Name: Aedes albopictus Hücre Hatlarında Wolbachia Suşu wAlbBnin Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Öğrenin, Aedes albopictus hücre hatlarında Wolbachia wAlbB suşunun dört tamamlayıcı yöntemle nasıl tespit edildiğini. Bu protokol, enfeksiyon doğruluğunu artırarak hücre biyolojisi ve mikrobiyoloji araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Minnesota Üniversitesi'nden Dr. Xin-Ru Wang'a anlayışlı önerileri ve rehberliği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (No.81760374) bir hibe ile desteklenmiştir.

1. Malzemeler ve reaktifler
<ol><li>Hücre kültürü için pirojensiz çözeltiler ve ortamlar kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Tüm çözeltileri hazırlamak için ultra saf su kullanın.</li>
	<li>Çok kontrol işlemini takiben, hücre kültürü için fetal sığır serumu (FBS) seçerken dikkatli olun. NOT: FBS lotları düzenli olarak değişikliğe tabi olduğundan, bu protokolde ilgili katalog ve lot numaralarını belirtmek mümkün değildir.</li>
	<li>Wolbachia içermeyen Aa23-T'ye karşılık gelen A. albopictus yumurtalarından türetilen Aa23 hücre suşlarını seçin.</li>
</ol>2. Hücre kültürü
<ol><li> FBS ile 4 mL Schneider ortamı ile25 cm2 hücre kültürü şişeleri hazırlayın.</li>
	<li>Şişeleri 28 ° C'de% 5 CO2 atmosferi altında 5 ila 7 gün 7,24 boyunca inkübe edin.</li>
	<li>100x büyütmede ışık mikroskobu kullanarak şişelerdeki lekesiz Aa23 ve Aa23-T hücrelerini gözlemleyin (Şekil 1).</li>
</ol>3. DNA ekstraksiyonu
<ol><li>Şişe başına% 70-80 birleşene kadar hücreleri 5-7 gün boyunca kültürleyin (adım 2). Hücreleri, bir mikrosantrifüjde 100 × g'da 5 dakika santrifüjleme yoluyla 1 mL yeniden askıya alınmış kültür ortamından manuel pipetleme ile toplayın.</li>
	<li>Süpernatantı aspirasyonla çıkarın ve elde edilen hücre peletini -20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Peletleri 0.40 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden askıya alın, çözeltinin 50 μL'sini bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, 5 μL proteinaz K (20 mg / mL) ekleyin ve 1 saat boyunca 55 ° C'de inkübe edin. Son olarak, ham DNA'yı elde etmek ve -20 ° C'de saklamak için bu tüpleri 99 ° C'de 15 dakika ısıtın.</li>
</ol>4. Wolbachia nükleik asidinin tespiti
<ol><li>PCR analizi<ol>
<li>8 μL ddH2O, 10 μL Taq polimeraz (Malzeme Tablosuna bakınız), 1 μL DNA şablonu (adım 3'ten), 0,5 μL ileri ve geri primerler (10 μM) içeren toplam 20 μL'lik reaksiyon hacminde PCR gerçekleştirin: wsp81 F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') ve wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, sırasıyla.</li>
		<li>Aşağıdaki PCR koşullarını kullanın: 5 dakika boyunca 95 ° C'de ilk denatürasyon, ardından 94 ° C'de 35 döngü denatürasyon, 55 ° C'de tavlama ve 72 ° C'de uzatma; daha sonra, 7 dakika boyunca 72 ° C'de son bir uzatma.</li>
		<li>Bir jel görüntüleyici kullanarak% 1'lik bir agaroz jeli (PBS'de % 1 w / v agaroz) üzerindeki DNA'yı tespit edin.</li>
	</ol></li>
	<li>qPCR analizi<ol>
<li>Ekstrakte edilen DNA'dan (adım 3) üç biyolojik replikasyon (n = 6) için Wolbachia genom kopyasını, sırasıyla risozomal protein S6 (RPS6) ileri ve geri primerler (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' ve 5' GAGATGGTCAGGGTGATTT 3', 5' GAGATGGTCAGGGTGATTT 3', sırasıyla) ile normalleştirilmiş wsp primerleri 183 F (5' AAGGAACCGAAGGTTTCTG 3') ve QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22 kullanarak analiz edin.</li>
		<li>wAlbB ve RPS6 için standart bir eğri oluşturun.<ol>
<li>PMD-18T'den (PCR ürünlerinin verimli klonlanması için özel bir vektör (TA klonlaması)) wsp ve rps6 gen fragmanları içeren rekombinant plazmidden (Ek Dosya) DNA ekstraksiyonu yapın ve plazmid DNA konsantrasyonunu ölçün (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
			<li>Plazmid DNA konsantrasyonunu Eq (1) kullanarak kopya sayısı konsantrasyonuna dönüştürün. Plazmid kopya sayısı = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63662/63662eq01v3.jpg"> (1)</li>
			<li>Plazmid kopya numarasını 10 1'den10 8'e kadar ultra saf suyla seyreltin ve her konsantrasyon gradyanı için 3 kopya ayarlayın.</li>
			<li>TB Green ve gerçek zamanlı bir PCR sistemi kullanarak qPCR amplifikasyonu gerçekleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve her reaksiyonun sonuçlarını kaydedin. Standart bir eğri geliştirmek için Ct değerini kullanın. DNA'yı, 7 μL ddH 2 O, 10.4 μL TB Yeşil (Malzeme Tablosuna bakınız), 1 μL DNA şablonu (Adım 3 tarafından sağlanmıştır) ve 0.8 μL ileri ve geri primerlerden (10 μM) oluşan toplam20μL'lik bir reaksiyon hacminde analiz edin. Aşağıdaki reaksiyon koşullarını kullanın: 5 dakika boyunca 95 °C'de ilk denatürasyon, ardından 10 s için 95 °C'de 40 döngü denatürasyon ve 35 s için 60 °C'de tavlama.</li>
			<li>Hücrelerdeki WSP ve RPS6 gen kopya numaralarını, belirlenen standart eğriye göre ve Wolbachia bağıl yoğunluğunu wsp/RPS6'nın kopya sayısına göre hesaplayın. Bağımsız bir örnek t-testi kullanarak verileri analiz edin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Wolbachia proteininin Batı lekesi analizi<ol>
<li>Protein ekstraksiyonu<ol>
<li>Bir mikrosantrifüj tüpünde altı delikli plakadan (adım 2'den itibaren) 2 × 107 Aa23 ve Aa23-T hücrelerini toplayın, PBS ile üç kez yıkayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 100 × g'de santrifüj yapın.</li>
			<li>RIPA lizis tamponu (50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl,% 1 Triton X-100,% 1 sodyum deoksikolat,% 0.1 sodyum dodesil sülfat [SDS], 2 mM sodyum pirofosfat, 25 mM β-gliserofosfat, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 0.5 μg / mL leupeptin) ve PMSF (son konsantrasyon 1 mM) ile 1 mL lizat hazırlayın.</li>
			<li>Hücre peletine 200 μL lizis tamponu ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika bekletin. Lisatları 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Süpernatantın wsp konsantrasyonunu, üreticinin talimatlarını izleyerek bir biskinkoninik asit (BCA) protein tahlil kiti kullanarak (Malzeme Tablosuna bakınız) test edin.</li>
		<li>% 15'lik bir SDS-PAGE jeline eşit miktarda protein yükleyin [% 10 damıtılmış su; % 50 (% 30 Acr-Bis (29:1), % 38 1 M Tris, pH 8.8; % 1 (% 10 SDS),% 1 (% 10 amonyum persülfat), % 0.04 TEMED].</li>
		<li>Proteini nitroselüloz membranlara aktarın, membranları oda sıcaklığında 2 saat26,27 saat% 5 yağsız sütle bloke edin ve ardından membranları TBST ile üç kez yıkayın (1 L TBS'de 1 mL Ara 20) (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
		<li>Membranları 4 ° C'de gece boyunca 100 μL anti-wsp poliklonal antikoru ile inkübe edin (şirket içinde hazırlanan, Ek Dosya'ya bakınız)), primer antikorun% 5 yağsız sütle seyreltilmesiyle hazırlanan (1: 12.000).</li>
		<li>Birincil antikoru TBST ile üç kez yıkayın.</li>
		<li>Membranları, oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde 100 μL yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge sekonjuge sekonder antikor içinde inkübe edin.</li>
		<li>Membranları TBST ile üç kez yıkayın ve kemilüminesans tespit kitinde 20 μL çözelti A (HRP Substrat Luminol Reaktifi) ve 20 μL çözelti B (HRP Substrat Peroksit Reaktifi) 1:1 oranında karıştırın. Tüm membranı aynı anda lüminesans çözeltisine daldırın ve çok işlevli bir görüntüleme sistemi kullanarak sinyalleri gözlemleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Wolbachia proteininin immünofloresan lokalizasyonu<ol>
<li>5 × 105 Aa23 ve Aa23-T hücrelerini 28 °C'de, altta 0,17 mm kalınlığında bir Lazer konfokal Petri kabı üzerinde, 3 ila 4 gün boyunca %5 CO 2 atmosferi altında 7,24 oranında inkübe edin. Hücre% 60 -% 70 birleşene kadar bekleyin ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.</li>
		<li>PBS'de hücreleri 4 °C'de 20 dakika boyunca 1 mL% 4 (w / v) paraformaldehit içinde sabitleyin.</li>
		<li>Sabit hücreleri PBST kullanarak (PBS'de% 0.2 v / v Triton X-100) 5 dakika boyunca yıkayın ve hücreleri PBS ile iki kez tekrar yıkayın.</li>
		<li>PBS'de kızakları 1 mL'lik %3 (w/v) sığır serum albümininde 37 °C'de 1 saat boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Slaytları gece boyunca 100 μL fare anti-wsp poliklonal antikoru (şirket içinde hazırlanan) ve fare serumunda (PBS'de 1:1.000 seyreltme) ıslak bir kutuda (nemi koruyabilir ve nemin buharlaşmasını önleyebilir) 4 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Slaytları ıslak kutudan çıkarın ve oda sıcaklığına geri getirin; PBS ile üç kez yıkayın ve PBS'yi çıkarın. NOT: Adım 4.4.7'den itibaren, tüm işlemler ışıktan korunmalıdır.</li>
		<li>Slaytları, 30 dakika boyunca 37 °C'de 100 μL Alexa Fluor 488 konjuge keçi anti-fare antikoru (PBS'de 1:2.000 seyreltme) ile inkübe edin.</li>
		<li>Numune slaytlarını 5 dakika boyunca 37 ° C'de 50 μL 4',6-diamidino-2-fenilindol (PBS'de 10 μg / mL'ye seyreltilmiş DAPI, DNA'ya güçlü bir şekilde bağlanır) ile 5 dakika boyunca inkübe edin ve ardından PBS ile üç kez yıkayın.</li>
		<li>İmmünoboyamayı konfokal mikroskop altında gözlemleyin.<ol>
<li>Gücü ve lazeri açın.</li>
			<li>Mikroskobun normal ve cıva lambalarını açın.</li>
			<li>Sistemi başlatın ve işletim yazılımını çalıştırın. Numune slaytlarına bir damla sedir yağı koyun, numune slaytlarını mikroskop aşamasına yerleştirin ve sahneyi uygun konuma getirin.</li>
			<li>Yazılımdaki cıva lambası gözlem düğmesine tıklayın, cıva lambası deklanşörünü açın ve odaklanmak için ters çevrilmiş bir mikroskop altında numuneyi gözlemleyin.</li>
			<li>100x büyütmenin altında floresan fotoğrafları çekmek üzere yeşil ve mavi floresanı seçmek için manuel kontrol panelini kullanın.</li>
			<li>Cıva lambası gözlem düğmesini kapatın ve görüntüleri almaya başlayın.</li>
			<li>İyi görüntü kalitesi sağlamak için, tarama boyutuna göre ön tarama yapın (512 piksel x 512 piksel). Net görüntüler elde etmek için tarama boyutunu ayarlayın (1.024 piksel x 1.024 piksel).</li>
			<li>Arka plan gürültüsü çok yüksekse gürültü azaltma işlemini gerçekleştirin.</li>
			<li>Taramayı durdurun ve görüntüleri kaydedin.</li>
			<li>Cıva lambasını ve lazerleri kapatın.</li>
			<li>Hedefi u alkolle silin ve hedefi en düşük konuma indirin.</li>
			<li>Deklanşör ve mikroskop gücünü kapatın.</li>
			<li>Cihaz soğuduktan sonra, toz kapağıyla örtün.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Invertebrate+Patholology%22%5BJournal%5D)">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li>
<li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+Biologial+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li>
<li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li>
<li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li>
<li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evoution%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li>
<li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li>
<li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+Developmental+Biology+-+Animals%22%5BJournal%5D)">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li>
<li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+species+are+infected+with+Wolbachia%3F-A+statistical+analysis+of+current+data%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li>
<li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia%3A+master+manipulators+of+invertebrate+biology%5BTitle%5D)+AND+%22National+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li>
<li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li>
<li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aO%27Neill%2C+SL+%22Influential+passengers%3A+inherited+microorganisms+and+arthropod+reproduction%22">Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction</a>. , Oxford University Press. (1997).</li>
<li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+insecticides%3A+new+thinking+on+an+ancient+problem%5BTitle%5D)+AND+%22National+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li>
<li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li>
<li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li>
<li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li>
<li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li>
<li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043(2011).</li>
<li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833(2010).</li>
<li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue%2C+Chikungunya%2C+and+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li>
<li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459(2013).</li>
<li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase%2C+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li>
<li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li>
<li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754(2012).</li>
<li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Vectors%22%5BJournal%5D)">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483(2019).</li>
<li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22The+Royal+Society+Publishing.+Proceedings+B%22%5BJournal%5D)">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li>
<li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach%2C+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li>
<li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University+Science+B%22%5BJournal%5D)">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).</li>
<li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li>
<li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li>
<li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immunofluorescence%2C+Western+blotting%2C+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Hücre içi Wolbachia enfeksiyonunun saptanması, Wolbachia-konakçı etkileşimlerinin incelenmesi ve yeni suşlarla hücrelerin başarılı transfeksiyonunun doğrulanması için gereklidir. Bu protokolde, nükleik asit ve protein seviyelerinde hücre içi Wolbachia enfeksiyonunu başarılı bir şekilde tespit etmek için dört yöntem kullanılmıştır. Bu dört deneysel yöntem, hücrelerin Wolbachia enfeksiyonunun tespit doğruluğunu doğruladı ve geliştirdi.
PCR, nükleik asit seviye...

Asya kaplan sivrisineği Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), Asya'da ve dünyanın diğer bölgelerinde dang virüsünün (DENV) önemli bir vektörüdür1, germ hattı ve somatik doku2,3 boyunca dağılmış iki tür hücre içi bakterinin, Wolbachia'nın (wAlbA ve wAlbB) doğal bir konakçısıdır. A. albopictus embriyolarından türetilen Aa23 hücre hattı, her ikisi de enfeksiyon4'ü destekleyen ve antibiyotik (Aa23-T) kullanılarak doğal Wolbachia enfeksiyonundan tedavi edilebilen en az iki morfolojik hücre tipinden oluşur. Aa23'ün sadece wAlbB'yi koruduğu göz önüne alındığında, konakçı-endosimbiyont etkileşimlerinin incelenmesi için yararlı bir modeldir 4,5,6.
Wolbachia maternal olarak bulaşır ve böcek türlerinin tahmini% 65'inienfekte eder 8,9 ve sivrisinek türlerinin% 28'i 10. Çeşitli dokuları enfekte eder ve konakçı ile yakın bir simbiyotik ilişki oluşturur, genellikle konakçı üreme sistemini manipüle ederek sitoplazmik uyumsuzluğa (CI)11 ve popülasyon replasmanına neden olur12,13. Bu konakçı tepkileri, Drosophila simulans14'ün doğal popülasyonlarında ve A. aegypti'de bir laboratuvar kafesi ve saha denemesi15'te gözlenmiştir. Wolbachia tarafından ortaya çıkarılan önemli bir üreme dışı manipülasyon, DENV, Chikungunya virüsü (CHIKV) ve Batı Nil virüsü (WNV) 16,17 dahil olmak üzere çeşitli patojenlere karşı konakçı direncine neden olur; bu, simbiyont 18,19'un gelişmiş doğuştan gelen bağışıklık sistemi, Wolbachia ve virüsler arasında temel konakçı kaynakları için rekabet 20 ve konakçı viral savunma yollarının manipülasyonu 21 .
Bu protokol, Wolbachia kaynaklı konakçı antiviral yanıtlarının bu altta yatan mekanizmalarını incelemek için geliştirilmiştir. Aa23 hücrelerinin hücre içi Wolbachia enfeksiyonunun tespitinde dört yöntem kullanır. Bu yöntemler, diğer konakçı türlerin hücre içi Wolbachia enfeksiyonu çalışmaları için güçlü bir teorik temel sağlar. İlk yöntem olan PCR - geleneksel klonlama prosedürlerini kullanmadan DNA'nın belirli bölgelerinin enzimatik amplifikasyonuna izin veren güçlü bir teknik - Wolbachia DNA'sını tespit etmek ve Wolbachia enfeksiyonunun varlığını / yokluğunu belirlemek için kullanıldı22. İkinci yöntem, PCR23'ten önceki şablon miktarıyla doğru orantılı olan her PCR döngüsü sırasında üretilen ürünlerin güvenilir tespiti ve ölçümü için kantitatif PCR (qPCR) kullanarak Wolbachia DNA kopya yoğunluğunu ölçer. Üçüncü yöntem, elektroforezin yüksek ayırma gücünü, antikorların özgüllüğünü ve kromojenik enzimatik reaksiyonların duyarlılığını birleştirerek karmaşık karışımlardaki spesifik proteinleri tespit etmek için en güçlü araçlardan biri olan western blot'u kullanarak hücre içi Wolbachia proteinlerinin varlığını tespit eder. Son yöntem, Wolbachia'nın hücresel alımını doğrulamak ve hücresel lokalizasyonunu belirlemek için Wolbachia yüzey proteinini (wsp) bir antijen-antikor reaksiyonu yoluyla tespit etmek için immünoloji, biyokimya ve mikroskopiyi birleştiren bir immünofloresan testidir (IFA).
Bu makalede, hücrelerde Wolbachia'nın varlığını doğrulamak için yukarıda listelenen dört yöntem açıklanmaktadır; bu, eksojen Wolbachia'nın başarılı bir şekilde transfekte edilip edilmediğini ve hücredeki Wolbachia'nın temizlenip temizlenmediğini tespit etmek için kullanılabilir. Wolbachia'nın hücrelerde mevcut olup olmadığını belirledikten sonra, genomik, proteomik veya metabolomik dahil olmak üzere çeşitli farklı analizler yapılabilir. Bu protokol, Wolbachia'nın Aa23 hücreleri aracılığıyla tespit edilmesini gösterir, ancak diğer hücrelerde de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Fisher Scietific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Pipetman</td><td>F167380</td><td>P10</td></tr><tr><td>inSituX platformu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analiz yazılımı</td><td>Şirket içinde geliştirilen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seryum katkılı itriyum alüminyum granat</td><td>MSE Malzemeleri</td><td></td><td>Ce:Y3Al5O12, YAG tek kristal yüzeyler</td></tr><tr><td>Çip tutucu</td><td>Kurum içi geliştirilen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontrol yazılımı</td><td>Kurum içi geliştirilen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Daldırma yağı</td><td>Cargille Laboratories</td><td>16482</td><td>Tip A düşük viskozite 150 cSt</td></tr><tr><td>inSituX platformu</td><td>Şirket içi geliştirilen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR ışık kaynağı&nbsp;</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>Cam Lensli LED, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td></tr><tr><td>Dış halka&nbsp;</td><td>Şirket içinde geliştirilen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa lazerleri&nbsp;</td><td>Thorlabs Anonim Şirketi</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm, 400 mW, ve Oslash; 9 mm, E Pin Kodu, Lazer Diyot</td></tr><tr><td>Raspberry Pi</td><td>Raspberry Pi Fonlama</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tutma halkası</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>SM1 tutma halkası & Oslash için; 1" lens tüpleri ve yuvaları</td></tr><tr><td>Çekirdeksiz kuvars kristali</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>25,4 mm çap Z-kesim 0,05 mm kalınlık çift taraflı cila 8 mm on -X</td></tr><tr><td>Şim</td><td>Şirket içi geliştirilen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-ışını huzme durdurucu</td><td>Şirket içi geliştirildi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aedes albopictus hücre hatlarında wolbachia suşu walbb'nin tespiti

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Anne tarafından barındırılan bir endosimbiyont olarak Wolbachia, böcek popülasyonlarının büyük bir bölümünü enfekte eder. Çalışmalar son zamanlarda Wolbachia-transfekte sivrisinekler kullanarak RNA virüsü iletiminin başarılı bir şekilde düzenlendiğini bildirmiştir. Virüsleri kontrol etmek için anahtar stratejiler, sitoplazmik uyumsuzluk yoluyla konakçı üremesinin manipülasyonunu ve immün hazırlama yoluyla viral transkriptlerin inhibisyonunu ve konakçı kaynaklı kaynaklar için rekabeti içerir. Bununla birlikte, Wolbachia-transfekte sivrisineklerin viral enfeksiyona verdiği yanıtların altında yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu yazıda, Wolbachia ve böcek vektörleri arasındaki etkileşimlerin anlaşılmasını arttırmak için Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 hücrelerinde nükleik asit ve protein düzeylerinde Wolbachia enfeksiyonunun in vitro tanımlanması için bir protokol sunulmaktadır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), kantitatif PCR, batı lekesi ve immünolojik analitik yöntemlerin kombine kullanımı sayesinde, Wolbachia ile enfekte olmuş hücrelerin tespiti için tek bir yöntemin kullanılmasından daha doğru olan standart bir morfolojik protokol tanımlanmıştır. Bu yaklaşım, diğer böcek taksonlarında Wolbachia enfeksiyonunun tespitine de uygulanabilir.

Wolbachia tespit edilmeden önce, iki hücre hattı arasındaki morfolojik farklılıkları belirlemek için Aa23 ve Aa23-T hücreleri ışık mikroskobu altında gözlendi. Aa23 ve Aa23-T hücreleri en az iki hücre morfolojisine sahiptir, ancak iki hücre tipi arasında belirgin bir morfolojik fark yoktur (Şekil 1). Burada, Aa23 hücreleri, Wolbachia enfeksiyonunu dört yöntem kullanarak tespit etmek için model bir sistem olarak kullanılmıştır. Wolbachiawsp geninin ...

Hücre içi Wolbachia'yı tespit etmek için birbirini tamamlayan ve Aedes albopictus'tan türetilmiş Aa23 ve Aa23-T'nin Wolbachia enfeksiyonunun antibiyotik kullanılarak tedavi edilen Wolbachia enfeksiyonunun tespit doğruluğunu artıran dört yöntem kullanıldı.

Aedes albopictus Hücre Hatlarında Wolbachia Suşu wAlbB'nin Tespiti

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Bu protokol, Wolbachia ve konakçısı arasındaki etkileşimi anlamanın temeli olan hücrelerde Wolbachia'nın varlığını doğrulamaya yardımcı olur. Bu protokolde, hücre içi Wolbachia enfeksiyonunu başarılı bir şekilde tespit etmek için dört yöntem kullanıldı ve bu da hücrelerin Wolbachia enfeksiyonunun tespit doğruluğunu doğruladı ve geliştirdi. Prosedürü gösteren, Modern Patojen Biyolojisi ve Özellikleri Anahtar Laboratuvarı'ndan mezun olan Qiuqiu Xiao olacak.Işık mikroskobu kullanarak lekesiz Aa23 ve Aa23-T hücrelerini 100x büyütmede gözlemleyerek başlayın. Şişe başına% 70 ila% 80 birleşmeye ulaşmak için hücreleri beş ila yedi gün boyunca kültürleyin. Bir pipet kullanarak, kültür ortamının 1 mL'sini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Hücreleri toplamak için beş dakika boyunca 100 RCF'de santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve elde edilen hücre peletini eksi 20 santigrat derecede saklayın. Şişe başına% 90 ila% 100 birleşmeye ulaşmak için hücreleri beş ila yedi gün boyunca kültürleyin.Peletleri 0.40 mL PBS'de yeniden askıya alın ve bu çözeltinin 50 mikrolitresini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Beş mikrolitre 20 mg / mL proteinaz K ekleyin ve bir saat boyunca 55 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra ham DNA'yı elde etmek ve eksi 20 santigrat derecede saklamak için tüpleri 15 dakika boyunca 99 santigrat derecede inkübe edin.PCR'yi gerçekleştirmek için, 20 mikrolitrelik toplam reaksiyon karışımı hazırlayın ve PCR koşullarını metin makalesinde açıklandığı gibi ayarlayın. Bir jel görüntüleyici kullanarak% 1'lik bir agaroz jeli üzerindeki DNA'yı tespit edin. Gerçek zamanlı bir PCR sisteminde TB Green kullanarak kantitatif PCR amplifikasyonu gerçekleştirin ve her reaksiyonun sonuçlarını kaydedin.DNA'yı toplam 20 mikrolitrelik bir reaksiyon hacminde analiz edin ve metin makalesinde açıklandığı gibi kantitatif PCR koşullarını ayarlayın. Hücrelerdeki WSP ve RPS6 gen kopya sayılarını belirlenen standart eğriye göre hesaplayın. Ardından Wolbachia bağıl yoğunluğunu wsp/RPS6 kopya numarasına göre hesaplayın.Bağımsız bir örnek t-testi kullanarak verileri analiz edin. Hücre peletine 200 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Lisatları 12.000 RCF'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı aspire edin.Süpernatantın wsp konsantrasyonunu, üreticinin talimatlarını izleyerek bir BCA protein tahlil kiti kullanarak analiz edin. % 15'lik bir SDS-PAGE jel üzerine eşit miktarda protein yükleyin. Proteini nitroselüloz membranlara aktarın ve membranları oda sıcaklığında iki saat boyunca% 5 yağsız süt ile bloke edin.Daha sonra membranları TBST ile üç kez yıkayın. Membranları, primer antikorun% 5 yağsız sütle seyrelterek hazırlanan 100 mikrolitre anti-wsp poliklonal antikor ile 4 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Birincil antikoru TBST ile üç kez yıkayın.Membranlara 100 mikrolitre yaban turpu peroksidaz konjuge sekonjuge sekonder antikoru ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Membranları TBST ile üç kez yıkayın ve kemilüminesans tespit kitinde 20 mikrolitre A çözeltisi ve 20 mikrolitre B çözeltisini bire bir oranında karıştırın. Tüm membranı aynı anda lüminesans çözeltisine daldırın ve çok işlevli bir görüntüleme sistemi kullanarak sinyalleri gözlemleyin.Bir Lazer konfokal Petri kabında, Aa23 ve Aa23-T hücrelerini% 5 atmosferik karbondioksit altında 28 santigrat derecede üç ila dört gün boyunca inkübe edin. Hücre% 60 ila% 70 kavuşuma ulaştığında, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca% 4'lük bir paraformaldehit mL'sinde sabitleyin.Sabit hücreleri PBST kullanarak beş dakika boyunca yıkayın ve hücreleri PBS ile iki kez tekrar yıkayın. Petri kabını, 37 santigrat derecede bir saat boyunca% 3 sığır serum albümininin bir mL'sinde inkübe edin. Slaytlara 100 mikrolitre fare anti-wsp poliklonal antikoru ve fare serumu ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede ıslak bir kutuda inkübe edin.Petri kabını ıslak kutudan çıkarın ve oda sıcaklığına getirin. PBS ile üç kez yıkayın ve PBS'yi çıkarın. Aşağıdaki prosedürleri ışıktan koruyun.Petri kabını, 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede 100 mikrolitre Alexa Fluor 488 konjuge keçi anti-fare antikoru ile inkübe edin. Örnek Petri kabını, PBS'de seyreltilmiş 50 mikrolitre DAPI ile beş dakika boyunca 37 santigrat derecede 10 mikrogram / mL'ye kadar inkübe edin ve ardından PBS ile üç kez yıkayın. İmmünoboyamayı konfokal mikroskop altında gözlemleyin.Wolbachia'yı tespit etmeden önce, iki hücre hattı arasındaki morfolojik farklılıkları belirlemek için Aa23 ve Aa23-T hücreleri bir ışık mikroskobu altında gözlendi. Aa23 ve AA23-T hücreleri en az iki hücre morfolojisine sahipti, ancak iki hücre tipi arasında belirgin bir morfolojik farklılık gözlenmedi. Tanısal primerler 81F / 691R kullanılarak, Wolbachia wsp geninin pozitif amplifikasyonu Aa23 hücrelerinde tespit edildi, ancak Aa23-T hücrelerinde tespit edilmedi.Hücre hatlarındaki Wolbachia yoğunluğunun analizi, Aa23 hücrelerinde 2.4'lük bir wsp / rps6 oranı gösterdi, ancak Aa23-T hücrelerinde Wolbachia yoktu. Protein ekstraktlarının Western blot analizi, Aa23 için güçlü bir wsp sinyali gösterdi, ancak Aa23-T için sinyal tespit edilmedi. Dolaylı immünofloresan testi, Aa23 hücrelerinde wsp proteinini tespit ederken, Aa23-T hücrelerinde sadece DAPI boyalı DNA tespit edildi.Kültür şişelerinin beş ila yedi gün boyunca% 5 atmosferik karbondioksit altında 28 santigrat derecede inkübe edildiğinden emin olun. Bu prosedürü, numune hazırlama ve kesitlemeye özellikle dikkat edilmesi gereken elektron mikroskobu takip edebilir. Bu çalışmada kullanılan dört deneysel yöntem, Wolbachia enfeksiyonunun hücrelerdeki tespit doğruluğunu doğruladı ve bu da diğer hücre ve doku tipleri için de geçerli.

detecting-wolbachia-strain-walbb-in-aedes-albopictus-cell-lines

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Drosophila Wolbachia Bakteriyel Enfeksiyon

Bu video hücre orta endosymbiont Anofel gambiae hücre hattı Wolbachia pipientis arındırıcı ve sonra kültür için bir yöntem açıklanır. Bakterinin canlılığı için bir test olduğunu göstermiştir.

Hücre Orta Wolbachia bakımı

RNA-Seq analizleri, model olmayan organizmalarda adaptif özelliklerin moleküler temellerini belirlemek için giderek daha önemli hale geliyor. Burada, diyapoz ve diyapoz olmayan Aedes albopictus sivrisinekleri arasında diferansiyel olarak ifade edilen genleri tanımlamak için bir protokol, sivrisinek yetiştiriciliğinden RNA dizilimine ve RNA-Seq verilerinin biyoinformatik analizlerine kadar açıklanmaktadır.

Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü, Aedes albopictus

Wolbachia ile enfekte aedes aegypti sivrisinek arboviruses iletimini bastırmak için doğal nüfus serbest edilmektedir. Biz laboratuvar adaptasyon ve seçimi en aza indirmek önlemler alarak deneyler ve alan açıklaması, arka Ae. aegypti laboratuvarda Wolbachia enfeksiyonları ile yöntemleri açıklanmaktadır.

Aedes aegypti sivrisinek enfekte Wolbachia ile bakımını yapma

Bu iletişim kuralı, viral enfeksiyon vivo içinde virüs ana bilgisayar etkileşimi analiz için nano-enjeksiyon yöntemi ve temel teknikleri kullanarak Drosophila melanogaster içinde kurmak açıklar.

Viral enfeksiyon ve analiz Drosophila Melanogaster ana bilgisayar virüs etkileşimin kurulması

Açıklanan, yumurtaları saymak ve 24 kuyu doku kültürü plakası kullanarak bireysel sivrisineklerin kuluçka oranlarını belirlemek için zaman ve yerden tasarruf sağlayan bir yöntemdir, bu da doğurganlık ve doğurganlık testlerinin ölçeğini ve hızını önemli ölçüde artırabilir.

24 Kuyu Doku Kültürü Plakası (EAgaL Plakaları) kullanılarak Aedes aegypti için Geliştirilmiş Doğurganlık ve Doğurganlık Tahlilleri

Kültür mikrosporidian parazit Edhazardia aedisiçin bir protokol . Parazit aedes aegypti sivrisinek bir nesil sonraki larva aşamasında yatay transfer ve yetişkin aşamasında dikey iletim takip yoluyla geçit edilir. Canlı sporoplazmlar enfekte yumurtalarda uzun süreli hayatta kalırlar.

Aedes aegypti Sivrisinekmikrosporidian Parazit Edhazardia aedis yayılması

Burada, erkek Aedes aegypti'nin çiftleşme rekabet gücünün bir işaretleyici olarak floresan boyası kullanılarak incelenmesi için bir protokol sunuyoruz. Dişi sivrisinekler çiftleşme için hem işaretli hem de işaretlenmemiş erkeklere maruz kalır. Çiftleşme sonrası spermathecae'leri çiftleşme partnerlerini belirlemek için floresan mikroskop altında incelenir.

Erkek Aedes aegypti Sivrisineklerinde Çiftleşme Rekabet Gücünü Incelemek için Floresan Boyası Rhodamine B'yi Kullanmak

RNA girişiminin (RNAi) manipülasyonu, Trichogramma yaban arıları gibi küçücük boyuta sahip birçok parazitoid türünde zorlu bir zorluk teşkil eder. Bu çalışma, Trichogramma denrolimi'de etkili bir RNAi yöntemini tanımlamıştır. Mevcut metodoloji, Trichogramma yaban arılarında gen regülasyonunu araştırmak için sağlam bir model sunmaktadır.

Yumurta Parazitoidinde RNA Girişimi, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Sivrisineklerdeki mikrobiyal topluluklar, vektör biyokontrol stratejileri için büyük umut vaat ediyor. Simbiyontların çoğu yetiştirilemez ve metagenomik analizler gerektirir. Dişi sivrisinekleri incelemek ve yumurtalıkları, orta bağırsakları ve tükürük bezlerini ayırmak, çapraz kontaminasyonu önlemek, organ düzeyinde mikrobiyom çalışmalarını kolaylaştırmak ve mikroorganizmaların sivrisinek biyolojisindeki rollerinin anlaşılmasını geliştirmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Organ Düzeyinde Mikrobiyom Analizleri için Sivrisinek Yumurtalıkları, Midgut ve Tükürük Bezlerinin Diseksiyonu

Hücre hatları, konakçı hücrelerinin dışında kültürlenemeyen hücre içi organizmalar üzerinde yapılan çalışmalarda faydalıdır. Wolbachia ile enfekte olmuş hatlar birçok keşfi mümkün kılmış olsa da, bu hatlardaki heterojenlik değişken deneysel sonuçlara yol açabilir. Wolbachia ile enfekte JW18 hücrelerinden tek hücreli klonlar ve sürekli kültürler oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Wolbachia ile enfekte Drosophila melanogaster JW18 Hücre Hattından Monoklonal Kültürlerin Üretilmesi

Öğrenin, Aedes albopictus hücre hatlarında Wolbachia wAlbB suşunun dört tamamlayıcı yöntemle nasıl tespit edildiğini. Bu protokol, enfeksiyon doğruluğunu artırarak hücre biyolojisi ve mikrobiyoloji araştırmalarına katkı sağlar.

Aedes albopictus Hücre Hatlarında Wolbachia Suşu wAlbB'nin Tespiti

Daha fazla video keşfet