Mitokondriyal Geçirgenlik Geçiş Gözünün Koenzim Q Fazlalığı Ortamında Açık Olasılığının Değerlendirilmesi
1 Haziran 2022
Bu yöntem, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin düşük iletkenlikli proton sızıntısına katkısından, vahşi tip kontrolüne kıyasla artmış kardiyomiyosit mitokondriyal koenzim Q içeriğine sahip yenidoğan kırılgan X sendromlu farelerde gözenek açılması için voltaj eşiğini belirlemek için kullanır.
Bu protokol, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin düşük iletkenlik açıklığını araştırmak için yeni bir yol sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, mitokondriyal membran potansiyelinin bir fonksiyonu olarak gözeneklerin açık olasılığını ölçmenin kolay bir yolunu sağlamasıdır. Bu teknik, herhangi bir organ sisteminden ve türünden izole edilen mitokondrilere kolayca uygulanabilir.
Elektrot diskinin kubbesinin üzerine %50 damla potasyum klorür elektrolit çözeltisi yerleştirerek oksijen elektrodunun kalibrasyonu ile başlayın. Elektrolit damlasının üzerine biraz daha büyük bir politetrafloroetilen membran parçası ile kaplanmış iki santimetrekarelik sigara kağıdı ara parçasından küçük bir parça yerleştirin. Ardından, küçük elektrot diski O-ring'i elektrotun kubbesi üzerine itmek için aplikatör aletini kullanın.
Daha sonra, rezervuarı elektrolit çözeltisi ile iyice doldurun. Daha büyük O-ring'i elektrot diskinin etrafındaki girintiye iyice yerleştirin. Ardından diski elektrot odasına takın ve kontrol ünitesine bağlayın.
Reaksiyon odasına iki mililitre havaya doymuş deiyonize su ve politetrafloroetilen kaplı mıknatıs ekleyin. İşiniz bittiğinde, odayı kontrol ünitesinin arkasına bağlayın. Sıcaklığı 37 santigrat dereceye ve karıştırma hızını 100'e ayarlayın.
Kalibrasyondan önce sistem sıcaklığının 10 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Doğru sıcaklığı, karıştırma hızını ve basıncı sağladıktan sonra, Kalibrasyon sekmesi altında, sıvı faz kalibrasyonu gerçekleştirmek için Sıvı Faz Kalibrasyonu seçeneğini belirleyin. Ardından Tamam'a basın ve sinyalin platoya gelmesini bekleyin.
Yaylaya ulaşıldığında Tamam'a basın. Daha sonra odaya sıfır oksijen sağlamak için yaklaşık 20 miligram sodyum ditionit ekleyin. Yine, OK tuşuna basın ve kalibrasyonu kabul etmek için Kaydet düğmesine tıklamadan önce sinyalin platoya gelmesini bekleyin. Tetrafenilfosfonyum veya TPP seçici elektrot tertibatını hazırlamak için, TPP seçici elektrot ucunu bir şırınga ve esnek bir iğne kullanarak 10 milimolar TPP çözeltisi ile doldurun.
Elektrot ucunu doldururken hava kabarcıklarından kaçının. Dahili referans elektrodunu TPP ucuna yerleştirmek için elektrot tutucu kapağını gevşetin. İşiniz bittiğinde, referans elektrodu ve elektrot tutucu dahil olmak üzere TPP seçici elektrot aparatını monte edin.
Ucu sabitlemek için kapağı sıkın. Ardından kabloyu kontrol kutusunun yardımcı portuna ve TPP elektrot tutucusuna bağlayın. TPP seçici ve referans elektrotlarını, iyon seçici elektrotlar için uyarlanmış piston tertibatına yerleştirin.
Referans elektrodunu kontrol kutusunun referans portuna bağlayın. Daha sonra, reaksiyon odasını hazırlamak için, hava kabarcıkları oluşturmadan reaksiyon odasına bir mililitre reaksiyon karışımı ekleyin. TPP seçici ve referans elektrotları yerindeyken, uyarlanmış piston tertibatını kullanarak odayı kapatın.
Oda kapatıldıktan sonra, plastik borularla modifiye edilmiş ayrı mikro şırıngalar kullanarak doğrudan reaksiyon odasına ek reaktifler sürün. Kurulum hazır olduğunda, kayda başlamak için Git ' i seçin. Kararlı bir voltaj sinyali elde edildikten sonra, üç mikromolar'lık bir nihai konsantrasyon elde etmek için 0.1 milimolar TPP çözeltisinin bir mikromolar artışını ekleyerek TPP seçici elektrodu kalibre edin.
Her eklemede TPP voltaj sinyalindeki logaritmik düşüşü gözlemleyin. Oksijen ve TPP izlerini stabilize ettikten sonra, piston tertibatındaki reaktif ekleme portu aracılığıyla reaksiyon odasına mililitre başına 0.1 miligramlık son konsantrasyona 100 mikrogram taze hazırlanmış kardiyomiyosit mitokondri ekleyin. Mitokondri enerjilendirildikçe ve oksijen tüketirken odadaki oksijen seviyelerindeki düşüşü gözlemleyin.
Ayrıca, mitokondri bir membran potansiyeli ürettiği ve çözeltiden TPP'yi aldığı için TPP voltaj sinyalindeki ani artışa bakın. Daha sonra Devlet 4 solunumunu indüklemek için mililitre oligomisin başına 2.5 mikrogram ekleyin. Mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin veya mPTP'nin açık olasılığını değerlendirmek için, sızıntı solunumu sırasında zaman içinde membran potansiyelindeki düşüşü gözlemleyin.
İstenilen membran potansiyeline ulaşıldıktan sonra, mPTP'nin bu spesifik membran potansiyelindeki açık olasılığını değerlendirmek için reaksiyon odasına bir mPTP inhibitörü olarak bir mikromolar siklosporin A ekleyin. Daha sonra siklosporin A'nın siklosporin A ilavesinden önce ve sonra oksijen tüketimi ve membran potansiyeli üzerindeki etkisini ölçün. Eşzamanlı oksijen tüketimi ve membran potansiyelinin temsili eğrilerinde, iki mikromolar TPP kalibrasyon seviyesine göre yüksek membran potansiyeli sıfır, orta beş ve düşük 10 milivolt olarak ayarlanmıştır.
Sıfır milivolttaki mitokondri% 100 mPTP kapalı olasılık sergiledi ve 10 milivoltta% 100 açık olasılık sergiledi. Oligomisin ilavesinden sonra, oksijen tüketiminde önemli bir fark gözlenmemiştir, bu da adenozin trifosfatın veya ATP sentazın Devlet 2 solunumuna minimum düzeyde katkıda bulunduğunu düşündürmektedir. Ayrıca, siklosporin A ilavesinden önceki ve sonraki oksijen tüketim hızı ve membran potansiyeli karşılaştırılmıştır.
Oksijen tüketim hızındaki bir azalma ve membran potansiyelinin stabilizasyonundaki bir artış, açık bir mPTP'nin kapandığını gösterdi. mPTP kapatıldığında, oksijen tüketim oranında bir azalma olmadı ve membran potansiyeli düşmeye devam etti. Sonuçlar, FVB kontrolünde ve Fmr1 nakavt kardiyak mitokondrisinde yüksek ve düşük membran potansiyellerinde benzer kapalı ve açık mPTP olasılıklarını göstermiştir.
Ara membran potansiyelinde, Fmr1 nakavt kardiyak mitokondri, FVB kontrollerine kıyasla kapalı mPTP olasılığının arttığını göstermiştir. Odaya hava kabarcıkları sokulmamalıdır, çünkü bu dengesiz oksijen tüketimi okumalarına yol açacak ve yorumlamayı zorlaştıracaktır. Bu prosedürü takiben, kalsiyum yükleme kapasitesi ölçülebilir.
Bu yöntem, gözeneklerin yüksek iletkenlik açıklığını değerlendirir ve tekniğimizin sonuçlarını tamamlar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, neonatal kırılgan X sendromlu farelerde mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneği (mPTP) açıklığının düşük iletkenliğini araştırmakta, gözenek açılması için voltaj eşiğini vurgulamaktadır. Bulgular, model organizmalarda kardiyomiyosit mitokondriyal koenzim Q içeriğini vahşi tip kontrol ile karşılaştırarak, mitokondriyal membran potansiyelinin bir fonksiyonu olarak mPTP davranışını ölçmek için yeni bir yaklaşım ortaya koymaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Mitokondriyal fizyoloji
- Kırılgan X sendromu
- Kardiyomiyosit fonksiyonu
Arka Plan
- Mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneği (mPTP), hücresel enerji metabolizmasında kritik bir rol oynamaktadır.
- Kırılgan X sendromunun hücresel fonksiyon ve metabolizmayı etkilediği bilinmektedir.
- Çalışma, kardiyak hücrelerde mPTP davranışı ve mitokondriyal potansiyel arasındaki ilişkiyi açıklamayı amaçlamaktadır.
Kullanılan Yöntemler
- Mitokondriyal aktiviteyi ölçmek için oksijen elektrodunun kalibasyonu
- Neonatal kırılgan X sendromlu fareler ve vahşi tip kontrol kardiyomiyosit mitokondrileri
- Gözenek açılma olasılığını değerlendirmek için siklosporin A gibi mPTP inhibitörlerinin uygulanması
Ana Sonuçlar
- Kardiyak mitokondriler içinde mPTP açılması için voltaj eşiğini belirledi.
- Kırılgan X sendromu ve vahşi tip kontrol mitokondrileri arasında farklı mPTP açılma olasılığını gösterdi.
- mPTP'nin kapanma ve açılma olasılığını membran potansiyelinin etkilediğini doğruladı.
Sonuçlar
- Çalışma, hastalık modellerinde mPTP dinamiklerini ve bunların etkilerini analiz etmek için yeni bir metodoloji kurmaktadır.
- Bu bulgular, kırılgan X sendromunda ve ilgili durumlarda mitokondriyal işlev bozukluğu hakkındaki anlayışımızı artırmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mitochondrial permeability transition pore (mPTP) open probability as a function of membrane potential enables mechanistic de-risking in early discovery and target validation for mitochondrial dysfunction. This approach provides predictive confidence for evaluating mitochondrial liabilities and supports portfolio triage in disease-relevant models. The method's adaptability across organ systems and species enhances its enterprise value for translational research and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of mPTP gating mechanisms under defined voltage thresholds.
- Supports functional target validation by quantifying pore open probability in response to modulators like cyclosporine A.
- Facilitates mechanistic de-risking of mitochondrial targets in disease-relevant systems.
- Provides a platform for comparative studies across genetic backgrounds and tissue types.
Screening & Assay Development
- Establishes standardized, quantitative readouts for mPTP activity using simultaneous oxygen consumption and membrane potential measurements.
- Enables reproducible assessment of compound effects on mitochondrial function in isolated organelles.
- Supports assay scalability and cross-laboratory standardization through robust electrode-based protocols.
- Prepares validated biological systems for downstream screening of mitochondrial modulators.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial functional readouts with disease-relevant phenotypes in genetic models.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of mitochondrial targets.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying functional mitochondrial liabilities.
- Facilitates biomarker alignment for translational research in mitochondrial pathologies.
Pipeline & Workflow Integration
This technique integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, mechanistic de-risking, and quantitative assessment of mitochondrial function in isolated systems.
- Discovery Biology: Provides voltage-dependent mPTP open probability data for pathway clarification and target validation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in mitochondrial assays.
- Analytics: Generates simultaneous oxygen consumption and membrane potential measurements for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to preclinical models by supporting disease-relevant system interrogation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable protocol for diverse organ systems and species in mitochondrial research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales mitochondrial functional assays for cross-team reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking mitochondrial liabilities early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of mitochondrial-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial isolation and electrode-based measurement techniques.
- Demands access to polarography and TPP-selective electrode instrumentation.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility of quantitative outputs.
- Adaptable to various organ systems and species with protocol optimization.
- Careful handling is needed to avoid air bubbles and ensure stable oxygen consumption readings.
