Proteinlerin ve hidrasyon suyunun pikosaniye-nanosaniye dinamiklerini incelemek için yüksek çözünürlüklü nötron spektroskopisi

Nötron geri saçılımları, radyasyon hasarı olmadan proteinlerin ve hidrasyon suyunun küresel difüzyonunu ve iç dinamiklerini ölçer. Nötron spektroskopisi aynı anda moleküler düzeyde uzaysal ve zaman korelasyonlarına erişir. Yumuşak madde ve biyolojik materyallerde, bu uzun menzilli bozukluk sistemlerinde yerel düzen hakkında dolaylı bilgi edinmek özellikle ilginçtir.

Böylece nötron geri saçılması, biyoloji, kimya veya maddi anlamda dinamikleri incelemek için kullanılabilir. Bir diğer güçlü alan, örneğin piller ve yakıt hücreleri üzerinde yapılan çalışmalarla enerjidir. Nötron geri saçılması, Alzheimer ve Parkinson gibi nörodejeneratif hastalıklarda yer alan proteinlerin moleküler dinamiklerini incelemek için başarıyla kullanılmıştır.

Elde edilen sonuçlar, bu patolojilerin moleküler özelliklerini daha iyi anlamamıza yardımcı olur ve daha iyi tanı geliştirmenin yolunu açabilir. Numune tutucuyu hazırlamak için, düz bir alüminyum numune tutucuyu ve indiyum tel contasını ve vidalarını suyla iyice temizleyerek başlayın, ardından etanol ile devam edin ve kurumasını bekleyin. Alt, kapak ve indiyum tel dahil olmak üzere numune tutucunun farklı kısımlarını hassas bir terazide ayrı ayrı tartın.

Bir milimetrelik indiyum tel contayı numune tutucunun alt kısmının oluğuna yerleştirin ve iki ucun birleştiği yerde küçük bir örtüşme bırakın. Numune tutucunun alt kısmının iç yüzeyini dolduracak şekilde yaklaşık 100 miligram liyofilize protein ekleyin. Daha sonra, protein tozunu tamamen kurutmak için numune tutucuyu 24 saat boyunca fosfor pentoksit tozu içeren bir Petri kabına sahip bir kurutucuya yerleştirin.

Kurutulmuş numunenin kütlesini elde etmek için indiyum contayı ve kurutulmuş tozu içeren numune tutucunun kurutulmuş alt kısmını tartın. Fosfor pentoksiti kurutucudan çıkarın ve tozu nemlendirmek için içine döteryum oksit içeren bir Petri kabı ve numuneyi koyun. Tam hidrojenden döteryum değişimine kadar kurutma ve nemlendirmeyi üç kez tekrarlayın.

Hidrasyon seviyesini kontrol etmek için toz kütlesini düzenli olarak ölçün ve hidrasyon istenen seviyenin biraz üzerinde olduğunda, kütlenin yavaşça azalmasını bekleyin. İstenilen hidrasyon elde edildikten sonra, kapağı hızlı bir şekilde alt kısma yerleştirin ve buhar değişimini durdurmak için numune tutucuyu önce dört vidayla kapatın. Alt kısım ile kapak arasında boşluk görünmeyene kadar kalan tüm vidaları yerleştirin ve sıkın.

Nötron deneyinden sonra sızıntılar yoluyla olası hidrasyon kaybı olup olmadığını kontrol etmek için kapalı numune tutucuyu tartın. Sıvı hal numunesini hazırlamak için, proteini deuterated tamponda çözün. Su kullanarak, numune tutucuya konulacak uygun sıvı hacmini belirleyin.

Herhangi bir malzemeyi kullanmadan önce, iyonlaştırıcı radyasyon dozunun saatte 100 mikrosievertten az olduğundan emin olun. Ardından, numune çubuğunu iyice kurutun ve önceki numuneleri çıkarın. Numuneyi numune çubuğuna yerleştirin, ışın merkezine göre doğru merkezleme olup olmadığını kontrol edin ve numune çubuğunu kriyo fırınına yerleştirin.

Nomad'da veri almak için, yürütme sekmesine gidin ve bir fırın kriyostat denetleyicisini fırlatma çubuğuna sürükleyip bırakın. Sıcaklığı 200 Kelvin'e ayarlayın. Hızlı modu ve 30 dakikalık bir zaman aşımını kullanın, böylece sıcaklığın dengelenmesi için zaman olur.

Sıcaklık düşüşü sırasında veri toplama amacıyla sıcaklık rampasını arka planda çalıştırmak için tazeleyici simgesine tıklayın. IN16 Doppler ayarları denetleyicisini başlatma çubuğuna sürükleyip bırakın. Elastik bir sabit pencere tarama yapılandırması elde etmek için hız profilini doğru hıza, maksimum delta E'ye ayarlanmış, enerji ofsetini 0,00 mikro elektronvolta ve kanal sayısını 128'e ayarlayın.

Bir sayım denetleyicisini başlatma çubuğuna sürükleyip bırakın, altyazı alanını verilerin kolayca tanımlanmasını sağlayan bir adla doldurun ve 60 tekrarla 30 saniyelik taramalar ayarlayın. Ardından, IN16 Doppler ayarları denetleyicisini sürükleyip başlatma çubuğuna bırakın. Yarı elastik nötron saçılma konfigürasyonu elde etmek için hız profilini işaretleyecek, ayarlanacak hızı saniyede 4,5 metre değeriyle ve kanal sayısını 2048'e ayarlayın.

Bir sayım denetleyicisini sürükleyip bırakın ve altyazı alanını verilerin kolayca tanımlanmasını sağlayan bir adla doldurun. Dört tekrarla 30 dakikalık taramalar ayarlayın. Sıcaklık rampası için, bir fırın kriyostat kontrolörünü sürükleyip bırakın, sıcaklığı 310 Kelvin'e ayarlayın ve rampayı altı saniye boyunca 0,05 Kelvin'lik bir delta ile ayar noktasına ayarlayın.

200 dakikalık bir zaman aşımı kullanın. 65 tekrarlı bir for döngüsü kullanın. İçeride, bir IN16 doppler ayar denetleyicisini, ardından sayım denetleyicisini takın ve 30 saniyelik tek bir tarama ayarlayın.

Daha sonra, daha önce açıklandığı gibi IN16 Doppler ayarlarını ekleyin, ancak 1.5 mikro elektronvolt ve 1024 kanallı bir enerji ofseti kullanın. Ardından, sayım denetleyicisini takın ve üç dakikalık tek bir tarama ayarlayın. 312 Kelvin'in son yarı elastik nötron saçılımını elde etmek için, daha önce gösterildiği gibi yapılandırılmış IN16 Doppler ayarlarını ve sayım denetleyicilerini sürükleyip bırakın.

Ardından, komut dosyasını çalıştırmak için başlat düğmesine basın. Lizozom elastik ve elastik olmayan sabit pencere taramaları, düşük momentum transferinde ve düşük enerji transferinde sinyalde bir artış gösterirken, yüksek enerji transferinde ve düşük momentum transferinde sinyal azaldı. Kütle difüzyon katsayısının ilk merkezi, nanosaniye başına 15 angstrom karesi idi ve daha sonra zamanla katlanarak azaldı.

220 Kelvin'den daha yüksek sıcaklıklarda, tau liflerinin etrafındaki hidrasyon suyu, tau monomerlerinin etrafından önemli ölçüde daha hareketliydi. Translasyonel harekete geçen su moleküllerinin fraksiyonu ve su moleküllerinin hem translasyonel hem de rotasyon difüzyon katsayıları liflerin etrafında artmıştır. Protein konsantrasyonu, nötron akısı veya numune tutucu tampon arka planından kaynaklanan nötron geri saçılma sınırlamaları nedeniyle proteinli proteinler için ml başına 2000 miligram veya ml başına en az 20 miligram olmalıdır.

Nötron geri saçılması, örneğin, doğal çevresel proteinler olan suyun, örneğin ilaç dağıtımı gibi biyoteknolojik uygulamalar için sentetik bir polimerle nasıl tamamen değiştirilebileceğini anlamak için yakın zamanda uygulanmıştır.