Name: Miyokard Enfarktüslü Farelerde Ultrason Rehberliğinde İndüklenen Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit İmplantasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Keşfedin, miyokard enfarktüslü farelerde ekokardiyografi rehberliğinde iPS kaynaklı kardiyomiyositlerin perkütan intramiyokardiyal enjeksiyonunu. Bu yöntem, kalp onarımı için güvenli ve tekrarlanabilir bir hücre tedavisi sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Büyük Araştırma Planı (No. 91539111to JY), Hunan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Anahtar Projesi (No. 2020SK53420 - JY) ve Hunan Eyaleti Bilim ve Teknoloji İnovasyon Programı (2021RC2106 - CF) tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışmadaki tüm hayvan deneyleri, Central South Üniversitesi İkinci Xiangya Hastanesi etik komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan tüm malzeme ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız. Hücre enjeksiyonu, görüntüleme ve ötenazi için zaman çizelgeleri aşağıdaki gibidir: t0- enfarktüsü indüklemek, t1 hafta- görüntü ve implant hücreleri, t2 hafta- görüntü ve implant hücreleri, t4 hafta- son görüntüleme, ötenazi ve doku toplama.
1. hiPSC kültürü, kardiyomiyosit farklılaşması ve hücre saflaştırması
<ol><li>DMEM/F12 ve bazal membran matris stok solüsyonunu 4 °C'de buzla 1,5:1 oranında alikot ile karıştırın ve elde edilen karışımı (matris seyreltici) -20 °C'de saklayın. 25 mL DMEM/F12 kültür ortamını 4 °C'de ve 1 mL matris seyrelticiyi buzla iyice karıştırın ve 6 delikli bir plakada 1 mL/kuyucuk yayın. Plakayı 37 ° C'de bir inkübatörde 1 saat dik tutun ve DMEM / F12 süpernatantını kuyucuklardan aspire edin. İşlemi gerçekleştirirken 6 delikli plakanın tabanına dokunmayın.</li>
	<li>HiPSC'leri içeren kriyoprezervasyon tüpünü sıvı azottan çıkarın ve 37 °C'lik bir su banyosunda hızla çözün. Kriyoprezervasyon tüpünün dış yüzeyini u alkol ile sterilize edin, alkolü silin ve tüpü steril ultra temiz bir masaya aktarın.</li>
	<li>HiPSC'ler içeren kriyoprezervasyon solüsyonunu nazikçe 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarmak için bir pipet kullanın, 5 mL besleyicisiz ES ortamı ekleyin ve süspansiyonu oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj edin. Süpernatantı atın ve besleyicisiz ES ortamının 6 mL'sindeki hücreleri yavaşça askıya alın. Hücreleri sayın ve hücre konsantrasyonunu kültür ortamı ile 5 × 105 hücre / mL'ye ayarlayın.</li>
	<li>HiPSC'lere 5 μM'lik son konsantrasyona kadar ROCK inhibitörü (Y27632) ekleyin. Y27632 ile hiPSC'leri bazal membran matrisi ile önceden işlenmiş 6 delikli plakaya aktarın ve hiPSC'leri eşit olarak dağıtmak için "8" sayısının şeklini izleyerek 6 delikli plakayı yavaşça döndürün. HiPSC'leri 37 °C, %5 CO2 içeren nemli bir inkübatöre 24 saat boyunca dik konumda yerleştirin. Supernatant'ı Y27632 olmadan besleyicisiz ES ortamıyla değiştirin.</li>
	<li></li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li></ol><ol><li></li><li></li><li> </li><li><li><li><li> </li><li><li><li><li><li><li><li></li></ol><ol><li><li><li><li><li></li><li></li><li><li></ol><ol><li><ol><li><li><li></li><li><li></li></ol></li><li><ol><li><li><li><li><li><li><li> </li><li><li></li></ol></li><li><ol><li><li><li></li><li></li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63647/63647eq01.jpg" style="margin: auto;"> </li></ol></li><li><ol><li><li></li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63647/63647eq02.jpg" style="margin: auto;"></li></ol></li><li><ol><li><li></li><li></li></ol></li></ol>

<ol><li>Leuschner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+monocyte+kinetics+in+acute+myocardial+infarction+are+sustained+by+extramedullary+monocytopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).</li>
<li>Lázár, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart%3A+insights+from+the+fall-out%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li>
<li>Davis, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art%3A+cardiac+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">State of the art: cardiac transplantation.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 24 (8), 341-349 (2014).</li>
<li>Mancini, D., Colombo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+ventricular+assist+devices%3A+A+rapidly+evolving+alternative+to+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Left ventricular assist devices: A rapidly evolving alternative to transplant.</a> Journal of the American College of Cardiology. 65 (23), 2542-2555 (2015).</li>
<li>Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+myocardial+remuscularization%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Translating myocardial remuscularization.</a> Circulation Research. 120 (2), 278-281 (2017).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+investigation+of+hypoxia-preconditioned+allogeneic+mesenchymal+stem+cells+for+myocardial+repair+in+nonhuman+primates%3A+Paracrine+activity+without+remuscularization%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates: Paracrine activity without remuscularization.</a> Circulation Research. 118 (6), 970-983 (2016).</li>
<li>Kempf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+scalable+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1345-1361 (2015).</li>
<li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).</li>
<li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+transplantation+of+iPS+cell-derived+cardiomyocytes+regenerates+primate+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts.</a> Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).</li>
<li>Nguyen, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+strategies+to+address+the+major+clinical+barriers+facing+stem+cell+regenerative+therapy+for+cardiovascular+disease%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Potential strategies to address the major clinical barriers facing stem cell regenerative therapy for cardiovascular disease: A review.</a> JAMA Cardiology. 1 (8), 953-962 (2016).</li>
<li>Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remuscularization+of+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Remuscularization of the failing heart.</a> The Journal of Physiology. 595 (12), 3685-3690 (2017).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+hypoxia-preconditioned+mesenchymal+stem+cells+improves+infarcted+heart+function+via+enhanced+survival+of+implanted+cells+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 135 (4), 799-808 (2008).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+improves+Sca-1%2B+stem+cell+survival+and+directs+ischemic+cardiomyocytes+toward+a+prosurvival+phenotype+via+exosomal+transfer%3A+a+critical+role+for+HSF1%2FmiR-34a%2FHSP70+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Heat shock improves Sca-1+ stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytes toward a prosurvival phenotype via exosomal transfer: a critical role for HSF1/miR-34a/HSP70 pathway.</a> Stem Cells. 32 (2), Dayton, Ohio. 462-472 (2014).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+from+CCND2-overexpressing+human+induced-pluripotent+stem+cells+repopulate+the+myocardial+scar+in+mice%3A+A+6-month+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes from CCND2-overexpressing human induced-pluripotent stem cells repopulate the myocardial scar in mice: A 6-month study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 137, 25-33 (2019).</li>
<li>Lou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-cadherin+overexpression+enhances+the+reparative+potency+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocytes+in+infarcted+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts.</a> Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+microvessels+improve+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocyte+engraftment+and+cardiac+function+after+infarction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transplanted microvessels improve pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte engraftment and cardiac function after infarction in rats.</a> Science Translational Medicine. 12 (562), (2020).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+with+echocardiography-guided+multiple+percutaneous+left+ventricular+intramyocardial+injection+of+hiPSC-CMs+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair with echocardiography-guided multiple percutaneous left ventricular intramyocardial injection of hiPSC-CMs after myocardial infarction.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 768873(2021).</li>
<li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+competent+DNA+damage-free+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+myocardial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Functionally competent DNA damage-free induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for myocardial repair.</a> Circulation. 140 (6), 520-522 (2019).</li>
<li>Lou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-cadherin+overexpression+enhances+the+reparative+potency+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocytes+in+infarcted+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts.</a> Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+preconditioning+enhances+transplantation+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+myocardial+infarction+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Y-27632 preconditioning enhances transplantation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in myocardial infarction mice.</a> Cardiovascular Research. 115 (2), 343-356 (2019).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+engraftment+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+via+a+transient+inhibition+of+rho+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59452(2019).</li>
<li>O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantification+and+analysis+of+cell+counting+procedures+using+ImageJ+plugins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719(2016).</li>
<li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+revisited%3A+inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444(2014).</li>
<li>Rainer, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte-specific+transforming+growth+factor+%CE%B2+suppression+blocks+neutrophil+infiltration%2C+augments+multiple+cytoprotective+cascades%2C+and+reduces+early+mortality+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte-specific transforming growth factor β suppression blocks neutrophil infiltration, augments multiple cytoprotective cascades, and reduces early mortality after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 114 (8), 1246-1257 (2014).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocyte+therapy+in+mouse+permanent+ischemia+and+ischemia-reperfusion+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte therapy in mouse permanent ischemia and ischemia-reperfusion models.</a> Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 167(2019).</li>
<li>Iwanaga, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+G-CSF+on+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Effects of G-CSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 325 (4), 1353-1359 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu çalışmanın kritik adımları arasında hiPSC kültürü, kardiyomiyosit farklılaşması, hiPSC-CM saflaştırma ve fare miyokard enfarktüsü bölgesine hiPSC-CM transplantasyonu yer almaktadır. Anahtar, hiPSC-CM'lerin bölgeye enjekte edildiği enfarktüsün kenarındaki enfarktüs bölgesine doğru tedaviyi transkutanöz olarak yönlendirmek için kardiyak ultrason kullanmaktır.
Kültür süresinin uzamasıyla birlikte, hiPSC-CM fenotipi morfolojide (daha büyük hücre boyutu), yapıda (kas, fibril yoğunluğu, düzenleme...

Akut MI meydana geldiğinde, enfarktüslü bölgedeki miyokard hücreleri iskemi ve hipoksi nedeniyle hızla ölür. Hücre ölümü ve rüptüründen sonra çeşitli enflamatuar faktörler salınırken, enflamatuar hücreler inflamasyona neden olmak için enfarktüs bölgesine sızar1. Önemli ölçüde, fibroblastlar ve kollajen, hem kontraktilitesi hem de elektriksel iletkenliği olmadan, enfarktüs bölgesindeki miyokard hücrelerini skar dokusu oluşturmak için değiştirir. Yetişkin memelilerde kardiyomiyositlerin sınırlı rejenerasyon kapasitesi nedeniyle, geniş bir enfarktüs alanından sonra oluşan canlı doku, yeterli kalp debisini korumak için genellikle yeterli değildir2. MI kalp yetmezliğine neden olur ve ciddi kalp yetmezliği vakalarında, hastalar normal kalp fonksiyonlarını korumak için sadece kalp nakillerine veya ventriküler destek cihazlarına güvenebilirler 3,4.
MI'den sonra ideal tedavi stratejisi, ölü kardiyomiyositlerin yeni oluşan kardiyomiyositlerle değiştirilmesi ve sağlıklı dokularla elektromekanik eşleşmenin oluşturulmasıdır. Bununla birlikte, tedavi seçenekleri tipik olarak replasman yerine miyokard kurtarmayı benimsemiştir. Günümüzde, kök hücre ve progenitör hücre bazlı tedaviler, MI5'ten sonra miyokard onarımını teşvik etmek için en umut verici stratejiler arasındadır. Bununla birlikte, bu hücrelerin transplantasyonunun, yetişkin kök hücrelerin kardiyomiyositlere farklılaşamaması ve kısa ömürleri6 olmak üzere çeşitli sorunları vardır.
Embriyonik kök (ES) hücrelerin kullanımı ile ilgili etik sorunlar, umut verici bir hücre kaynağı olan iPSC'ler tarafından atlatılabilir. Ek olarak, iPSC'ler güçlü kendini yenileme yeteneklerine sahiptir ve kardiyomiyositlere farklılaşabilir7. Çalışmalar, MI bölgesine nakledilen hiPSC-CM'lerin hayatta kalabildiğini ve konakçı hücrelerle boşluk kavşakları oluşturabildiğini göstermiştir8,9. Bununla birlikte, nakledilen bu hücreler iskemi ve inflamasyonun mikro ortamında bulunduğundan, hayatta kalma oranları son derece düşüktür10,11.
Nakledilen hücrelerin hayatta kalma oranını artırmak için, nakledilen hücrelerin hipoksi ve ısı şoku ön tedavisi12,13, genetik modifikasyon 14,15 ve hücrelerin ve kılcal damarların eşzamanlı nakli 16 gibi çeşitli yöntemler oluşturulmuştur. Ne yazık ki, çoğu yöntem karmaşıklık ve yüksek maliyet ile sınırlıdır. Bu nedenle, bu çalışma tekrarlanabilir, uygun, nispeten invaziv ve etkili bir hiPSC-CM dağıtım yöntemi önermektedir.
Ultrason rehberliğinde intramiyokardiyal hücre enjeksiyonu, bölgeden bağımsız olarak sadece yüksek çözünürlüklü küçük bir veteriner ultrason makinesi ve bir mikroenjektör ile gerçekleştirilebilir. Ultrason rehberliğinde, farelerde perikarddan miyokarda ksifoid süreç altındaki hücreleri doğrudan teslim etmek, karaciğer ve akciğer hasarını önleyen güvenli bir protokoldür. Bu yöntem, nakledilen hücrelerin hayatta kalma oranını önemli ölçüde artırmak için diğer teknolojilerle aynı anda birleştirilebilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Antikor< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kardiyak troponin T</td><td>Abcam</td><td>ab8295</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150105</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 555)</td><td>Abcam</td><td>ab150110</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150073</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 555)</td> <td>Abcam</td><td>ab150062</td><td></td></tr><tr><td>İnsan kardiyak troponin T</td><td>Abcam</td><td>ab91605</td><td></td></tr><tr><td>İzolektin B4 Vektör</td><td></td><td>FL-1201</td><td></td></tr><tr><td>Sarkomerik alfa aktinin</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td></td></tr><tr><td>Buğday tohumu aglütinin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W11261</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Reaktif< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>B27 Takviyesi (eksi insülin)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 Takviyesi (serum içermez)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17&ndash; 504-044</td><td></td></tr><tr><td>Bouin'in çözümü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SDHT10132</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck</td><td>CT99021</td><td></td></tr><tr><td>siklosporin A</td><td>Medchemexpress</td><td>HY-B0579</td><td></td></tr><tr><td>DOĞRUDAN KIRMIZI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>365548-25G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Kan & Doku Kiti</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>HIZLI YEŞİL FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Glikozsuz RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Selleck</td><td>S7086</td><td></td></tr><tr><td>laktik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6661</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>BD356234</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>72562</td><td></td></tr><tr><td>OCT Bileşik</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR Green MasterMix kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>STEMdif Kardiyomiyosit Dondurma Ortamı/STEMdiff</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5030</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Kardiyomiyosit Destek Ortamı</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>ultrason birleştirme ajanı</td><td>CARENT</td><td>22396269389</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S6390</td><td></td></tr><tr><td>Ekipman ve Malzemeler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7500 Gerçek Zamanlı PCR</td><td></td></tr><tr><td>kriyostat</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>floresan mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>ince anatomik makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>ince diseksiyon forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Mikro şırınga</td><td>Hamilton</td><td>7633</td><td></td></tr><tr><td>Küçük hayvan anestezi makinesi</td><td>MATRX</td><td>VMR</td><td></td></tr><tr><td>Ultra yüksek çözünürlüklü küçük hayvan ultrason görüntüleme sistemi</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo 2100</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Statistical Ürün ve Hizmet Çözümleri</td><td>IBM</td><td>21</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td>1.48</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>İnsan mitokondriyal DNA primerleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ileri primer dizisi</td><td>CCGCTACCATAATCATCGCTAT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ters primer dizisi</td><td>TGCTAATACAATGCCAGTCAGG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

miyokard enfarktüslü farelerde ultrason rehberliğinde İndüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit İmplantasyonu

Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

Miyokard enfarktüsü (MI) sonrası hücre tedavisinin temel amacı, hücre aşılama hızını etkili bir şekilde arttırmaktır ve insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), iskemik hasar sonrası kardiyak onarım için umut verici bir hücre kaynağıdır. Ancak düşük greft oranı, transplantasyon sonrası etkili kalp dokusu rejenerasyonu için önemli bir engeldir. Bu protokol, bir MI bölgesine çoklu hiPSC-CM ultrason rehberliğinde perkütan enjeksiyonların hücre transplantasyon oranlarını etkili bir şekilde artırdığını göstermektedir. Çalışma ayrıca tüm hiPSC-CM kültür sürecini, ön tedaviyi ve ultrason rehberliğinde perkütan dağıtım yöntemlerini tanımlamaktadır. Ek olarak, insan mitokondriyal DNA'sının kullanımı, diğer fare organlarında hiPSC-CM'lerin yokluğunu tespit etmeye yardımcı olur. Son olarak, bu yazıda hücre doğumundan 4 hafta sonra farelerde enfarktüslü sınır bölgesinde kardiyak fonksiyon, anjiyogenez, hücre büyüklüğü ve apoptozdaki değişiklikler açıklanmaktadır. Sol ventrikül miyokardının ekokardiyografi eşliğinde perkütan enjeksiyonunun uygulanabilir, nispeten invaziv, tatmin edici, tekrarlanabilir ve etkili bir hücresel tedavi olduğu sonucuna varılabilir.

Her gruptaki farelerin sol ventrikül fonksiyonlarının değerlendirilmesi için yapılan ekokardiyografi, MD grubunda MI yaralanmalarının etkili bir şekilde tersine çevrildiğini ortaya koymuştur (Şekil 2A). MI grubu ile karşılaştırıldığında, SD grubu artmış ejeksiyon fraksiyonu (EF) gösterdi (% 30'dan% 35'e; Şekil 2B) ve fraksiyon kısalması (FS) ('den "'ye; Şekil 2C) MI'den sonra. Bununla birlikte, MD grubu farelerde hiPSC-CM'lerin çokl...

Farelerde miyokard enfarktüsü bölgesi etrafında ultrason rehberliğinde hücre dağıtımı, hücre nakli için güvenli, etkili ve uygun bir yoldur.

Miyokard Enfarktüslü Farelerde Ultrason Rehberliğinde İndüklenen Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit İmplantasyonu

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

Bu, kardiyomiyositlerin ekokardiyografi rehberliğinde, perkütan intramiyokardiyal enjeksiyonunun, insan iPS kaynaklı kardiyomiyositlerin onarıcı özelliğini önemli ölçüde artırdığını gösteren ilk rapordur. Bu yöntem, insan iPS kaynaklı kardiyomiyosit tedavisi için uygulanabilir, tatmin edici, tekrarlanabilir daha az invaziv ve etkili bir prosedürdür. Perkütan intramiyokardiyal doğumun, iskemik kalp hastalığı, miyokard enfarktüsü ve kalp yetmezliği gibi hastalıklarda lokal ilaç dağıtımı için güvenli ve etkili bir yöntem olduğuna inanıyoruz.Bu proje Profesör Jinfu Yang ve Profesör Jun Peng tarafından denetlenmektedir. Prosedürü gösteren Xun Wu, Kele Qin ve Kun Xiang, laboratuvarımdan MD PhDs ve Hunan İl Kardiyovasküler Araştırma Anahtar Laboratuvarı'ndan doktora yapan Di Wang olacak. Başlamak için, vakum, 60 günlük bir hiPSC-CM kültüründen kültür süpernatantını aspire eder.Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra hiPSC-CM'leri, hücre ayrılma enzim karışımını üç ila beş dakika boyunca 37 santigrat derecede kullanarak tek tek hücrelere ayırın. Hücreleri beş mililitre RPMI artı B27 ortamı içeren 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve karıştırın.Hücreleri sayın ve toplam hücre sayısını hesaplayın. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında iki dakika boyunca 300G'de santrifüj edin. Süpernatantı atın ve peleti kardiyomiyosit destek ortamında, mikrolitre başına 4. hücrelerin 6 x 10'luk bir konsantrasyonuna kadar yeniden askıya alın.Enjeksiyon adımına kadar tüpü 37 santigrat dereceye yerleştirin. Fare yeterince uyuşturulduktan sonra, uzuvları ve kuyruğu bantla sabitleyin. Ardından, fare kesici dişlerini 2/0 ipek iplik ve bantla sabitleyin.Medyan boynu ve sol göğsü üç alternatif betain turu ve ardından alkol ile sterilize edin. İnce anatomik makas ve ince diseksiyon forsepsleri kullanarak medyan boyun insizyonu yapın. Trakeayı stabilize etmek ve tamamen açığa çıkarmak için birkaç ön servikal kası kesin.20 gauge kateter delinme iğnesini ağızdan trakea tüpü olarak yerleştirin. Trakea tüpünü ventilatöre bağlayın ve her iki akciğerin de iyi havalandırıldığından emin olmak için torasik hareketi kontrol edin. Solunum parametrelerini ayarlayın.Ardından, sol arka bacağı sağ alt tarafa sabitleyin ve sol üst ekstremitenin etrafındaki bandı gevşetin. İnce diseksiyon makası ve forsepsle, sol toraksın üç ila dört interkostal boşluğunda torakotomi yapın. Forseps kullanarak, perikarddan soyun ve sol ön inen koroner arteri bulun.Arterin proksimal ucunu bağlamak için 6/0 ipek iplik kullanın. Akut miyokard enfarktüsü modelinin oluşturulmasını sağlamak için, ligasyon bölgesindeki arterin distal tarafı kırmızıdan beyaza değişene kadar bekleyin. Göğüs tabakasını katman katman kapatın ve cildi 4/0 iplikle dikin.Sahte hayvan grubu için, ligasyon hariç tüm cerrahi prosedürleri uygulayın. Miyokard enfarktüsünü takip eden ilk iki haftada, fareleri% 5 izofloran ile bağlantılı bir anestezi kutusuna yerleştirin ve trakeal entübasyon yapın. HiPSC-CM'leri uygulamadan üç gün önce, siklosporin A'yı intraperitoneal boşluğa günde kilogram başına 10 miligramlık bir dozda enjekte edin.Tüyleri farenin göğsünden ve üst karnından tüy dökücü kremle çıkarın. Kalp atış hızı dakikada 400 ila 500 atımda tutulana kadar besleme inhalasyon izofloranı. Fare uzuvlarını ve kuyruğunu algılama konsolundaki bantla sabitleyin ve platform sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın.Ultrason jölesini üst karın bölgesine uygulayın. Yüksek çözünürlüklü bir veteriner ultrason probu kullanarak, fare karaciğeri görüntüleri elde edin. Beş mikrolitrelik bir mikro şırınga kullanarak, 5. hiPSC-CM'lere yaklaşık 3 x 10 çizin.Şırıngayı tutun ve sol paraksifoid işlemde üç milimetrelik bir iğne yerleştirin. Ultrason rehberliğinde, diyaframın üst kenarını takip edin. Solunum ritmini ve aralığını gözlemleyin.Ekspiratuar dairenin sonunda perikarda girin, karaciğer ve akciğere zarar vermekten kaçının. Daha sonra B modu ekokardiyografi ile fare kalbinin parasternal uzun eksenli görüntüsünü elde edin. Ultrasonik rehberlik altında, enfarktüs bölgesinin üç marjinal alanının her birine 5. hiPSC-CMs hücrelerine 1 x 10 enjekte edin.Ultrason probunu çıkarın ve jöleyi durulayın. Fareyi anesteziden çıkarın ve kafesine geri koyun. Transplantasyondan sonra bir ay boyunca sürekli olarak siklosporin A enjekte edin.Sol ventrikülün ekokardiyografisi, miyokard enfarktüsüne bağlı yaralanmaların çoklu doz grubunda tersine döndüğünü gösterdi. HiPSC-CM'lerin transplantasyonu ayrıca ejeksiyon fraksiyonunun ve fraksiyonun kısalmasına neden oldu. Sirius Kırmızı ve Hızlı Yeşil boyama kullanılarak kardiyak parametrelerin ölçümü, enfarkt boyutunun ve kollajen hacim fraksiyonunun azaldığını, buna karşın sol ventrikül ön duvar kalınlığının transplantasyon sonrası arttığını göstermiştir.Yeşil renkte spesifik olmayan alfa aktin, mavi renkte DAPI ve kırmızı renkte insana özgü troponin T için etiketleme, enfarktüs ve marjinal enfarktüs bölgesinde nakledilen hücrelerin varlığını göstermiştir. Nakledilen hücrelerin sayısı ve yüzdesi, çoklu doz grubunda tek doza kıyasla daha yüksekti. Miyokard enfarktüsünden 28 gün sonra, çoklu doz grubu, endotel hücre belirteci I-B4'ü eksprese eden hücre sayısında bir artış gösterdi.Kardiyomiyositler üzerinde buğday tohumu aglutinin ve sarkomerik alfa aktinin boyanması, minimum lif çapında bir azalma gösterdi. Çoklu doz grubunda tünel pozitif kardiyomiyosit çekirdeği sayısının daha düşük olması apoptozun azaldığını göstermiştir. PCR analizi, insan mitokondriyal DNA'sını sadece kalpte tespit etti ve spesifik transplantasyonu gösterdi.İğneyi yerleştirirken, karaciğer veya akciğerin zarar görmesini önlemek için diyaframın üst kenarı ve ekspiratuar dairenin sonunda perikardiyal boşluğa girdiğinden emin olun.

ultrasound-guided-induced-pluripotent-stem-cell-derived-cardiomyocyte

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Hipertansiyon ya da miyokart enfarktüsü gibi kalp-damar hastalıkları, kemirgen modellerinde intramiyokardiyal hücre dağıtım yaygın rejeneratif çalışmalarda farklı hücre tiplerinin terapötik potansiyelini test etmek için kullanılır. Bu nedenle, ayrıntılı bir açıklama ve bu cerrahi işlemin açık bir görselleştirme küçük kemirgenler kardiyovasküler hücre tedavi analizlerin sınırlarını ve avantajlarını tanımlamak için yardımcı olacaktır.

Intramiyokardiyal Hücre Teslimat: Mürin Hearts Gözlemler

Ekokardiyografi perkü- intramiyokardiyal enjeksiyon sıçangil kalp gen transfer ajanları veya hücre verilmesi için etkili, güvenilir ve hedeflenebilir yaklaşımı olmaktadır. Bu protokolde belirtilen adımları izleyerek, operatör hızla bu çok yönlü, minimal invaziv teknikle yetkin olabilir.

Farelerde ultrason eşliğinde transtorasik intramiyokardiyal Enjeksiyon

Biz kardiyomiyositlerde, endotel hücreleri ve düz kas hücreleri ve yama-aracılı sitokin teslimat hücre enjeksiyon birleştirerek nakledilen hücrelerin bütünleşmesini geliştiren bir dağıtım yöntemi, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin ayırt etmek için, üç yeni ve daha etkin protokollere sunuyoruz.

Pluripotent Kök Hücre Miyokard Onarım Kardiyak Hücreleri Türetilmiş

Burada, yetişkin farelerden canlı ventriküler dilimlerin hazırlanmasını ve keskin elektrodun hareket potansiyel kayıtları için kullanımlarını açıklıyoruz. Bu çok hücreli müstahzarlar , in vitro olarak elektrofizyolojik ve farmakolojik çalışmalar için değerli bir model oluşturan, korunmuş bir in vivo doku yapısı sağlar.

Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Murin Kısa Eksenli Ventriküler Kalp Dilimleri

Burada insan IPS-hücre cardiomyocytes eskiden şiling şimdi domuz modelinde türetilmiş bir kalp kası yama implantasyonu ve ardından sol ventrikül cryoinjury indüksiyon için bir iletişim kuralı mevcut.

HiPSC elde edilen kalp kası yamalar implantasyonu eskiden şiling şimdi domuz modelinde miyokardiyal yaralanma sonra

Bu protokolde, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin kardiyomiyosit farklılaşma ve arıtma için nasıl kullanılacağı ve daha fazla, Rho ile ilişkili protein kinaz inhibitörü ile transplantasyon verimliliğini nasıl iyileştirebileceğini gösteriyoruz. bir fare miyokard infarktüsü modelinde ön tedavi.

Rho kinase aktivitesinin geçici Inhibisyonu ile ınsan kaynaklı pluripotent kök hücreli türev Kardiyomiyositlerin engraftment artırılması

Biz hücre tabanlı tedaviler için kök hücrelerin intramiyokardiyal uygulama etkisini ve güvenliğini test etmek için sol circumflex arter tıkanıklığı ve hızlı pacing tarafından indüklenen kalp yetmezliği bir domuz modeli kurmak için çalıştı.

Kök Hücre Tedavisi Için Post-miyokard Enfarktüsü Kalp Yetmezliği Domuz Modeli Oluşturma

Kök hücreler sürekli miyokardiyal hasarı olan bireyler için potansiyel tedaviler olarak araştırılır, ancak, onların azaltılmış canlılık ve yaralı doku içinde tutma onların uzun vadeli etkinliğini etkileyebilir. Bu yazıda iskemi reperfüzyon yaralanması nın bir murine modelinde kök hücre dağıtımı için alternatif bir yöntem açıklanmaktadır.

Bir Murine Modelinde İskemi Reperfüzyon Yaralanması Sonrası Kök Hücrelerin Gecikmiş İntramiyokardiyal Teslimi

Bu protokol, kalp yetmezliği ni modelleyen enfarktan farelerin epikardiyumuna 3Boyutlu biyobaskılı bir yama naklini amaçlamaktadır. Anestezi, cerrahi göğüs açıklığı, sol anterior inen kalıcı ligasyon (LAD) koroner arter ve kalbin enfarktüs bölgesine biyobbaskılı bir yama uygulaması ile ilgili ayrıntıları içerir.

Miyokard Enfarktüsü'nün Murine Modelinde 3Boyutlu Biyobaskılı Yama Transplantasyonu

Kök hücre bazlı tedavi, miyokard enfarktüsünden sonra yaralı kalp dokularını onarmak için etkili bir strateji olarak ortaya çıkmıştır. Enzmatik olarak çapraz bağlanabilen jelatin hidrojelleri kullanarak kök hücre nakli için en uygun in vivo uygulamayı sağlıyoruz.

Murine Modelinde Miyokard İnfarktüsünden Sonra MSC Yüklemeli Enjekte Edilebilir Hidrojellerin intramiyokardiyal Transplantasyonu

Bu makale, 29 G x 88 mm'lik bir iğne kullanılarak miyokard enfarktüsünün sıçan modellerinde ekokardiyografi kılavuzluğunda intramiyokard enjeksiyonları için optimize edilmiş bir protokolü detaylandırmaktadır. Bu teknik, terapötik ajanların doğrudan peri-enfarktüs bölgesine sağlam, kesin ve tekrarlanabilir bir şekilde verilmesini sağlar.

Miyokard Enfarktüsünün Sıçan Modelinde Hedefli ve Güvenilir İntramiyokardiyal Kök Hücre Dağıtımı için Ekokardiyografi Kılavuzluğunda Enjeksiyon

Keşfedin, miyokard enfarktüslü farelerde ekokardiyografi rehberliğinde iPS kaynaklı kardiyomiyositlerin perkütan intramiyokardiyal enjeksiyonunu. Bu yöntem, kalp onarımı için güvenli ve tekrarlanabilir bir hücre tedavisi sunar.

Miyokard Enfarktüslü Farelerde Ultrason Rehberliğinde İndüklenen Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit İmplantasyonu

Daha fazla video keşfet