Name: Derin Öğrenme destekli Sanal Boyama ile Histolojik Görüntüleme için Yüksek Hızlı Ultraviyole Fotoakustik Mikroskopi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Keşfedin yüksek hızlı açık üst UV fotoakustik mikroskopi ile derin öğrenme destekli sanal boyama yöntemini. Bu sistem, 18 dakikada histolojik görüntüleme sağlayarak cerrahi marjin analizinde kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Hong Kong İnovasyon ve Teknoloji Komisyonu'nun (ITS/036/19) finansal desteğini kabul etmek istemektedir.

Bu çalışmada yapılan tüm hayvan deneyleri, Hong Kong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Hayvan Etiği Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Üstü açık UV-PAM sistemi (Şekil 1)
<ol><li>Optik aydınlatma<ol>
<li>Uyarma kaynağı olarak Q-switch diyot pompalı katı hal lazeri (266 nm dalga boyu) kullanın.</li>
		<li>Lazer ışınını genişletmek için iki dışbükey lens kullanın ve uzamsal filtreleme gerçekleştirmek için ilk dışbükey lensin odak noktasına yakın bir iğne deliği yerleştirin.</li>
		<li>1D galvanometre aynası (1D GM) kullanarak lazer ışınını yukarı doğru yansıtın.</li>
		<li>Lazer ışınını odaklamak için objektif bir lens kullanın ve bir numuneye sıkıca odaklanmadan önce halka şeklindeki ultrasonik dönüştürücünün (UT) merkezinden geçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ultrasonik algılama<ol>
<li>Ultrasonik dalgaları tespit etmek için halka şeklinde odaklanmış bir UT kullanın. UT aktif alanının iç ve dış çapları sırasıyla 3 mm ve 6 mm'dir. Netleme uzaklığı: 6,3 mm; merkez frekansı: 40 MHz; -6 dB bant genişliği: %84.</li>
		<li>UT'yi, UV ışığının geçmesine izin vermek için ince bir kuvars kapak kayması ile kaplanmış, altta optik olarak şeffaf bir pencereye sahip laboratuvar yapımı bir su deposuna sabitleyin. UT'nin aktif alanının yukarı baktığından emin olun. UT'nin yanal konumunu kontrol etmek için su deposunu iki eksenli bir manuel aşamaya takın.</li>
		<li>UV lazeri açın, lazer ışınının UT'nin merkezinden geçmesine izin vermek için UT'nin konumunu ayarlayın. UV lazeri kapatın. Ardından, UT'yi tamamen batırmak için su deposunu deiyonize suyla doldurun.</li>
		<li>UT'nin çıkışını iki amplifikatöre bağlayın (toplam kazanç = 56 dB) ve ikinci amplifikatörün çıkışını bir veri toplama kartına (DAQ) bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Xy motorlu aşamalara bağlı bir z ekseni manuel aşamasına bir numune tutucu takın. Numune tutucu, UV ışığının geçmesine izin veren boş bir deliğe sahiptir. Deliği çevreleyen dört parça çift taraflı bant takın.</li>
	<li>Sistem hizalaması<ol>
<li>Bir cam slayda siyah bant takın ve cam kaydırağı, numune tutucunun deliğini kaplayacak şekilde, siyah bant aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Numune tutucuya sabitlendiğinden emin olmak için cam kızağa basın. Ardından, cam kaydırağı suya batırmak için numune tutucuyu indirin.</li>
		<li>Halka şeklindeki UT ve amplifikatörlerin bağlantısını kesin, UT'yi pulser/alıcıya bağlayın ve pulser/alıcının çıkışını bir osiloskopa bağlayın. Darbeyi/alıcıyı Darbe-Yankı modunda çalıştırın. Darbe genliğini ve darbecinin/alıcının kazancını sırasıyla 6 ve 20 dB'ye ayarlayın.<ol>
<li>Darbeciyi/alıcıyı etkinleştirin ve ultrasonik sinyallerin maksimum olduğu akustik odak düzleminin konumunu bulmak için numune tutucunun z-konumunu ayarlayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Darbeci/alıcıyı iletim moduna değiştirin ve kazancı 60 dB'ye ayarlayın. Lazer çıkışını etkinleştirin. Osiloskop tarafından ölçülen PA sinyallerini en üst düzeye çıkarmak için objektif lensin z konumunu ayarlayın.</li>
		<li>Üretilen PA sinyalini simetrik ve maksimum yapmak için halka şeklindeki UT'nin yanal konumunu ayarlayın, bu da optik ve akustik odakların yanal düzlemde birlikte hizalandığını temsil eder. Ardından, PA sinyallerini en üst düzeye çıkarmak için numune tutucunun z konumunu ayarlayın.</li>
		<li>PA sinyallerinin hem simetrisini hem de genliğini en iyi duruma getirmek için 1.4.3 ve 1.4.4 adımlarını yineleyin. PA sinyalleri optimize edildiğinde zaman gecikmesini (yani, PA dalgalarının UT'ye ulaşması için gereken süreyi) osiloskopta kaydedin.</li>
		<li>Siyah bandın farklı konumlarını görüntülemek için numune tutucuyu hareket ettirin. Numune tutucunun düzlüğünü, siyah bandın her bir konumundan üretilen PA sinyalleri, adım 1.4.5'te ölçülenle aynı zaman gecikmesine sahip olacak şekilde ayarlayın.</li>
		<li>Lazeri kapatın ve UT'yi iki amplifikatöre bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Numune hazırlama
<ol><li>FFPE fare beyin dilimi<ol>
<li>Aşırı dozda anestezi ile bir fareyi feda edin. Ardından, referans 18'de açıklanan protokolü izleyerek fare beyninitoplayın.</li>
		<li>Hasat edilen beyni 24 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalinde sabitleyin.</li>
		<li>Sabit beyni, derecelendirilmiş alkolle dehidrasyon, ksilen ile temizleme ve referans19'da açıklandığı gibi parafin ile gömme yoluyla işleyin. NOT: Numuneyi bir davlumbazda işleyin.</li>
		<li>Gömülü beyni bir mikrotom kullanarak ince dilimler halinde (5 μm kalınlığında) dilimleyin. Örnek dilimleri kuvars slaytlara yerleştirin. Slaytları 60 °C'de bir fırında 1 saat kurulayın.</li>
		<li>Parafin UV uyarımı ile yüksek oranda emici olduğu için yüksek arka plan sinyallerini önlemek için parafini uzaklaştıran bir temizleme maddesi (bakınız Malzeme Tablosu) kullanarak bölümleri deparafinize edin. NOT: Numuneyi bir davlumbazda işleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Taze fare beyin dilimi<ol>
<li>Aşırı dozda anestezi ile bir fareyi feda edin. Ardından, referans 18'de belirtilen protokolü izleyerek fare beyninitoplayın.</li>
		<li>Kanı çıkarmak için fare beynini fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.</li>
		<li>Beyin örneğinin bir dilimini (~ 5 mm kalınlığında) elle kesin ve ardından kesitteki kanı çıkarmak için numuneyi PBS ile yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Deneysel prosedürler
<ol><li>Örnek yerleştirme<ol>
<li>UV şeffaf membranlı (polietilen, ∼10 μm kalınlığında) laboratuvar yapımı bir numune tankı hazırlayın. Membrana bir damla su ekleyin ve ardından suyu örtmek için biyolojik numuneyi numune tankına yerleştirin. FFPE dilim numunesi durumunda, cam slaytı membran üzerine sabitlemek için bant kullanın.</li>
		<li>Numune içeren numune tankını, numune tutucunun boş deliğini kapatacak şekilde numune tutucunun üzerine yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>UV lazeri harici tetik moduna ayarlayın. Laboratuvarda oluşturulan LabVIEW programımızı kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu), tarama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın.<ol>
<li>Lazer tekrarlama hızını 55 kHz'e ayarlayın; GM sürücüsünün sinyal tipime'sini üçgen ve sürüş voltajı aralığını 0,018 V olarak ayarlayın (±0,018 V; ölçek faktörü: 1 V/°'yi temsil eder). GMnum'u 22'ye ve dy'yi 2'ye ayarlayın, böylece her 22 lazer tetikleyicisinden sonra, GM tarama süresinin dörtte birini bitirir ve y ekseni motoru 0.3125 μm'lik bir adım boyutunu hareket ettirir. Dx'i 192 olarak ayarlayın, böylece y eksenli motor ön ayarlı konuma ulaştığında (örneğin, 5 mm), x eksenli motor 30 μm'lik bir adım boyutunda hareket eder. NOT: En küçük artımlı adım boyutu, hem x hem de y eksenli motorlar için 0,15625 μm olarak ayarlanmıştır. Bu nedenle, dy = 2 olduğunda, adım boyutu 0,15625 x 2 = 0,3125 μm'ye eşittir ve dx = 192 olduğunda, adım boyutu 0,15625 x 192 = 30 μm'ye eşittir. 5 x 5mm2'lik tüm alanı taramak için, x eksenli motor 5000 μm / 30 μm = 167 kez hareket edecektir, bu da 167 alt görüntünün tam bir görüntü elde etmek için dikileceği anlamına gelir. UV-PAM sisteminin tarama yörüngesi için Şekil 2'ye bakınız.</li>
	</ol>
</li>
	<li>X ve y eksenli motorların hareketli adım sayısını ayarlayarak küçük bir bölgede deneme taramasına başlayın (xn = 10 ve yn = 1000). Maksimum PA sinyalleri elde etmek üzere numuneyi odak düzlemine yerleştirmek için z ekseni manuel aşamasını ayarlayın.</li>
	<li>Hem x hem de y eksenli motorları istediğiniz başlangıç noktasına taşıyın, xn ve yn değerlerini ayarlayarak tarama bölgesini ayarlayın ve ardından görüntü alma programını başlatın (bkz.</li>
	<li>Görüntü alımından sonra lazeri kapatın, numune tutucuyu çıkarın ve biyolojik örnekleri saklayın.</li>
	<li>Taze biyolojik dokular için, numuneleri% 10 nötr tamponlu formalin içinde saklayın.</li>
	<li>FFPE fare beyin dilimleri için, karşılık gelen H&E boyalı görüntüleri elde etmek için referans20'de belirtilen protokolü izleyerek H&E ile lekeleyin.</li>
	<li>Laboratuvarda oluşturulmuş bir görüntü işleme algoritması kullanarak maksimum genlik projeksiyon görüntüsünü yeniden oluşturmak için toplanan PA sinyallerini kullanın (bkz.</li>
</ol>

<ol><li>Kunos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+conservation+surgery+achieving+%E2%89%A5+2+mm+tumor-free+margins+results+in+decreased+local-regional+recurrence+rates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Breast+Journal%22%5BJournal%5D)">Breast conservation surgery achieving ≥ 2 mm tumor-free margins results in decreased local-regional recurrence rates.</a> The Breast Journal. 12, 28-36 (2006).</li>
<li>Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+microscopy+will+remain+a+cornerstone+of+surgical+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Why microscopy will remain a cornerstone of surgical pathology.</a> Laboratory Investigation. 87 (5), 403-408 (2007).</li>
<li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+sublimation%2Frecrystallization+for+imaging+proteins+by+mass+spectrometry+at+high+spatial+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution.</a> Analytical Chemistry. 83 (14), 5728-5734 (2011).</li>
<li>Jaafar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-operative+frozen+section+consultation%3A+concepts%2C+applications+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Malaysian+Journal+of+Medical+Sciences%3A+MJMS%22%5BJournal%5D)">Intra-operative frozen section consultation: concepts, applications and limitations.</a> The Malaysian Journal of Medical Sciences: MJMS. 13 (1), 4(2006).</li>
<li>Rastogi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts%3A+a+diagnostic+dilemma+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Diagnostic+Research%22%5BJournal%5D)">Artefacts: a diagnostic dilemma - a review.</a> Journal of Clinical and Diagnostic Research. 7 (10), 2408-2413 (2013).</li>
<li>Carrasco-Zevallos, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+intraoperative+optical+coherence+tomography%3A+technology+and+applications+%5BInvited%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Review of intraoperative optical coherence tomography: technology and applications [Invited].</a> Biomedical Optics Express. 8 (3), 1607(2017).</li>
<li>Gareau, D. S., Jeon, H., Nehal, K. S., Rajadhyaksha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+of+cancer+margins+in+tissue+with+multimodal+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid screening of cancer margins in tissue with multimodal confocal microscopy.</a> Journal of Surgical Research. 178 (2), 533-538 (2012).</li>
<li>Fereidouni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+with+ultraviolet+surface+excitation+for+rapid+slide-free+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microscopy with ultraviolet surface excitation for rapid slide-free histology.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 957-966 (2017).</li>
<li>Tanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-tissue+biopsy+phenotyping+of+three-dimensional+tumours+reveals+patterns+of+cancer+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Whole-tissue biopsy phenotyping of three-dimensional tumours reveals patterns of cancer heterogeneity.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (10), 796-806 (2017).</li>
<li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy%3A+A+potential+intraoperative+tool+for+the+detection+of+carcinoma+in+situ+in+human+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy: A potential intraoperative tool for the detection of carcinoma in situ in human bladder.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 139 (6), 796-804 (2015).</li>
<li>Orringer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+intraoperative+histology+of+unprocessed+surgical+specimens+via+fibre-laser-based+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (2), 0027(2017).</li>
<li>Wong, T. T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+label-free+multilayered+histology-like+imaging+of+human+breast+cancer+by+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Fast label-free multilayered histology-like imaging of human breast cancer by photoacoustic microscopy.</a> Science Advances. 3 (5), 1602168(2017).</li>
<li>Shen, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of nucleic acids.</a> Diagnostic Molecular Biology. , 167-185 (2019).</li>
<li>Yao, J., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+%26+Photonics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic microscopy.</a> Laser & Photonics Reviews. 7 (5), 1-36 (2012).</li>
<li>Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+label-free+ultraviolet+photoacoustic+microscopy+for+histology-like+imaging+of+unprocessed+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues.</a> Optics Letters. 45 (19), 5401(2020).</li>
<li>Baik, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraoperative+label-free+photoacoustic+histopathology+of+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+%26+Photonics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Intraoperative label-free photoacoustic histopathology of clinical specimens.</a> Laser & Photonics Reviews. 15 (10), 2100124(2021).</li>
<li>Kang, L., Li, X., Zhang, Y., Wong, T. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+enables+ultraviolet+photoacoustic+microscopy+based+histological+imaging+with+near+real-time+virtual+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Photoacoustics%22%5BJournal%5D)">Deep learning enables ultraviolet photoacoustic microscopy based histological imaging with near real-time virtual staining.</a> Photoacoustics. 25, 100308(2022).</li>
<li>Sterile Tissue Harvest | Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10298/sterile-tissue-harvest">https://www.jove.com/science-education/10298/sterile-tissue-harvest</a> (2022).</li>
<li>Steps to Tissue Processing for Histopathology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/">https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/</a> (2022).</li>
<li>An Intro to H&E Staining: Protocol, Best Practices, Steps & More. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/">https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/</a> (2022).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+photoacoustic+microscopy+with+tissue+clearing+for+high-contrast+histological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Photoacoustics%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet photoacoustic microscopy with tissue clearing for high-contrast histological imaging.</a> Photoacoustics. 25, 100313(2022).</li>
<li>Leinonen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B2-amyloid+in+a+frontal+cortical+brain+biopsy+specimen+and+by+positron+emission+tomography+with+carbon+11-labeled+pittsburgh+compound+B%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Assessment of β-amyloid in a frontal cortical brain biopsy specimen and by positron emission tomography with carbon 11-labeled pittsburgh compound B.</a> Archives of Neurology. 65 (10), 1304-1309 (2008).</li>
<li>Imai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ultraviolet+photoacoustic+microscopy+with+multifocal+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">High-throughput ultraviolet photoacoustic microscopy with multifocal excitation.</a> Journal of Biomedical Optics. 23 (03), (2018).</li>
</ol>

T. T. W. W. ve V. T. C. T.'nin PhoMedics Limited'de finansal çıkarları vardır, ancak bu çalışmayı desteklememektedir. Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Özetle, histolojik görüntüleme için yüksek hızlı ve üstü açık bir UV-PAM sistemi gösterilmiştir. Sistem konfigürasyonu, optik hizalama, numune hazırlama ve deneysel prosedürler hakkında ayrıntılı talimatlar sunulmaktadır. Görüntü alma programına, Malzeme Tablosunda verilen bağlantı aracılığıyla Github'dan erişilebilir. Mevcut sistemin yanal çözünürlüğü ~ 1.2 μm'dir ve yakın tarihli bir yayın21'de deneysel olarak ölçülmüştür. Mevcut sistemin, tipik bir beyin biyopsisi boyutu olan 5 x 5mm2'lik bir alan için 18 dakika içinde histolojik bir görüntü elde edebileceğini göstermek için bir fare beyin dilimigörüntülendi. Orijinal görüntü gri tonlamalı olmasına rağmen, derin öğrenme algoritması tarafından sağlanan dijital bir sanal boyama aracının yardımıyla, mevcut sistem neredeyse gerçek zamanlı olarak neredeyse lekelenmiş görüntüler sağlayabilir ve patologların görüntüleri yorumlaması için kolay adaptasyon sağlayabilir. Etiketsiz bir görüntü tekniği olarak, mevcut UV-PAM sistemi, işlenmemiş taze doku örnekleri için histolojik görüntüler de sağlayabilir. Daha fazla örnek (dondurulmuş kesitli ve taze doku örnekleri dahil) önceki bir yayında gösterilmiştir17. Deneysel sonuçlar, SMA uygulamalarında mevcut derin öğrenme destekli UV-PAM sisteminin yüksek potansiyelini göstermektedir.
UV-PAM sisteminin avantajlarından biri, sistemin yansıma modunda uygulanması ve kalın dokuların görüntülenmesini sağlamasıdır. Ayrıca, üstü açık UV-PAM sistemi, numunenin geleneksel optik mikroskopilerle benzer bir işleme sahip olan tarama penceresine (numune tankının zarı) yerleştirilmesini sağlar. Bu nedenle, bu sistem numunelerin iki membran11,14 ile sıkıştırılmasını gerektiren diğer sistemlerden daha kullanıcı dostudur. Ayrıca, yüksek tekrarlama oranlı UV lazerli bir 1D GM kullanarak, mevcut UV-PAM sistemi, multifokal uyarma23 kullanan sistemle karşılaştırıldığında daha yüksek maliyet etkinliği ile yüksek görüntüleme hızına ulaşabilir.
Şu anda, görüntüleme hızı esas olarak lazer ve foton bütçesinin tekrarlama oranı ile sınırlıdır. Yüksek tekrarlama hızına ve yüksek darbe enerjisine sahip bir lazer ile görüntüleme süresi daha da kısaltılabilir. Sistemin bir başka sınırlaması, numunenin, kullanıcıların numunenin odakta olup olmadığını görselleştirmeleri için gerçek zamanlı bir görüntü görüntülemek yerine, maksimum PA sinyallerini bularak objektif lensin odak düzlemine kabaca ayarlanabilmesidir. Neredeyse gerçek zamanlı bir görüntü görüntülemek için 2D GM uygulanabilir.
Protokolde iki kritik adım vardır: (a) optik ve akustik odakların konfokal gereksinimi, yüksek algılama hassasiyeti elde etmek için optimize edilmelidir; (b) GM'nin x eksenindeki tarama aralığı, benzer yüksek algılama hassasiyetini korumak için halka şeklindeki UT'nin akustik odak noktasından daha küçük olmalıdır (mevcut kurulumda, tarama aralığı ~30 μm ±15 μm'dir). Aksi takdirde, kenarların etrafındaki belirgin vinyet efektleri, birden fazla alt görüntü bütün bir görüntü elde etmek için bir araya getirildiğinde ortaya çıkar.

Doku örneklerinin mikroskop altında incelenmesini gerektiren cerrahi sınır analizi (SMA), rezeksiyon cerrahisinde tüm kanser hücrelerinin hastanın vücudundan çıkarılıp çıkarılmadığını belirlemek için gerekli bir prosedürdür1. Bu nedenle, hızlı bir şekilde histolojik görüntüler sağlayabilen bir mikroskop, SMA'nın kanser hücrelerinin eksik çıkarılmasından kaynaklanan tekrarlanan ameliyatlardan kaçınması için hayati öneme sahiptir. Bununla birlikte, parlak alan optik mikroskopisine dayanan mevcut altın standart yönteme göre, eksize edilen dokunun formalin içine sabitlenmesi, parafin içine gömülmesi, ince dilimler halinde (4-7 μm) kesitlenmesi ve daha sonra görüntülemeden önce hematoksilin ve eozin (H & E) ile boyanması gerekir, bu da zaman alıcı (3-7 gün) ve zahmetli 2,3 . Dondurulmuş bir kesit, dokuyu hızlı bir şekilde dondurarak, dilimleyerek ve boyayarak SMA için hızlı bir alternatiftir, bu da 20-30 dakika4'te histolojik görüntüler sağlayabilir. Bununla birlikte, histolojik özellikler sıklıkla çarpıtılır ve tekniğin birden fazla organ tipine uygulanabilirliğini engelleyen ustaca eğitim gerektirir5.
SMA için doku işlemenin birkaç adımı olmadan veya birkaç adımla hücresel görüntüler sağlayabilen optik mikroskopi teknikleri geliştirilmiştir. Ancak, her biri farklı sorunlardan muzdariptir. Örneğin, optik koherens tomografi6 ve konfokal reflektans mikroskobu7, düşük içsel saçılma kontrastları nedeniyle düşük özgüllükten muzdariptir. Ultraviyole yüzey uyarımı8 ve ışık tabakası mikroskobu9 ile mikroskopi, SMA için yüksek çözünürlüklü ve yüksek kontrastlı görüntüler sağlayabilse de, toksik ve uçucu boyama prosedürü genellikle bir ameliyathanede gerçekleştirilemez ve bu da geri dönüş süresini uzatır. Çoklu foton mikroskobu10 ve uyarılmış Raman mikroskobu11, SMA için zengin bilgiler sağlayabilir. Bununla birlikte, doğrusal olmayan etkiler üretmek için kullanılan gerekli ultra hızlı lazerlerin yüksek maliyeti, geniş uygulanabilirliklerini önler.
Son zamanlarda, içsel optik emilimden yararlanarak, yüksek çözünürlüklü histolojik görüntüler sağlamak için etiketsiz ultraviyole fotoakustik mikroskopi (UV-PAM) geliştirilmiştir12. UV-PAM'da, uyarma UV ışığının foton enerjisi (örneğin, 266 nm) önce hücre çekirdeği13'teki DNA / RNA tarafından emilir ve daha sonra ısıya dönüştürülür ve termal-elastik genleşme yoluyla akustik dalga emisyonunu indükler14. Üretilen akustik dalgaları tespit ederek, hücre çekirdeklerinin iki boyutlu (2D) UV-PAM görüntüleri, akustik sinyallerin maksimum genlik projeksiyonu yoluyla elde edilebilir ve SMA için histolojik bilgi sağlar. UV-PAM'ın klinik uygulamalarını mümkün kılmak için, galvanometre ayna taramasına dayalı yüksek hızlı UV-PAM, 18 dakika içinde bir beyin biyopsisi örneği (5 mm x 5 mm) için histolojik görüntüler sağlamak üzere geliştirilmiştir ve zamana duyarlı uygulamalarda büyük potansiyel göstermektedir15. Kalın doku görüntülemesi için UV-PAM olasılığını daha da doğrulamak için, insan kolon ve karaciğer dokularının intraoperatif histopatolojik incelemesini başarıyla gösteren, su geçirmez tek eksenli mikroelektromekanik sistem tarayıcısına sahip bir yansıma modu UV-PAM sistemi önerilmiştir16. Orijinal UV-PAM görüntüsü gri tonlamalı, altın standart H&E boyalı görüntü pembe ve mor renklerde olduğundan, patologların UV-PAM görüntülerini doğrudan yorumlaması zordur. Bu sorunu çözmek için, gri tonlamalı UV-PAM görüntülerini sanal H&E boyalı görüntülere neredeyse gerçek zamanlı olarak aktarmak için bir derin öğrenme algoritması önerildi, böylece patologlar görüntüleri herhangi bir ek eğitim almadan anlayabildiler17.
Bu çalışma, geleneksel optik mikroskopilere benzer şekilde çalıştırılabilen, hem orijinal gri tonlamalı histolojik görüntüler hem de derin öğrenme algoritması tarafından desteklenen neredeyse lekeli görüntüler sağlayan yüksek hızlı ve üstü açık bir UV-PAM sistemi bildirmektedir. Formalin sabit ve parafine gömülü (FFPE) bir fare beyin dilimi, neredeyse lekeli UV-PAM ve standart H & E boyalı görüntülerimiz arasındaki benzerliği göstermek için UV-PAM sistemi tarafından görüntülenir ve SMA uygulamaları için potansiyelini gösterir.

<table><tbody><tr><td>Alkol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1373</td><td>Örnek dehidrasyon</td></tr><tr><td>Amplifikatörü</td><td>Mini Devre</td><td>ZFL-500LN-BNC +</td> <td>Ultrasonik sinyal amplifikasyon</td></tr><tr><td>Kontrol Cihazı</td><td>Ulusal Enstrümanlar</td><td>NI myRIO</td><td>Sistem denetleyicisi</td></tr><tr><td>Veri toplama kartı</td><td>Alazar Technologies</td><td>ATS9350</td><td>Ultrasonik sinyal toplama</td></tr><tr><td>Derin öğrenme Gri</td><td></td><td></td><td>tonlamalı UV-PAM görüntüsünü sanal bir H& E-lekeli görüntü; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM</td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R04586</td><td>Numune fiksasyonu</td></tr><tr><td>H & E boyama kiti</td><td>Abcam</td><td>ab245880</td><td>Numune boyama</td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>Ulusal Teşhis</td><td>HS-202</td><td>Numune deparafinizasyonu</td></tr><tr><td>Görüntü edinme programı</td><td>Ulusal Enstrümanlar</td><td>LabVIEW LabVIEW</td><td>kullanılarak laboratuvarda oluşturulan program; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM</td></tr><tr><td>Görüntü işleme algoritması</td><td>Mathworks</td><td>MATLAB</td><td>MATLAB kullanarak laboratuvar tarafından oluşturulan algoritma; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM</td></tr><tr><td>Kinematik platform montajları</td><td>Thorlabs</td><td>KM200B</td><td>Numuneyi düz olacak şekilde ayarlayın</td></tr><tr><td>Membran</td><td>Glad</td><td>Streç sargı</td><td>Numune tankına sıkıştırılmış</td></tr><tr><td>Mikroskop objektif lensi</td><td>Thorlabs</td><td>LMU- 5X-NUV</td><td>Objektif lens</td></tr><tr><td>Motorlu aşamalar</td><td>Physik Instrumente</td><td>L-509.10SD00</td><td>Tarama aşamaları</td></tr><tr><td>Tek boyutlu galvanometre aynası</td><td>Thorlabs</td><td>GVS411</td><td>Hızlı taramalı ayna</td></tr><tr><td>Osiloskop</td><td>RIGOL Technologies</td><td>DS1102E</td><td>Ultrasonik sinyal okuma</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td>Numune yıkama</td></tr><tr><td>İğne deliği</td><td>Edmund Optics</td><td>#59&ndash; 257</td><td>Uzamsal filtreleme</td></tr><tr><td>Plano dışbükey mercek</td><td>Thorlabs</td><td>LA-4600-UV</td><td>Odaklama lensi</td></tr><tr><td>Plano dışbükey mercek</td><td>Thorlabs</td><td>LA-4663-UV</td><td>Kolimasyon lensi</td></tr><tr><td>Pulser/alıcı</td><td>Imaginant</td><td>DPR300</td><td>Darbe yankı amplifikatörü</td></tr><tr><td>Q-switch diyot pompalı katı hal lazeri</td><td>Parlak Çözümler</td><td>WEDGE HF 266 nm</td><td>266 nm lazer</td></tr><tr><td>Halka şekilli ultrasonik dönüştürücü</td><td>Güney Kaliforniya</td><td></td> Üniversitesi <td>Ultrasonik sinyal algılama</td></tr><tr><td>Numune tutucu</td><td>Laboratuvar yapımı</td><td></td><td>Numune tankını tutun</td></tr><tr><td>Numune tankı</td><td>Laboratuvar yapımı</td><td></td><td>Biyolojik numuneleri tutun</td></tr><tr><td>Tek eksenli Z-translasyon aşaması</td><td>Thorlabs</td><td>PT1</td><td>Manuel aşama</td></tr><tr><td>İki eksenli manuel aşama</td><td>Thorlabs</td><td>LX20</td><td>Manuel aşama</td></tr><tr><td>Su deposu</td><td>Laboratuvar yapımı</td><td></td><td>Ultrasonik sinyal iletimi</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>XX0060</td><td>Numune temizleme</td></tr></tbody></table>

derin Öğrenme destekli sanal boyama ile histolojik görüntüleme için yüksek hızlı ultraviyole fotoakustik mikroskopi

High-Speed Ultraviolet Photoacoustic Microscopy for Histological Imaging with Virtual-Staining assisted by Deep Learning

Tümör rezeksiyon cerrahisinde kanserli dokunun tamamen eksizyonunu doğrulamak için gerekli bir prosedür olan cerrahi sınır analizi (SMA), pozitif cerrahi sınır nedeniyle tekrarlanan ameliyatlardan kaçınmak için intraoperatif tanı araçları gerektirir. Son zamanlarda, DNA / RNA'nın 266 nm dalga boyunda yüksek içsel optik emiliminden yararlanarak, SMA için intraoperatif bir araç olarak büyük umut vaat eden, etiketlemeden yüksek çözünürlüklü histolojik görüntüler sağlamak için ultraviyole fotoakustik mikroskopi (UV-PAM) geliştirilmiştir. SMA için UV-PAM'ın geliştirilmesini sağlamak için, burada, geleneksel optik mikroskopilere benzer şekilde çalıştırılabilen yüksek hızlı ve üstü açık bir UV-PAM sistemi sunulmaktadır. UV-PAM sistemi, tek eksenli galvanometre ayna taraması ile 1,2 μm'lik yüksek yanal çözünürlük ve 55 kHz A-hat hızında yüksek görüntüleme hızı sağlar. Ayrıca, UV-PAM görüntülerinin ek eğitim almadan patologlar tarafından kolayca yorumlanabilmesini sağlamak için, orijinal gri tonlamalı UV-PAM görüntüleri, standart hematoksilin ve eozin boyalı görüntüleri taklit etmek için derin öğrenme algoritması ile neredeyse boyanır ve eğitimsiz histolojik analiz sağlar. Fare beyin dilimi görüntüleme, üstü açık UV-PAM sisteminin yüksek performansını göstermek ve SMA uygulamaları için büyük potansiyelini göstermek için gerçekleştirilir.

Şekil 1 , yüksek hızlı UV-PAM sisteminin şemasını göstermektedir. Bu kurulumda, optik uyarma ve ultrasonik algılama yolları aynı tarafta ve numunenin altındadır ve yansıtıcı bir mod ve üstü açık bir sistem oluşturur. Bu nedenle, kullanıcı dostudur ve kalın numuneleri görüntülemek için uygundur.
Şekil 2 , görüntüleme sırasında UV-PAM sisteminin tarama yörüngesini göstermektedir. Her bölümün alt görüntüsü (örneğin, 5 mm x 30 μm alan) önce dağınık bir enterpolasyon algoritması kullanılarak oluşturulur ve daha sonra, özel görüntü işleme algoritması kullanılarak tüm alt görüntülerin dikilmesiyle bütün bir görüntü (örneğin, 5 mm x 5 mm'lik alan) elde edilir (bkz.
Şekil 3A ve Şekil 3B, her ikisi de 5 x 5mm2'lik bir görüş alanına sahip olan bir FFPE fare beyin diliminin sırasıyla UV-PAM ve H&amp;E görüntülerini göstermektedir. Görüntü işleme algoritmasına Github'dan Malzeme Tablosunda verilen bağlantı aracılığıyla erişilebilir. Görüntü yakalama süresi 18 dakikadan azdı. Şekil 3C-F, tek tek hücre çekirdeklerinin açıkça çözülebildiği Şekil 3A'daki işaretli bölgelerin yakınlaştırılmış görüntülerini göstermektedir. Daha da önemlisi, karşılık gelen hücre çekirdekleri, hücresel görüntüleme için mevcut sistemin yüksek doğruluğunu gösteren standart H &amp; E boyalı görüntülerde (Şekil 3G-J) bulunabilir. Gri tonlamalı UV-PAM görüntüsünü sanal bir H&amp;E boyalı görüntüye aktarmak için, 8000 x 8000 piksellik bir görüntü için 30 sn'den az alan bir derin öğrenme algoritması17 (bkz. İlgili yakınlaştırılmış görüntüler Şekil 3K-N'de gösterilmiştir. Neredeyse lekelenmiş UV-PAM görüntüleri, H&amp;E boyalı görüntülerle neredeyse aynı yapısal bilgileri sağlar ve mevcut UV-PAM sisteminin klinik çevirisi için umut vaat eder.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63649/63649fig01.jpg"> Resim 1: Yüksek hızlı ve üstü açık UV-PAM sisteminin şeması. (A) Sistem kurulumu. (B) Numune tutucunun ve iki eksenli manuel aşamaya tutturulmuş bir su deposunun fotoğrafı. (C) Su tankına sabitlenmiş halka şeklindeki ultrasonik dönüştürücünün ve numune tutucunun deliğini kaplayan numune tankının fotoğrafı. (D) Numune tutucuya yerleştirilecek membran ve numune ile numune tankının fotoğrafı. UV: Ultraviyole; DAQ: Veri toplama kartı; GM: Galvanometre aynası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63649/63649fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63649/63649fig02.jpg"> Resim 2: Görüntüleme sırasında UV-PAM sisteminin tarama yörüngesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63649/63649fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63649/63649fig03.jpg"> Şekil 3: Derin öğrenme tabanlı sanal boyama ile UV-PAM görüntülemenin deneysel sonuçları. (A) FFPE fare beyin diliminin UV-PAM görüntüsü. (B) Aynı dilimin standart H&amp;E boyalı görüntüsü. Ölçek çubukları: 1 mm. (C-F) A'da işaretlenmiş bölgelerin yakınlaştırılmış görüntüleri. (G-J) B'deki işaretli bölgelerin karşılık gelen H&amp;E lekeli görüntüleri. (K-N) Bir derin öğrenme algoritması kullanarak neredeyse lekeli görüntülere karşılık gelir. Ölçek çubukları: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63649/63649fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Sistem konfigürasyonu, optik hizalama, numune hazırlama ve deneysel prosedürler dahil olmak üzere cerrahi marj analizi için intraoperatif olarak histolojik görüntüler sağlayabilen yüksek hızlı ve üstü açık bir ultraviyole fotoakustik mikroskop gösterilmiştir.

Derin Öğrenme destekli Sanal Boyama ile Histolojik Görüntüleme için Yüksek Hızlı Ultraviyole Fotoakustik Mikroskopi

Surgical margin analysis (SMA), an essential procedure to confirm the complete excision of cancerous tissue in tumor resection surgery, requires ...

İntraoperatif cerrahi monitör analizi, tümör rezeksiyon ameliyatlarında hala büyük bir zorluktur, çünkü kanserli dokunun karmaşık eksizyonunu doğru ve hızlı bir şekilde doğrulamak için bir tanı aracı gerektirir. Daha sonra pozitif bir cerrahi marj nedeniyle tekrarlanan ameliyatlardan kaçınmak mümkündür. Yüksek hızlı üstü açık ultraviyole fotoakustik mikroskopimiz, beş ila beş milimetre karelik bir görüntüleme alanıyla 18 dakika içinde doku örneklerinin etiketli histolojik görüntülerini sağlayabilir ve bu da intraoperatif cerrahi marj analizi için büyük potansiyel gösterir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan son sınıf doktora öğrencisi Xiufeng Li olacak. Uyarma kaynağı olarak 266 nanometre dalga boyuna sahip bir Q-anahtarı diyot pompalı katı hal lazeri kullanarak mikroskobik sistem için optik aydınlatmayı ayarlayarak başlayın. Lazer ışınını genişletmek için iki dışbükey lens takın ve uzamsal filtreleme için ilk dışbükey lensin odak noktasına yakın bir iğne deliği yerleştirin.Lazer ışınını yukarı doğru yansıtmak için 1D galvanometre aynası kullanın. Objektif lensin yardımıyla, lazer ışınını bir numuneye odaklayın. Halka şeklindeki odaklanmış UT'yi, aktif alan yukarı bakacak şekilde, altta ince bir kuvars kapak kayması ile kaplanmış optik olarak şeffaf bir pencereye sahip laboratuar yapımı bir su deposuna sabitleyin, ardından UT'nin yanal konumunu kontrol etmek için su deposunu mikroskobun iki eksenli manuel aşamasına takın. İşiniz bittiğinde, UV lazerini açın ve lazer ışınının UT'nin merkezinden geçmesine izin vermek için UT'nin konumunu ayarlayın, ardından UV lazerini kapatın ve UT'yi tamamen batırmak için su deposunu deiyonize suyla doldurun. Toplam 56 desibel kazanç elde etmek için UT'nin çıkışını iki amplifikatöre bağlayın ve ardından ikinci amplifikatörün çıkışını bilgisayarda yüklü bir veri toplama kartına veya DAQ'ya bağlayın.Daha sonra, xy motorlu aşamalara bağlı bir z ekseni manuel aşamasına bir numune tutucu takın ve ardından numune tutucunun boş deliğini çevreleyen dört parça çift taraflı bant yerleştirin. Daha sonra, siyah bandı bir cam slayta takarak ve ardından cam sürgüyü numune tutucunun deliğini siyah bant aşağı bakacak şekilde kaplayacak şekilde yerleştirerek sistemi hizalamaya devam edin. Numune tutucu üzerindeki cam kaydırağa bastıktan sonra, cam sürgüyü suya batırmak için numune tutucuyu indirin.Halka şeklindeki UT ve amplifikatörlerin bağlantısını kesin, ardından UT'yi pulser/alıcıya ve pulser/alıcının çıkışını bir osiloskopa bağlayın. Darbeyi/alıcıyı, darbe genliği altı ve kazanç 20 desibel olan darbe yankısı modunda çalıştırın. Parametreler ayarlandıktan sonra, numune tutucunun z-konumunu ayarlayın, ultrasonik sinyallerin maksimum olduğu akustik odak düzleminin konumunu tanımlayın.Kazancı 60 desibel'e ayarlamadan önce darbeyi/alıcıyı iletim moduna getirin, ardından lazer çıkışını etkinleştirin ve osiloskop tarafından ölçülen fotoakustik veya PA sinyallerini en üst düzeye çıkarmak için objektif lensin z-konumunu ayarlayın. Üretilen PA sinyalini simetrik ve maksimum yapmak için, halka şeklindeki UT'nin yanal konumunu ayarlayın, ardından PA sinyallerini en üst düzeye çıkarmak için numune tutucunun z konumunu ayarlayın. PA sinyallerinin simetrisini ve genliğini optimize etmek için objektif lensin ve numune tutucunun z-konumu için ayarlamaları tekrarlayın.PA sinyalleri optimize edildiğinde, zaman gecikmesini veya PA dalgalarının osiloskoptaki UT'ye ulaşmak için harcadığı süreyi kaydedin. Siyah bandın farklı konumlarını görüntülemek için numune tutucuyu hareket ettirin. Numune tutucuların düzlüğünü, siyah bandın her bir konumundan üretilen PA sinyalleri daha önce ölçülenle aynı zaman gecikmesine sahip olacak şekilde ayarlayın.Sistem hizalaması tamamlandıktan sonra, lazeri kapatın ve UT'yi iki amplifikatöre bağlayın. Formalin ile sabitlenmiş ve parafin gömülü bir fare beyin dilimi hazırlamak için, hasat edilen beyni% 10 nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin. 24 saat sonra, sabit beyni derecelendirilmiş alkolle dehidrasyon, ksilen ile temizleme ve parafin ile gömme yoluyla işleyin.Gömülü beynin beş mikrometre kalınlığında dilimlerini elde etmek için bir mikrotom kullanın. Numune dilimlerini kuvars slaytlarının üzerine yerleştirin ve bir saat boyunca 60 santigrat derecede bir fırında kurutun. Daha sonra, parafinin yüksek arka plan sinyallerini önlemek için beyin bölümlerini bir temizleme maddesi ile parafin de-paraffinize edin.Taze bir fare beyin dilimi hazırlamak için, hasat edilen fare beynini PBS ile yıkayın ve ardından beyin örneğinin beş milimetre kalınlığındaki bir dilimini elle kesin, ardından enine kesitteki kanı çıkarmak için beyin dilimini PBS ile yıkayın. Numune yerleştirme için, 10 mikrometre kalınlığında UV şeffaf polietilen membranlı laboratuvar yapımı bir numune tankı hazırlayın, ardından membrana bir damla su ekleyin ve biyolojik numuneyi suyu örtmek için numune tankına yerleştirin. Ardından, numune içeren tankı, numune tutucunun boş deliğini kapatacak şekilde numune tutucunun üzerine yerleştirin.UV lazeri harici tetik moduna ayarlayın ve tarama parametrelerini makalede açıklandığı gibi ayarlamak için laboratuarda oluşturulan laboratuvar görünümü programını kullanın. X ve y eksenli motorların hareketli adım sayısını ayarlayarak küçük bir bölgede deneme taramasını başlatın, ardından maksimum PA sinyalleri elde etmek için numuneyi odak düzlemine yerleştirmek üzere z ekseni manuel aşamasını ayarlayın. Hem x hem de y eksenli motorları istenilen başlangıç noktasına taşıdıktan ve xn ve yn değerlerini ayarlayarak tarama bölgesini ayarladıktan sonra görüntü alma programını başlatın.Görüntüler gerektiğinde, lazeri kapatın ve numune tutucuyu çıkarın. Taze biyolojik dokuları% 10 nötr tamponlu formalin içinde saklayın. Laboratuvarda oluşturulan bir görüntü işleme algoritmasının yardımıyla maksimum genlikli projeksiyon görüntüsünü yeniden oluşturmak için toplanan PA sinyallerini kullanın.Temsili analiz, bir FFPE fare beyin diliminin UV-PAM ve H&E görüntülerini gösterir. Yakınlaştırılmış UV-PAM görüntüsünde, tek tek hücre çekirdekleri çözülebilir. Karşılık gelen hücre çekirdekleri, standart H & E boyalı görüntülerde bulundu ve hücresel görüntüleme için mevcut sistemin yüksek doğruluğunu gösterdi.Gri tonlamalı UV-PAM görüntüsünü sanal bir H&E boyalı görüntüye aktarmak için derin öğrenme algoritması uygulandı. UV ışığının sistem hizalaması sırasında bir merkezden geçmesine izin vermek için halka şeklindeki ultrasonik dönüştürücünün konumunu ayarlamak önemlidir. Bu, algılanabilir bir fotoakustik sinyalin elde edilebilmesini ve lazer açıkken daha da optimize edilmesini sağlar.Sınıflandırma algoritmamız, görüntülerdeki tümörü ve normal bölgeleri sınıflandırmak için daha da dahil edilebilir ve tıp uzmanları için yardımcı bir görüntüleme ve tanı platformu olarak hizmet eder.

high-speed-ultraviolet-photoacoustic-microscopy-for-histological

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Optik çözünürlüklü foto akustik mikroskobu (OR-PAM), görüntüleme optik soğurma yeteneğine sahip gelişmekte olan bir teknoloji...

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Photoacoustic oftalmoloji (PAOM), optik-soğurma tabanlı görüntüleme yöntemi, şu anda mevcut oftalmik görüntüleme teknolojileri retinanın tamamlayıcı değerlendirilmesini sağlar. Biz sıçanlarda eşzamanlı multimodal retina görüntüleme için spektral domain optik koherens tomografi (SD-OCT) ile entegre PAOM kullanılarak rapor.

Entegre Photoacoustic Oftalmoskopi ve Spektral-domain optik koherens tomografi

Burada, cam üzerinde özetlenen NK hücrelerinin sitotoksik immün sinapsı olan iki renkli STED nanoskobu ile görüntüleme protokolünü gösteriyoruz. Bu yöntemi kullanarak, sinaps proteinlerinin ve hücre iskeletinin 100 nm altında çözünürlüğünü elde ediyoruz.

Çift Renkli Zaman-kapılı Uyarılmış Emisyon tükenmesi (STED) Nanoscopy tarafından İmmünoloji Synapse görselleştirme

Yetişkin farelerin lenf düğümlerinde 120 um derinliğe kadar kontrastlı sahip yüksek-çözünürlüklü intravital görüntüleme uzamsal bir multi-odak iki foton mikroskop uyarım modelini modüle edilmesi ile elde edilir. 100 mikron derinliğinde biz böylece saçılma ve difraksiyon sınırlarını engellemeyi, 487 nm çözünürlük (lateral) ve 551 nm (eksenel) ölçüldü.

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Burada, gerçek zamanlı olarak üç boyutlu fonksiyonel ve moleküler görüntüleme için yeni geliştirilmiş bir el tipi optoakustik (fotoakustik) sistemle görüntüleme için deneysel protokolün ayrıntılı bir tanımını sunuyoruz. Gösterilen güçlü performans ve çok yönlülük, optoakustik teknolojinin klinik öncesi araştırma ve klinik uygulamada yeni uygulama alanlarını tanımlayabilir.

Evrensel Real Time Derin Doku İnsan Anjiografi ve Fonksiyonel Preklinik Çalışmalar üç boyutlu Optoacoustic Görüntüleme Probe El

Bu protokol, vakumla stabilize edilmiş bir görüntüleme penceresi kullanarak sağlam akciğerin gerçek zamanlı olarak uzun süreli yüksek çözünürlüklü, tek hücreli görüntülemesini gerçekleştirmek için çoklu foton mikroskobunun kullanımını açıklar.

Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi

Burada sığ derinlikte hem yüksek çözünürlüklü hem de in vivo aynı numunede düşük çözünürlüklü derin doku görüntülemeye muktedir anahtarlanabilir akustik çözünürlük (AR) ve optik çözünürlük (OR) fotoakustik mikroskopi (AR-OR-PAM) sistemi gösterilmiştir.

Için değiştirilebilir Akustik ve Optik Çözünürlük Fotoakustik Mikroskopi<emIn vivo</em&gt; Küçük Hayvan Kan Vaskülatür Görüntüleme

Klinik bir el photoacoustic görüntüleme sistemi gerçek zamanlı non-invaziv küçük hayvan görüntüleme için gösterilecektir.

Görüntüleme sistemi gerçek zamanlı Non-invaziv küçük hayvan görüntüleme için el klinik Photoacoustic

Geniş alan görüntüleme ve gerçek zamanlı görüntülemeyi entegre eden çift raster taramalı fotoakoustik görüntüleyici tasarlanmıştır.

Vasküler Görselleştirme için Çift Raster Taramalı Fotoakoustik Küçük Hayvan Görüntüleyici

Burada açıklanan, immünofloresan mikroskobu ile beş veya daha fazla floresan parametreyi görüntülemek için kullanılabilecek bir yöntemdir. Bu görüntülerden tek hücrelerin çıkarılması ve doku bölümlerindeki hücre alt kümelerini tanımlayabilen akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri yoluyla tek hücre analizi yapmak için bir analiz boru hattı ana hatlarıyla belirtilmiştir.

Histoflow Sitometri ile Yüksek Parametreli Histoloji Görüntülerinin Oluşturulması ve Analiz Edilmesi

Keşfedin yüksek hızlı açık üst UV fotoakustik mikroskopi ile derin öğrenme destekli sanal boyama yöntemini. Bu sistem, 18 dakikada histolojik görüntüleme sağlayarak cerrahi marjin analizinde kullanılır.

Derin Öğrenme destekli Sanal Boyama ile Histolojik Görüntüleme için Yüksek Hızlı Ultraviyole Fotoakustik Mikroskopi

Daha fazla video keşfet