları teşvik etmek için, entomopatojenik nematodları korumak ve genetik olarak manipüle etmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Entomopatojenik Nematodların Kültürlenmesi ve Genetik Olarak Manipüle Edilmesi

RNA girişiminin (RNAi) manipülasyonu, Trichogramma yaban arıları gibi küçücük boyuta sahip birçok parazitoid türünde zorlu bir zorluk teşkil eder. Bu çalışma, Trichogramma denrolimi'de etkili bir RNAi yöntemini tanımlamıştır. Mevcut metodoloji, Trichogramma yaban arılarında gen regülasyonunu araştırmak için sağlam bir model sunmaktadır.

Yumurta Parazitoidinde RNA Girişimi, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Protokol, Pinus pinaster'ın in vivo ve in vitro çam ağacı nematod enfeksiyonunu ve bunların Gaz Kromatografisi (GC) ve Kütle Spektrometresine (GC-MS) bağlı GC yoluyla uçucu analizini açıklar.

İn Vivo ve İn Vitro Çamların Çam Ağacı Nematodu Bursaphelenchus xylophilus ile Enfeksiyonu ve İndüklenen Uçucuların İzolasyonu

Burada sunulan, ipekböceği Bombyx mori larvalarında yutma yoluyla gen susturmayı indüklemek için kitosan/dsRNA nanopartikül dağıtımı için bir protokoldür.

İpekböceği Bombyx mori'de Chitosan/dsRNA Nanopartikül Dağıtımı ile Larva RNA Girişimi

Öğrenin, Bursaphelenchus xylophilus nematodunda RNA girişimi için ıslatma yöntemini. Bu teknik, gen fonksiyonu çalışmaları ve patojen nematod biyolojik kontrol stratejileri için temel oluşturur.

RNA Girişiminin Çam Ağacı Nematodunda Uygulanması, Bursaphelenchus xylophilus

Daha fazla video keşfet