Name: Kromoforların Varlığında ve Yokluğunda Cu(II) ve Peptit Kalıntıları Arasındaki Bağlanma Etkileşimlerinin Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Keşfedin Cu(II) ve peptit bağlanma termodinamiğini elektronik absorpsiyon spektroskopisi ve izotermal titrasyon kalorimetrisi kullanarak. Bu yöntem metal-peptit etkileşimlerini kapsamlı şekilde anlamak için araştırmacılara güçlü bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SC, Whitehead Yaz Araştırma Bursu'na teşekkür eder. MJS, San Francisco Üniversitesi'ndeki Başlangıç Fonlarına ve Fakülte Geliştirme Fonu'na teşekkür eder. MCH, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH MIRA 5R35GM133684-02) ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (NSF KARİYER 2048265) gelen fonları kabul etmektedir.

1. Elektronik absorpsiyon spektroskopisi: tampon rekabeti ile doğrudan titrasyon
<ol><li>Numune hazırlama<ol>
<li>Ultra saf su (>18 MΩ direnç) kullanarak pH 7.4'te 50 mM 2-[bis (2-hidroksietil) amino]-2-(hidroksimetil) propan-1,3-diol (bisTris) tamponlu bir çözelti hazırlayın. Eser metal iyonlarını, yüksek afiniteli bir reçine ile müteakip filtrasyon ile en az 2 saat boyunca inkübe ederek çıkarın.</li>
		<li>Peptitin bilinen bir miktarını metalsiz tampona çözün veya seyreltin. NOT: Küçük yok olma katsayıları21 olan d-d bantlarını izlerken, daha yüksek konsantrasyonlarda peptit kullanılmalıdır. Burada, tamponlanmış çözeltideki C-peptidin son konsantrasyonu 300 μM idi (hacim küvetin boyutuna bağlıdır). C-peptid, katı faz peptid sentezi ile sentezlenmiştir ve literatür14'ün başka bir yerinde detaylandırılmıştır.</li>
		<li>10-15 mM'de bir çözelti yapmak için bilinen bir CuCl2 kütlesini ultra saf suda çözün. NOT: Yağışı önlemek için metal tuzunun başlangıçta tamponsuz suda çözülmesi önemlidir. Diğer Cu(II) tuzları kullanılabilir, ancak anyonun zayıf bir şekilde koordine olduğundan emin olmak için dikkatli olunmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Denemeyi çalıştırma<ol>
<li>Elektronik absorpsiyon spektrofotometresini açın ve kullanmadan önce ~ 15-20 dakika ısınmasına izin verin. Spektrofotometre yazılımını başlatın ve tarama aralığı (200-900 nm), tarama hızı (200 nm / s) ve çift ışın taban çizgisi düzeltilmiş ( Ek Dosyada daha fazla parametre listelenmiştir) gibi parametreleri yapılandırın.</li>
		<li>Kiriş yollarında küvet veya numune içermeyen bir taban çizgisi toplayın.</li>
		<li>Çift ışınlı spektrofotometrede iki eşleşen küvet kullanarak, bir küveti 115 μL ultra saf su ile ve diğer küveti 115 μL peptid numunesi ile yükleyin. Küvetlerde hava kabarcığı olmadığından emin olun, çünkü bunlar sinyale müdahale edecektir.</li>
		<li>Küveti referans ışınına ultra saf su ile ve numune ışınına peptidli küvet yerleştirin.</li>
		<li>Metal içermeyen (apo) peptidin absorpsiyon spektrumunu toplayın.</li>
		<li>Peptit örneği ile küvete Cu(II) çözeltisinin sub-stokiyometrik bir miktarına (0.5 eşdeğeri, 150 μM) ekleyin. Eklenen Cu(II) hacminin 3 μL'den az olduğundan emin olun ve hacmi daha sonra analiz edilmek üzere kaydedin.</li>
		<li>Hava kabarcıklarının oluşmasını önlerken çözeltiyi karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet uygulayın. Çözeltinin 5 dakika boyunca reaksiyona girmesine ve dengelenmesine izin verin ve absorpsiyon spektrumunu kaydedin.</li>
		<li>Aşağıdaki eşdeğerler için peptit çözeltisine adım 1.2.6'daki gibi Cu(II) alikotlarının eklenmesini tekrarlayın: 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 ve 5.0 (veya toplam 300, 450, 600, 900 ve 1.500 μM). Eklenen Cu(II)'nin toplam hacmini ve küvetin toplam hacmini kaydettiğinizden emin olun. NOT: Daha fazla çözünürlük isteniyorsa, eşdeğerleri arasındaki boşluğu azaltın.</li>
		<li>Numune küveti çıkarın ve üreticinin talimatlarına göre iyice temizleyin.</li>
		<li>Peptit içermeyen tamponlanmış çözeltiyi ekleyin ve absorpsiyon spektrumunu kaydedin. Her Cu(II) eşdeğeri için absorpsiyon spektrumunu kaydederek 1.2.5-1.2.8 adımlarında olduğu gibi Cu(II) alikotlarının eklenmesini tekrarlayın.</li>
		<li>Tüm spektrumları işlenmek üzere csv dosyaları olarak dışa aktarın. Küvetleri üreticinin talimatlarına göre iyice temizleyin ve spektrofotometreyi kapatın.</li>
	</ol></li>
	<li>Verilerin işlenmesi<ol>
<li>Tüm spektrumları bir elektronik tablo programına yükleyin.</li>
		<li>Yalnızca tampon (0 μM Cu(II)) spektrumunu diğer tüm spektrumlardan çıkararak tamponun kendisinden herhangi bir absorbans özelliğini kaldırın.</li>
		<li>Cu(II) çözeltisinin eklenmesinden kaynaklanan seyreltmeyi hesaba katmak için her spektrumu normalleştirin (adım 1.2.6). vbaşlangıcının küvete eklenen peptidin hacmi (115 μL), v Cu(II) adım 1.2.6'da eklenenCu(II) çözeltisinin hacmi ve Abstamponu çıkarılan spektrumun adım 1.2.7'de elde edilen veriler olduğu normalizasyon örneği için Ek Dosya, Eq (1)14'e bakınız.</li>
		<li>Değişim bölgelerini tanımlamak için tüm spektrumları birlikte grafiklendirin. NOT: Cu(II) komplekslerinden tipik d-d bantları 500 ila 750 nm arasında değişmektedir. Bu spektrofotometrik titrasyon, oktahedral geometri21'de Laporte tarafından yasaklanan geçişler olan d-d bantlarından gelen küçük yok olma katsayısı nedeniyle zor olabilir. Absorbans çok zayıfsa, alternatif bir yaklaşım, Cu(II)'ye bağlandıktan sonra yük transfer bantlarıyla sonuçlanan kromoforik ligandları kullanmaktır (bkz. bölüm 2).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Elektronik absorpsiyon spektroskopisi: kromoforik ligand ile peptid rekabeti
<ol><li>Numune hazırlama<ol>
<li>~1 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1,10-fenantrolin (fen) ultra saf suda çözün.</li>
		<li>Peptit (adım 1.1.2) ve Cu(II) (adım 1.1.3) için bölüm 1.1'de açıklanan numune preparatına ek olarak, tamponda ([Cu(fen)3]2+) 10 μM Cu(II) ve 40 μM fen çözeltisi hazırlayın. Hacmin küvetin doldurduğundan emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>Denemeyi çalıştırma<ol>
<li>Elektronik absorpsiyon spektrofotometresini 1.2.1 ve 1.2.2 adımlarında olduğu gibi başlatın, ancak tarama aralığını 200-400 nm olarak ayarlayın.</li>
		<li>Eşleşen iki küvette, bir küveti 115 μL ultra saf su ile ve diğer küveti 115 μL [Cu(phen)3]2+ çözeltisi ile yükleyin. Küvetin referans kirişine su ile ve küvetin numune kirişine [Cu(phen)3]2+ çözeltisi ile yerleştirin.</li>
		<li>Metal ligand kompleksinin absorpsiyon spektrumunu toplayın.</li>
		<li>[Cu(phen)3]2+ çözeltisine stokiyometrik miktarda (≈1 eşdeğeri, ≈10 μM) peptid ekleyin. İyice karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet uygulayın, ancak hava kabarcıkları sokmamaya dikkat edin. Gelecekteki analizler için eklenen peptid hacmini kaydedin. NOT: 115 μL tutan küvetler kullanıldığında, 3.83 μL 300 μM peptid eklenmesi, 9.7 μM'lik bir nihai peptid konsantrasyonu verir.</li>
		<li>Dengeye ulaşmak için çözeltiyi 5 dakika boyunca inkübe edin. Absorpsiyon spektrumunu kaydedin. NOT: Metal-peptid ve metal-ligandın bağlanma afinitesi benzerse, eklenen peptid konsantrasyonunun büyük miktarda olması gerekecektir. Normalizasyon için eklenen toplam peptit hacmini hesaba kattığınızdan emin olun.</li>
		<li>Aşağıdaki yaklaşık eşdeğerler için [Cu(phen)3]2+ çözeltisine peptid alikotlarının eklenmesini tekrarlayın: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 ve 26 . Seyreltilmiş konsantrasyonun belirlenebilmesi için eklenen peptidin hacmini kaydedin.</li>
		<li>Numuneyi çıkarın ve küvetleri üreticinin talimatlarına göre iyice temizleyin. Arabelleğin bir spektrumunu toplayın. Tamponda 50 μM peptid spektrumu toplayın.</li>
		<li>Tüm verileri işlemek için csv dosyaları olarak dışa aktarın ve küvetleri üreticinin talimatlarına göre temizleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Verilerin işlenmesi<ol>
<li>Spektrumları bir elektronik tablo programına yükleyin ve arabellek spektrumunu diğer spektrumlardan çıkarın.</li>
		<li>Ek Dosya, Eq (2)14'ü izleyerek spektrumları normalleştirin.</li>
		<li>265 nm'de [Cu(phen)3]2+ için yok olma katsayısını kullanarak (εmax = 90.000 M-1 cm-1)22, peptidin her ilavesiyle [Cu(phen)3]2+ konsantrasyonunu belirleyin.</li>
		<li>Peptitin her bir ilavesi için, 2.3.2 adımında belirlenen [Cu(phen)3]2+ 'nın kalan konsantrasyonunu, [Cu(phen)3]2+ 'nın başlangıç konsantrasyonundan (0 μM peptidde) çıkararak Cu(II)-peptid kompleksinin konsantrasyonunu belirleyin.</li>
		<li>Serbest fen ligandının konsantrasyonunu Ek Dosya, Eq (3)14'teki denklemle hesaplayın.</li>
		<li>Ek Dosya, Eq (4) 14 kullanarak serbest peptit konsantrasyonunu hesaplayın, burada [peptid] stok, küvete titre edilmiş seyreltilmemiş peptidi temsil eder, V 1, eklenen stok peptidinin hacmini temsil eder, V 2, küvetin toplam hacmidir ve [Cu 2 + -peptid] adım2.3.4'te belirlenir.</li>
		<li>Ek Dosya23'teki Eq (5)'i kullanarak deneysel bağlama afinitesini (Kex) hesaplayın.</li>
		<li>Cu(II)-peptidin ayrışma sabitini Ek Dosyada Eq (6)23 ile Kex ile ilişkilendirin, burada Kd,Cu(II)-phen = 1.0 × 10-9 (bkz. 22). Belirlenen tüm ayrışma sabitlerinden ortalama ve standart sapmayı belirleyin. NOT: 4: 1 phen oranı altında: Cu (II), [Cu(phen)3]2+, [Cu(phen)2]2+ ve [Cu(phen)]2+ çözeltide bulunur ve peptid, Cu(II)'yi türlerden ([Cu(phen)]2+) en zayıf bağlanma 22 ile şelatlar.</li>
	</ol></li>
</ol>3. İzotermal titrasyon kalorimetrisi
<ol><li>Numune hazırlama<ol>
<li>Ultra saf su (>18 MΩ direnç) kullanarak pH 7.4'te 15 mM 3-morfolinopropan-1-sülfonik asit (MOPS) tamponlu bir çözelti hazırlayın. Eser metal iyonlarını, şişe üstü 0,45 μm'lik bir membrandan daha sonra vakum filtrasyonu ile en az 2 saat boyunca yüksek afiniteli bir reçine ile inkübe ederek çıkarın.</li>
		<li>≈50-100 mM'lik bir çözelti hazırlamak için bilinen bir CuCl2 kütlesini ultra saf suda çözün. Son konsantrasyonu 1,4 mM Cu(II) olan 1,0 mL'lik bir çözelti elde etmek için bu Cu(II) çözeltisini tampon halinde seyreltin. Kullanılan CuCl 2 çözeltisinin tamhacmini kaydedin.</li>
		<li>154 μM'lik bir peptid çözeltisinin 450 μL'sini yapmak için peptid çözeltisini tamponda çözün veya seyreltin. Peptit çözeltisine, 3.1.2 adımındaki aynı oranda ilave ultra saf suyun eklendiğinden emin olun, bu da seyreltme ısısını azaltacak ve sinyal-gürültüyü artıracaktır.</li>
		<li>Numunelerin hazırlanmasından sonra, çözeltilerin aynı pH'ta olduğundan emin olun ve gerekirse buna göre ayarlayın.</li>
		<li>İsteğe bağlı adım: ITC'ye yüklenen mikro kabarcıkları en aza indirmek için çözeltilerin gazını çözün.</li>
	</ol></li>
	<li>Denemeyi çalıştırma<ol><li>ITC'yi açın. Cihazı çalıştırmak için ITC yazılımını başlatın. Böreği yeniden eve döndürmeyi isteyecek ilk başlatmayı bekleyin; tıklayın, sonra ekrandaki yönergeleri izleyin.</li>
		<li>Kapağı referans hücresinden çıkarın. Referans hücresinden herhangi bir suyu çıkarın ve 450 μL gazdan arındırılmış ultra saf su ile üç kez durulayın.</li>
		<li>Bir yükleme şırıngasının 450 μL işaretine yavaşça ultra saf su çekin, şırıngaya hava kabarcıkları sokmamaya dikkat edin. Yükleme şırıngasını alttan ≈1 mm uzakta olana kadar referans hücresine yerleştirin ve yükleme şırıngasında 150 μL kalana kadar çözeltinin bir kısmını yavaşça enjekte edin. Hücre yüzeyindeki kabarcıkları yerinden çıkarmak için yükleme şırıngası pistonunu birkaç kez ≈25 μL hızla yukarı ve aşağı hareket ettirin. Piston yükleme şırıngasındaki 100 μL işaretine ulaşana kadar yavaşça enjekte edin, böylece referans hücresine toplam 350 μL ultra saf su dağıtın ve referans hücre kapağını değiştirin.</li>
		<li>Herhangi bir kalıntı çözeltiyi numune hücresinden çıkarın ve bir yükleme şırıngası kullanarak 450 μL 10 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile yükleyin. EDTA eser metalleri bağlayacağı için eser metal iyonlarının uzaklaştırıldığından emin olmak için 10 dakika bekletin.</li>
		<li>EDTA çözeltisini (bağlı eser metal iyonları ile) çıkarın ve yükleme şırıngasını bol miktarda ultra saf su ile iyice durulayın.</li>
		<li>ITC'yi üreticinin talimatlarına uygun olarak temizleyin, numune hücresini ultra saf suyla durulayın.</li>
		<li>Numune hücresini en az üç kez 450 μL tamponla durulayın.</li>
		<li>Örnek hücreyi koşullandıran arabelleği çıkarın. Yükleme şırıngasını kullanarak peptid çözeltisini numune hücresine yükleyin (adım 3.2.3'ü izleyin).</li>
		<li>Titrasyon şırıngasını 200 μL tamponlu çözelti ile durulayın. Bunu yapmak için, pistonu çıkarın ve tamponu cam titrasyon şırıngasının üstündeki delikten, şırıngadan ve aşağıdaki iğneden pipetle çıkarmak için bir mikropipet kullanın.</li>
		<li>Pistonu titrasyon şırıngasına tamamen takın.</li>
		<li>Titrasyon şırınga iğnesinin ucunu metal çözeltiye batırın ve pistonu yavaşça yukarı çekerek metal çözeltinin şırıngayı doldurmasına neden olur ve titrasyon şırıngasının cam kısmının üstünde bir boşluk hacmine neden olur. Titrasyon şırıngasını zemine paralel olarak döndürerek boşluk hacminin çoğunu çıkarın, pistonu çıkarın ve cam kısmı hafifçe zemine doğru eğin. Titrasyona şırıngayı hafifçe sallayın, böylece çözelti titrasyon şırıngasının cam kısmının sonuna doğru hareket eder ve boşluk hacminin çoğunu doldurur, ancak 2-3 μL boşluk hacminin kaldığından emin olun. Şırıngayı zemine paralel tutarken, pistonu tekrar takın.</li>
		<li>Titrasyon şırıngasını dik tutun, iğnenin ucunu tekrar metal çözeltiye batırın ve iğneden hava çıkmayı bırakana kadar pistonu aşağı doğru itin. İğnenin ucunu çözeltide tutarken pistonu yavaşça yukarı çekerek titrasyon şırıngasını 50 μL işaretinin hemen üstüne doğru yükleyin.</li>
		<li>Titrasyon şırıngasının cam kısmını dikkatlice böreğe yerleştirin ve parmağınızı sıkana kadar vidalayın. Pistonun sıkıştırılması nedeniyle titrasyon şırıngasından az miktarda çözelti çıktığında, iğnenin ucuna dokunmadan çözeltiyi dikkatlice emmek için hafif hizmet tipi hassas bir silecek kullanın.</li>
		<li>Böreği titrasyon şırıngalı numune hücresine yerleştirin ve güvenli bir şekilde sabitleyin.</li>
		<li>ITC yazılımındaki parametreleri ayarlayın. Cihaz Kontrolünden başlayarak, karıştırma hızını (tipik karıştırma hızları 150 ila 350 RPM arasında değişir) ve deneyin gerçekleştirileceği sıcaklığı (tipik olarak 25 ° C) ayarlayın. Şırınga ve hücre konsantrasyonlarını milimolar birimler halinde Deney Ayrıntıları altında girin.</li>
		<li>Deneme Yöntemi bölümünde, Artımlı Titrasyon'u seçin. Kurulum'a tıklayın ve 20 adet 2,5 μL'lik enjeksiyon belirtin. Bağlanma olayını gözlemlemek için daha fazla çözünürlük gerekiyorsa, enjeksiyon sayısını artırın ve enjeksiyon başına hacmi azaltın. Her enjeksiyon arasındaki zaman aralığını girin, böylece sinyalin dengelenmesi ve taban çizgisine, tipik olarak 300 s'ye dönmesi için yeterince uzun olur.</li>
		<li>Denemeyi başlatmak ve verilerin nereye kaydedileceğini belirtmek için çalıştır düğmesini tıklayın.</li>
		<li>Deneyin tamamlanmasının ardından, numune hücresini ve titrasyon şırıngasını temizleyin.</li>
		<li>Kesin veri toplama sağlamak için tüm denemeleri en az üç kat halinde çalıştırın.</li>
		<li>Metal iyonundan seyreltme ısısının küçük olduğundan ve hesaplanmamış denge olmadığından emin olmak için metal çözeltinin tamponlu çözeltiye (peptid yokluğunda) titre edildiği bir kontrol deneyi çalıştırın. Seyreltme ısısı büyükse, mümkünse farklı bir tampon sistemi düşünün.</li>
	</ol></li>
	<li>Verilerin işlenmesi<ol>
<li>ITC analiz yazılımını başlatın ve analiz için veri dosyasını yükleyin.</li>
		<li>Temel sekmesine gidin ve termogramı inceleyin. Hava kabarcıklarından veya termogramdaki diğer eserlerden evrimleşen veya emilen herhangi bir eksojen ısıya dikkat edin. Metal çözeltinin enjeksiyonundan kaynaklanmayan sivri uçları arayın.</li>
		<li>Analiz yazılımı tarafından oluşturulan taban çizgisinin, enjeksiyon ve dengelemeden sonra verilerin bir kısmını takip ettiğinden emin olun. Sapma olursa, taban çizgisini ayarlamak için Temel Pivot Noktaları'nı kullanın. Entegrasyon Bölgelerinin , metalin enjeksiyonundan üretilen tepe noktasını içerdiğinden emin olun, ancak adım 2'de bulunan termogramdaki hava kabarcıklarını veya eserleri engelleyin. Taban çizgisini termogramdan çıkarın. NOT: Bu tür bir manipülasyon yalnızca birden fazla termogram toplandıktan sonra önerilir, bu nedenle deneyci gerçek verilerin ne olduğunu ve bir yapının ne olduğunu bilir, çünkü taban çizgisini ve Entegrasyon Bölgelerini ayarlamak verileri büyük ölçüde etkileyebilir.</li>
		<li>Analiz yazılımının her enjeksiyon için entegre ve konsantrasyon normalleştirilmiş verileri göstereceği verileri sığdırmaya başlamak için Modelleme penceresine gidin.</li>
		<li>Montaj algoritmasından çıkarmak için ilk enjeksiyonun verisine sol tıklayın. NOT: Bu yaygındır, çünkü titrant ve numune hücre çözeltisi arasında küçük bir karışım olacaktır ve bu da ilk enjeksiyonun kesin olmayan azı dişlerinin dağıtılmasına yol açacaktır.</li>
		<li>Modeller bölümünde, son enjeksiyon entalpisi temel alınarak her veri noktasından çıkarılacak olan ve seyreltme ısısını hesaba katarak Stil açılır menüsünde Boş (sabit) seçeneğini belirleyin. Ayrıca, verileri sığdırmak için ikinci Stil açılır menüsünde Bağımsız'ı (veya sistem için en iyi modeli) seçin. NOT: Standart 1:1 bağlama etkileşimleri için en yaygın model Bağımsız'dır.</li>
		<li>Yeşil oynat düğmesine Σ ile basarak iki modeli kullanarak verileri sığdırın. NOT: ITC verilerini işlemek için başka bir yazılım SEDPHAT24'tür.</li>
		<li>Daha önce Grossoehme ve ark. tarafından bildirilen post hoc analizdeki tüm rakip dengeleri hesaba katın. 20.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Waldron, K. J., Robinson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+bacterial+cells+ensure+that+metalloproteins+get+the+correct+metal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).</li>
<li>Puig, S., Thiele, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+copper+uptake+and+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of copper uptake and distribution.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).</li>
<li>Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function%2C+structure%2C+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).</li>
<li>Kaplan, J. H., Lutsenko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+transport+in+mammalian+cells%3A+Special+care+for+a+metal+with+special+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).</li>
<li>Makowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+binding+of+Cu%28II%29+ions+to+a+fragment+of+the+A%CE%B2+%281-42%29+polypeptide+using+fluorescence+spectroscopy%2C+isothermal+titration+calorimetry+and+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).</li>
<li>Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H+NMR+studies+of+copper+binding+by+histidine-containing+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).</li>
<li>García, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+and+electronic+structure+studies+of+copper%28II%29+binding+to+His111+in+the+human+prion+protein+fragment+106%E2%88%92115%3A+evaluating+the+role+of+protons+and+methionine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues.</a> Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).</li>
<li>Jakab, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+histidine+containing+peptides+for+better+understanding+of+their+coordination+mode+toward+copper%28II%29+by+CD+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).</li>
<li>Keltner, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+characterization+and+activity+of+zinc-activated+proinsulin+C-peptide+and+C-peptide+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants.</a> Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).</li>
<li>Whittal, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Copper+binding+to+octarepeat+peptides+of+the+prion+protein+monitored+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).</li>
<li>Żamojć, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pentapeptide+with+tyrosine+moiety+as+fluorescent+chemosensor+for+selective+nanomolar-level+detection+of+copper%28II%29+ions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).</li>
<li>Beuning, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+interpeptidic+Cu+II+exchange+rate+constants+of+Cu+II+-amyloid-%CE%B2+complexes+to+small+peptide+motifs+by+tryptophan+fluorescence+quenching%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching.</a> Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).</li>
<li>Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper%28II%29+complexation+by+fragment+of+central+part+of+FBP28+protein+from+Mus+musculus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus.</a> Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).</li>
<li>Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+metal+effects+on+C-peptide+structure+and+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).</li>
<li>Stevenson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+a+copper+binding+site+in+proinsulin+C-peptide+and+its+implications+for+metal-modulated+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity.</a> Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).</li>
<li>Magyar, J. S., Godwin, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectropotentiometric+analysis+of+metal+binding+to+structural+zinc-binding+sites%3A+Accounting+quantitatively+for+pH+and+metal+ion+buffering+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects.</a> Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).</li>
<li>Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28Un%29suitability+of+the+use+of+pH+buffers+in+biological%2C+biochemical+and+environmental+studies+and+their+interaction+with+metal+ions+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">(Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review.</a> RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).</li>
<li>Sigel, H., Martin, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+properties+of+the+amide+bond.+stability+and+structure+of+metal+ion+complexes+of+peptides+and+related+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands.</a> Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteins+containing+cytochrome%2C+iron-sulfur%2C+or+copper+redox+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers.</a> Chemical Reviews. 114 (8), 4366(2014).</li>
<li>Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+bioinorganic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).</li>
<li>Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiessler%2C+GL+%22Inorganic+Chemistry%22">Inorganic Chemistry</a>. , Pearson. (2014).</li>
<li>Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+direct+red+81+dye%2Fcopper%28II%29-phenanthroline+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system.</a> Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).</li>
<li>Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molar+absorption+coefficients+and+stability+constants+of+Zincon+metal+complexes+for+determination+of+metal+ions+and+bioinorganic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).</li>
<li>Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEDPHAT+-+A+platform+for+global+ITC+analysis+and+global+multi-method+analysis+of+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions.</a> Methods. 76, 137-148 (2015).</li>
<li>NIST. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Critically+Selected+Stability+Constants+of+Metal+Complexes%2C+Version+8.0%22">Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0</a>. , (2004).</li>
<li>Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+measurement+of+protein+sulfhydryls+with+Ellman%27s+reagent+and+with+4%2C4%E2%80%B2-dithiodipyridine%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4′-dithiodipyridine.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
</ol>

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Bu makale, peptitlere bağlanan Cu(II)'nin afinitesini ve termodinamiğini ölçmek için sağlam bir yöntem sunmaktadır. Cu(II) içeren kompleksler, d9 elektron konfigürasyonu nedeniyle metal sahasındaki d-d absorpsiyon bandını izlemek için idealdir. Her ne kadar yok olma katsayısı küçük olsa da, bu nedenle güvenilir bir sinyal vermek için kompleksin daha büyük konsantrasyonlarını gerektirse de, Cu(II)'nin peptide titrasyonları, bağlanma stokiyometrisi ve yaklaşık bağlanma afinitesi hakkında hızlı bir şekilde fikir ...

Biyoloji, yaşamın çevresindeki çevreye uyum sağlaması ve hayatta kalması için gereken metal iyonlarının çeşitli kimyasını kullanmak için gelişmiştir. Proteinlerin tahmini% 25 -% 50'si yapı ve işlev için metal iyonları kullanır1. Metal iyonunun özel rolü ve redoks durumu, onu koordine eden biyolojik ligandların bileşimi ve geometrisi ile doğrudan ilgilidir. Ek olarak, Cu(II) gibi redoks-aktif metal iyonları, reaktif oksijen türleri (ROS) 2,3,4 oluşturmak için Fenton benzeri kimya yoluyla oksitleyici ajanlarla etkileşime girmemeleri için sıkı bir şekilde düzenlenmelidir. Biyokimyasını yönlendiren bağlanma modlarını ve afinitesini anlamak, metal iyonunun biyolojik rolünü aydınlatmaya yardımcı olmalıdır.
Metallerin ve peptitlerin bağlanma etkileşimlerini incelemek için birçok teknik kullanılır. Bunlar çoğunlukla spektroskopik tekniklerdir, ancak aynı zamanda bir amiloid beta (Aβ) 5 parçası ile Cu (II) etkileşimlerinde görüldüğü gibi moleküler dinamiği kullanan bilgisayar simülasyonlarını da içerir. Birçok üniversite tarafından erişilebilen yaygın olarak kullanılan spektroskopik bir teknik, nükleer manyetik rezonanstır (NMR). Cu (II)'nin paramanyetik doğasını kullanarak, Gaggelli ve ark. metal iyonunun yakındaki çekirdekleringevşemesi yoluyla bir petide nereye bağlandığını gösterebildiler 6. Elektron paramanyetik rezonansı (EPR), paramanyetik metal iyonu bağlama7'nin yerini ve modunu araştırmak için de kullanılabilir. Dairesel dikroizm (CD) gibi diğer spektroskopik teknikler, tripeptit sistemleri8 gibi sistemlerde Cu(II) ile ilgili koordinasyonu tanımlayabilir ve kütle spektrometrisi stokiyometriyi ve metal iyonunun parçalanma kalıpları 9,10 ile hangi kalıntıların koordine edildiğini gösterebilir.
NMR gibi bu tekniklerden bazıları etiketsizdir, ancak büyük konsantrasyonlarda peptid gerektirir ve bu da çalışma için zorluklar yaratır. Floresan spektroskopisi adı verilen bir başka yaygın teknik, bir tirozin veya triptofanın pozisyonunu bir Cu(II)11,12'den söndürme ile ilişkilendirmek için kullanılmıştır. Benzer şekilde, bu teknik Cu(II) bağlama13'ün bir sonucu olarak yapısal değişiklikler gösterebilir. Bununla birlikte, bu metal-peptit bağlama çalışmalarındaki zorluklar, tüm sistemlerin sahip olmadığı tirozin gibi kromoforik amino asitleri araştırmaları, metal iyonunun klasik bir model altında bağlanması ve tekniğin fizyolojik koşullar altında elverişli olmayabilmesidir. Gerçekten de, bu tür kromoforik amino asitleri içermeyen veya klasik modellere bağlanmayan, bu tekniklerin kullanılmasını engelleyen birkaç peptit ortaya çıkmaktadır14,15. Bu makalede, fizyolojik olarak ilgili koşullar altında bu senaryolardaki bağlanma özelliklerini değerlendirmek için yaklaşımlar ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Biyolojik ligandlar, histidin üzerindeki imidazol halkası gibi metal iyon bağlanmasını etkileyebilecek farklı protonasyon durumlarını benimseyebilir. pH tutarlı bir şekilde korunmazsa, sonuçlar kıvrımlı veya çelişkili olabilir. Bu nedenle, tamponlar metal-protein / peptit etkileşimlerinin incelenmesinde önemli bir bileşendir. Bununla birlikte, birçok tamponun metal iyonları16,17 ile olumlu etkileşime girdiği gösterilmiştir. İlgilenilen biyolojik molekülle rekabet etmenin yanı sıra, tampon, peptid veya proteinin koordine edici atomlarından ayırt edilmesi zor olabilecek benzer koordine edici atomlara sahip olabilir. Bu çalışmada, tampon seçimi ile ilgili özel hususlar göz önünde bulundurularak, Cu(II)-peptid etkileşimlerini incelemek için iki tamamlayıcı teknik olarak elektronik absorpsiyon spektroskopisi ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) üzerinde durulmuştur.
Elektronik absorpsiyon spektroskopisi, metal bağlama etkileşimlerini incelemek için hızlı, yaygın olarak erişilebilir bir tekniktir. Ultraviyole (UV) veya görünür dalga boylarında ışıkla ışınlama, ligand sınıflandırması, metal geometrileri ve görünür bağlanma afiniteleri hakkında değerli bilgiler sağlayan metal merkezli d-d bantlarının emilimine yol açabilir18,19. Bu kompleksler için, metal iyonlarının protein veya peptit çözeltilerine doğrudan titrasyonları, bağlanma stokiyometrilerini ve görünür bağlanma afinitelerini ölçebilir. D5 veya d10 elektron konfigürasyonları gibi bazı durumlarda, kompleks ışığı emmez (yani, spektroskopik olarak sessizdir). Bu spektroskopik olarak sessiz geçiş metal komplekslerinde, bu sınırlamalar, metal iyonuna koordine edildikten sonra, tespit edilebilir yük transfer bantları veren rakip bir ligand kullanılarak aşılabilir. Her iki durumda da, bu yaklaşım sadece stokiyometriyi ve görünür bağlanma afinitesini ölçmekle sınırlıdır ve bağlayıcı entalpiye ilişkin hiçbir içgörü yaklaşımlar olmadan sağlanmamıştır.
Elektronik absorpsiyon spektroskopisinden elde edilen bilgileri tamamlayan ITC, bağlayıcı entalpi20'nin doğrudan ve titiz bir şekilde ölçülmesi için çekici bir tekniktir. ITC, bir bağlama olayı sırasında salınan veya tüketilen ısıyı doğrudan ölçer ve titrasyon sabit basınçta gerçekleştiği için ölçülen ısı, tüm dengelerin entalpisidir (ΔHITC). Ek olarak, bağlanma olayının (n) stokiyometrisi ve görünür bağlanma afinitesi (KITC) ölçülür. Bu parametrelerden, serbest enerji (ΔG ITC) ve entropi (ΔSITC) belirlenir ve bağlanma olayının termodinamik bir anlık görüntüsü sağlanır. Işık emilimine dayanmadığı için ITC, spektroskopik olarak sessiz türler, örneğin d5 veya d10 metal iyon kompleksleri için ideal bir tekniktir. Bununla birlikte, kalorimetri ısıyı ölçtüğünden, herhangi bir eşsiz tampon sistemi ve hesaplanmamış denge, metal iyonu bağlayıcı termodinamiği doğru bir şekilde belirlemek için analizi olumsuz yönde etkileyebilir ve bu faktörleri ele almak için büyük özen gösterilmelidir20. Uygun titizlikle gerçekleştirilirse, ITC metal-protein / peptit komplekslerinin termodinamiğini belirlemek için sağlam bir tekniktir.
Burada, iki tekniğin tamamlayıcı kullanımını göstermek için kromoforik olarak sessiz bir bakır bağlayıcı peptid olan C-peptid kullanılır. C-peptid, insülin olgunlaşması sırasında oluşan 31 kalıntı bölünme ürünüdür (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ); kromoforik kalıntılardan yoksundur, ancak Cu(II)'yi fizyolojik olarak ilişkili afinite14,15 ile bağladığı gösterilmiştir. Cu (II) bağlanma bölgesi, bir glutamat ve bir aspartatın yan zincirlerinden ve ayrıca peptid 14,15'in N-terminusundan oluşur. Bu koordine edici atomlar, yaygın olarak kullanılan birçok tamponlu sisteminkine çok benzer. Burada, elektronik absorpsiyon spektroskopisinde d-d ve yük transfer bantlarının ve ITC'nin C-peptide bağlanan Cu (II) termodinamiğini ölçmede tandem kullanımı gösterilmiştir. Cu(II) bağlanmasının C-peptide bağlanmasını incelemekten yaklaşım, diğer metal iyonlarına ve protein / peptid sistemlerine uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>1,10-fenantrolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>131377-25G</td><td></td></tr><tr><td>bis-Tris tamponu</td><td>Fisher</td><td>BP301-100</td><td></td></tr><tr><td>Şişe üstü 0.45 mikron membran</td><td>Nalgene</td><td>296-4545</td><td>Kirletici maddeler eklemeden reçineyi çıkaran herhangi bir filtreleme sistemi kabul edilebilir</td></tr><tr><td>Bakır(II) klorür</td><td>Alfa Aesar</td><td>12458</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Elektronik absorpsiyon spektrofotometresi</td><td>Varian</td><td>Cary 5000</td><td>Başka bir uygun hassas spektrofotometre kabul edilebilir</td></tr><tr><td>yüksek afiniteli reçinedir</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7901-25G</td><td></td></tr><tr><td>İzotermal titrasyon kalorimetresi (ITC)</td><td>TA Instruments</td><td>Nano ITC Düşük Hacimli</td><td></td></tr><tr><td>ITC analiz yazılımı</td><td>TA Instruments</td><td>NanoAnalyze</td><td>SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137&ndash; 148) ITC yazılımı da kullanılabilir</td></tr><tr><td></td><td>TA Instruments</td><td>ITCRun</td><td></td></tr><tr><td>hafif hizmet tipi hassas silecek</td><td>Kimwipe</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>yükleme şırıngası</td><td>Hamilton</td><td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td><td></td></tr><tr><td>uyumlu küvetler</td><td>Starna Cells, Inc</td><td>16.100-Q-10/Z20</td><td>Küçük hacimli küvet penceresinin spektrofotometrenin</td></tr> <tr>ışın yüksekliğine uygun olduğundan emin olun<td>MOPS tamponu</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12914</td><td></td></tr><tr><td>spektrofotometre yazılımı</td><td>Cary</td><td>WinUV Scan</td><td></td></tr><tr><td>elektronik tablo programı</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td>Herhangi bir uygun elektronik tablo programı</td></tr><tr><td>titrasyon şırıngası</td><td>çalışacaktır TA Instruments</td><td>5346</td><td></td></tr><tr><td>ultra saf su</td><td>Millipore Sigma</td><td>Milli-Q</td><td>>18 M & Omega olduğu sürece herhangi bir su tamam; direnç</td></tr></tbody></table>

kromoforların varlığında ve yokluğunda cu(ii) ve peptit kalıntıları arasındaki bağlanma etkileşimlerinin Ölçülmesi

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Bakır (II), biyolojik sistemlerde temel bir metaldir ve etkileşime girdiği biyomoleküllere benzersiz kimyasal özellikler kazandırır. Çeşitli peptitlere doğrudan bağlandığı ve aracılık yapısından elektron transfer özelliklerine ve katalitik fonksiyon vermeye kadar hem gerekli hem de patolojik rolleri oynadığı bildirilmiştir. Bu Cu(II)-peptid komplekslerinin in vitro bağlanma afinitesini ve termodinamiğini ölçmek, bağlanmanın termodinamik itici gücü, peptid için farklı metal iyonları veya Cu(II) için farklı peptitler arasındaki potansiyel rekabetler ve in vivo olarak Cu(II)-peptid kompleksinin prevalansı hakkında fikir verir. Bununla birlikte, bağlayıcı termodinamiğin nicelleştirilmesi, özellikle peptidi, d-blok metal iyonunu ve bunların etkileşimlerini temsil eden ayrı spektroskopik tutamakların bulunmadığı durumlarda, bir titrasyon deneyi içindeki tüm rakip dengelerin hesaplanması da dahil olmak üzere sayısız faktör nedeniyle zor olabilir.
Burada, Cu (II) -peptid termodinamiğinin doğru bir şekilde ölçülmesi için sağlam bir deney seti sağlanmıştır. Bu makalede, Cu(II) üzerinde gerekli spektroskopik tutamağı sağlamak için kromoforik ligandların varlığında ve yokluğunda elektronik absorpsiyon spektroskopisinin kullanımı ve etiketsiz izotermal titrasyon kalorimetrisinin kullanımı üzerinde durulmaktadır. Her iki deneysel teknikte de, tüm rakip dengeleri hesaba katacak bir süreç tanımlanmıştır. Bu makalenin odak noktası Cu(II) üzerinde olsa da, açıklanan deney seti Cu(II)-peptid etkileşimlerinin ötesine geçebilir ve fizyolojik olarak ilgili koşullar altında diğer metal-peptid sistemlerinin doğru bir şekilde ölçülmesi için bir çerçeve sağlayabilir.

Amaç, elektronik absorpsiyon spektroskopisi ve ITC'nin tamamlayıcı tekniklerini kullanarak C-peptide bağlanan Cu (II) termodinamiğini ölçmek ve doğrulamaktı. Elektronik absorpsiyon spektroskopisinin sağlam doğası nedeniyle, Cu(II)'nin 300 μM C-peptide doğrudan titrasyonu gerçekleştirilmiştir (Şekil 1). 150 μM Cu(II) ilavesi, Cu(II)'nin d-d bandına atfedilen 600 nm'de bantta ani bir artışa neden oldu ve 300 μM Cu(II) eklenene kadar artmaya devam etti. 300 μM Cu(II)'nin üzerindeki ilave ekleme...

Bu makale, peptitlere ve proteinlere bağlanan Cu(II)'nin termodinamiğini araştırmak ve ölçmek için elektronik absorpsiyon spektroskopisi ve izotermal titrasyon kalorimetrisinin kullanımına odaklanmaktadır.

Kromoforların Varlığında ve Yokluğunda Cu(II) ve Peptit Kalıntıları Arasındaki Bağlanma Etkileşimlerinin Ölçülmesi

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

Bu yöntem, araştırmacının, her ikisi de daha standart uygulamalar kullanarak genellikle zor olan peptitler ve birinci sıra geçiş metal iyonları gibi sistemleri incelemek için zor prob yapmasına izin verecektir. Buradaki temel avantaj, ortogonal teknikler kullanmaktır, çünkü birbirlerini iyi tamamlarlar ve bu da sistem hakkında daha fazla fikir verebilir ve herhangi bir fenomeni kaçırmamamıza yardımcı olabilir. Bu videoda ayrıntılı olarak açıklanan yöntem, diğer sistemleri incelemek için çok uygundur.Cu(II) ve bir peptit ile göstermemize rağmen, birçok farklı metal peptit ve metal protein etkileşimi için kullanılabilir. Bence en zor kısım, metal iyonunuz ve peptidiniz için iyi bir tampon seçeneği bulmak olacaktır. Daha önce başkaları tarafından hangi tamponların kullanıldığını görmek için literatüre başvururdum.Prosedürü gösteren, araştırma laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Sohee Choi olacak. Başlamak için, elektronik absorpsiyon spektrofotometresini açın ve kullanımdan önce yaklaşık 15 ila 20 dakika ısınmasına izin verin. Ardından spektrofotometre yazılımını başlatın ve 200 ila 900 nanometre tarama aralığı, saniyede 200 nanometre tarama aralığı ve düzeltilmiş çift ışın tabanı gibi parametreleri yapılandırın.Ardından, ışın yollarında küvet veya numune içermeyen bir taban çizgisi toplayın. Çift ışınlı spektrofotometrede iki eşleşen küvet kullanarak, bir küvete 115 mikrolitre ultra saf su ve diğer küvete 115 mikrolitre peptit numunesi ile doldurun ve küvetlerde hava kabarcığı olmadığından emin olun, çünkü bunlar sinyale müdahale edecektir. Daha sonra, küveti referans ışınına ultra saf su ile ve numune ışınına peptidli küvet yerleştirin.Daha sonra metal içermeyen peptidin absorpsiyon spektrumunu toplayın. Peptit numunesi ile küvete Cu(II)solüsyonunun substokiyometrik miktarını ekleyin ve daha sonra analiz için hacmi kaydedin. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlerken çözeltiyi karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı borulayın.Beş dakika boyunca dengeledikten sonra küveti numune hücre tutucusuna geri koyun ve absorpsiyon spektrumunu kaydedin. Ardından, çeşitli eşdeğerleri için peptit çözeltisine Cu (II) alikotlarının eklenmesini tekrarlayın ve küvete eklenen toplam Cu (II) hacmini kaydedin. Yazılımı daha önce iki eşleşen küvette açıklandığı gibi başlattıktan sonra, bir küvete 115 mikrolitre ultra saf su ve 115 mikrolitre bakır-fen kompleks çözeltisi içeren diğer küvet yükleyin.Küvetin referans kirişine su ile ve bakır-fen kompleks çözeltisi içeren küvetin numune kirişine yerleştirilmesini sağlayın. Daha sonra metal ligand kompleksinin absorpsiyon spektrumunu toplayın. Daha sonra, bakır-fen kompleks çözeltisine stokiyometrik miktarda peptit ekleyin ve herhangi bir hava kabarcığı sokmamaya dikkat ederken iyice karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı borulayın.Daha sonra, dengeye ulaşmak için çözeltiyi beş dakika boyunca inkübe edin. Küveti numune hücre tutucusuna geri koyun ve absorpsiyon spektrumunu kaydedin. Daha sonra, çeşitli eşdeğerleri için bakır-fen kompleks çözeltisine peptid alikotlarının eklenmesini tekrarlayın ve seyreltilmiş konsantrasyonun belirlenebilmesi için eklenen peptid hacmini kaydedin.İlk önce ITC'yi açın ve cihazı çalıştırmak için ITC yazılımını başlatın. İlk başlatmadan sonra, büreti yeniden yerleştirin ve ekrandaki talimatları izleyin. Ardından büreti ve kapağı referans hücresinden çıkarın.Daha sonra, referans hücresinden herhangi bir suyu çıkarın ve 450 mikrolitre gazdan arındırılmış ultra saf su ile üç kez durulayın. Şırıngaya hava kabarcıkları sokmamaya dikkat ederek ultra saf suyu bir yükleme şırıngasının 450 mikrolitre işaretine yavaşça çekin. Ardından, yükleme şırıngasını alttan yaklaşık bir milimetre uzakta olana kadar referans hücresine yerleştirin ve yükleme şırıngasında 150 mikrolitre kalana kadar çözeltinin bir kısmını yavaşça enjekte edin.Daha sonra, hücre yüzeyindeki kabarcıkları yerinden çıkarmak için yükleme şırıngası pistonunu birkaç kez yaklaşık 25 mikrolitre yukarı ve aşağı doğru hareket ettirin. Ardından, piston yükleme şırıngası üzerindeki 100 mikrolitre işaretine ulaşana kadar yavaşça enjekte edin, böylece referans hücresine toplam 350 mikrolitre ultra saf su dağıtın ve referans hücre kapağını değiştirin. Numune hücresinden herhangi bir artık çözeltiyi çıkardıktan sonra, bir yükleme şırıngası kullanarak 450 mikrolitre 10 milimolar EDTA yükleyin ve EDTA eser metalleri bağlayacağı için eser metal iyonlarının çıkarılmasını sağlamak için 10 dakika bekletin.EDTA çözeltisini çıkardıktan sonra, yükleme şırıngasını bol miktarda ultra saf su ile iyice durulayın. Numune hücresini ultra saf suyla durulayarak ITC'yi üreticinin talimatlarına uygun olarak temizleyin. Numune hücresinden kalan suyu çıkarın ve ardından 450 mikrolitre tamponla en az üç kez durulayarak numune hücresini şartlandırın.Ardından, numune hücresini koşullandıran artık tamponu çıkarın ve yükleme şırıngasını kullanarak peptid çözeltisini numune hücresine yükleyin. Daha sonra önce pistonu çıkararak titrasyon şırıngasını 200 mikrolitre tamponlu çözelti ile durulayın. Bir mikro pipet kullanarak, tampon çözeltisini cam titrasyon şırıngasının üstündeki delikten şırıngadan geçirin ve aşağıdaki iğneyi çıkarın.Daha sonra, pistonu titrasyon şırıngasına tamamen yerleştirin. Ardından, titrasyon şırınga iğnesinin ucunu metal çözeltiye batırın ve pistonu yavaşça yukarı çekerek metal çözeltinin şırıngayı doldurmasına neden olarak titrasyon şırıngasının cam kısmının üstünde bir boşluk hacmi oluşmasına neden olun. Boşluk hacmini gidermek için titrasyon şırıngasını zemine paralel olarak döndürün.Ardından pistonu çıkarın ve cam kısmı hafifçe zemine doğru eğin. Titrasyonun şırıngasını nazikçe sallayın, böylece çözelti titrasyon şırıngasının cam kısmına taşınır ve boşluk hacminin çoğunu doldurur. Ancak iki ila üç mikrolitre boşluk hacminin kaldığından emin olun.Şırıngayı zemine paralel tutarken pistonu tekrar takın. Ardından titrasyon şırıngasını dik tutun ve iğnenin ucunu tekrar metal çözeltiye batırın. Ardından, iğneden hava çıkmayı bırakana kadar pistonu aşağı doğru itin ve iğnenin ucunu çözeltide tutarken pistonu yavaşça 50 mikrolitre işaretinin hemen üstüne çekerek titrasyon şırıngasını yükleyin.Titrasyon şırıngasının cam kısmını dikkatlice bürete yerleştirin ve parmağınızı sıkana kadar vidalayın. Daha sonra, hafif hizmet tipi hassas bir silecek kullanarak, iğnenin ucuna dokunmadan pistonun sıkıştırılması nedeniyle titrasyon şırıngasından çıkan çözeltiyi emer. Ardından, büreti bir titrasyon şırıngasıyla numune hücresine yerleştirin ve güvenli bir şekilde sabitleyin.ITC yazılımının parametrelerini ayarlamak için Enstrüman Kontrolü'nü seçin. Karıştırma hızını ve sıcaklığı ayarlayın. Daha sonra Deney Detayları altında, şırınga ve hücre konsantrasyonlarını milimolar birimler halinde girin.Ardından, Deneme Yöntemi bölümünde Artımlı Titrasyon'u seçin. Kurulum'a tıklayın ve 2.5 mikrolitrelik 20 enjeksiyon belirtin ve bağlanma olayını gözlemlemek için daha fazla çözünürlük gerekiyorsa, enjeksiyon sayısını artırın ve enjeksiyon başına hacmi azaltın. Daha sonra, her enjeksiyon arasındaki zaman aralığını girin, böylece sinyalin dengelenmesi ve taban çizgisine geri dönmesi için yeterince uzun, tipik olarak 300 saniye.Ardından, denemeyi başlatmak ve verilerin nereye kaydedileceğini belirtmek için Çalıştır düğmesini tıklayın. Cu(II)'nin titrasyonunun C-Peptit'e dönüştürülmesi gerçekleştirildi ve 150 mikromolar Cu(II) ilavesinin Cu(II)'nin d-d bandına atfedilen 600 nanometrede bantta anında bir artışa neden olduğunu ve 300 milimolar Cu(II) eklenene kadar artmaya devam ettiğini gösterdi. 300 mikromolar Cu(II)'nin üzerindeki ilave eklemeler, doygunluğu gösteren d-d yasağının emilimini arttırmadı ve Cu(II), 1: 1 kompleksinde C-Peptit'e bağlandı ve log K değeri altıdan fazlaydı.C-Peptit, yaklaşık 10 mikromolar bakır-fen kompleksine titre edildi ve 265 nanometrede yük transfer bandından emilim, C-Peptit'in fenantropin ligandından Cu (II) 'yi 7.4 ila 7.8 log K değeri ile şelatlayabildiğini gösteren azaldı. ITC termogramı, 15 milimolar MOPS tamponunda 1,4 milimolar Cu(II)'nin 154 mikromolar C-Peptit'e titrasyonunu gösterir. Bağlanma afinitesinin log K değerinin sekizde olduğu ve entalpi değişiminde mol başına 8 kilojoule olduğu bulunmuştur.Gibbs serbest enerjiyi mol başına eksi 46 kilojoule olarak ve entropide kelvin başına mol başına 120 joule olarak değişir. C-Peptit yokluğunda 15 milimolar MOPS tamponuna 1,4 milimolar Cu(II)'nin kontrollü titrasyonunun termogramda bağlanma göstermez. Her şeyin temiz olduğundan emin olmak söyleyebilirim.Önceki deneylerden kalan metal iyonları veya peptitler varsa, stokiyometriyi büyük ölçüde etkileyebilir ve bağlama deneylerinde bilinmeyen bir rekabet sağlayabilir. Dairesel dikroizm, metal peptid veya metal protein etkileşimlerini incelemek için başka bir yöntemdir, çünkü kiraliteye bakar. Kütle spektrometresi, kütledeki değişikliklere bakarak bu kompleksleri de sorgulayabilir.Bu teknik seti, peptitler veya proteinlerle etkileşime giren metal iyonlarını inceleyen birçok laboratuvar tarafından kullanılmıştır.

quantifying-binding-interactions-between-cu-ii-peptide-residues

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Cu (I) içeren bir metalokoperon model peptidin NMR çözelti yapısı belirlendi ve numune hazırlama ve 1D ve 2D veri toplamadan üç boyutlu bir yapıya kadar ayrıntılı bir protokol açıklandı.

Peptit-Metal Komplekslerinin Yapı ve Koordinasyon Tayini 1D ve 2D 1H NMR Kullanılarak

Peptit dizisi taraması, protein-protein etkileşim bölgelerini tanımlamak için yüksek verimli bir testtir. Bu, bir hedef proteinin çoklu etkileşimlerinin haritalanmasına izin verir ve bir proteini hedef alan inhibitörler için bölgeleri belirlemek için bir yöntem olarak hizmet edebilir. Burada peptit dizilerini taramak ve analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Bu el yazması, işlevselleştirilmiş düzlemsel destekli lipid çift tabakası ile temas halinde olan bir T hücresinin immünolojik sinapsı içinde meydana gelirken, T hücresi antijen reseptörü (TCR) ile antijenik peptit yüklü MHC molekülleri arasındaki bağlanma dinamiklerini ölçmek için (tek moleküllü) Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) tabanlı testlerin nasıl yapılacağını açıklar.

TCR-pMHC Bağlama Ölçüm<em&gt; In Situ</em&gt; Bir FRET tabanlı Mikroskopi Assay kullanılarak

Bu protokol, reaktif saflaştırma, reaksiyon koşulları, Bioconjugate saflaştırma ve Bioconjugate karakterizasyonu dahil olmak üzere, bir maleimid proteini ihtiva eden bir sisteinin bioconjugation için gerekli olan önemli adımlar göstermektedir.

Protein Bioconjugatlar sentezi<em&gt; yoluyla</em&gt; Sistein-maleimid Kimya

Burada, fotoafinite etiketlemesi kullanarak küçük molekül bağlayıcı proteinlerin tanımlanması için bir yöntem açıklıyoruz. Bu tekniğin avantajı, hedef proteinlerin bağlanma ve kovalent etiketlemesinin canlı hücresel ortamda gerçekleşmesi ve hücre lizizi üzerine doğal protein yapısını ve bağlanma koşullarını bozma riskini ortadan kaldırmasıdır.

Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

HCN kanalları ve bunların yardımcı alt birimi arasındaki etkileşim Majör Depresif Bozukluk bir tedavi hedefi olarak tespit edilmiştir. Burada, bu protein-protein etkileşimi, küçük molekül inhibitörleri belirlemek için bir floresan polarizasyon tabanlı bir yöntem sunulmuştur.

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Burada, pH modülasyonuna dayalı etiketsiz bir yöntem kullanarak protein-fosfoinositid etkileşimlerini incelemek için bir mikroakışkan platform bağlamında desteklenen bir lipid çift katmanı sunmaktayız.

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Burada, bir modeli deneme ve nicel ölçümler dayalı bir analiz çözüm kaplama Bakır sülfat ısıtılmasıyla iyonu birikimi açıklanmıştır. Bu deney kaplama banyo ısıtılmasıyla iyonu birikimi sürecinin üretir.

Birikimi ve çözüm kaplama Bakır sülfat iyonu ısıtılmasıyla analizi

Iyon hareketlilik-kütle spektrometresi ve moleküler modelleme teknikleri, tasarlanmış metal bağlayıcı peptidlerin ve bakır bağlayıcı peptid metanobakinin seçici metal şelat performansını karakterize edebilir. Metal şelat peptidler yeni sınıflar geliştirilmesi metal iyon dengesizliği ile ilişkili hastalıklar için terapötik yol yardımcı olacaktır.

Metal Bağlama Oligopeptidlerinin Yapısı ve Mekanizmalarının Belirlenmesinde Iyon Hareketliliği-Kütle Spektrometresi Teknikleri ve Metal Bağlayıcı Oligopeptidlerin Redoks Aktivitesi

Bu makalede, ilgili üçlü metal komplekslerinin ayrışmasının nispi termokimyasını ölçmek için elektrosprey-iyon hareketliliği-kütle spektrometrisi, yarı ampirik kuantum hesaplamaları ve enerji çözümlü eşik çarpışma kaynaklı ayrışma kullanan deneysel bir protokol açıklanmaktadır.

İyon Hareketliliği-Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Ni(II) ve Zn(II) Üçlü Komplekslerinin Termokimyasal Çalışmaları

Keşfedin Cu(II) ve peptit bağlanma termodinamiğini elektronik absorpsiyon spektroskopisi ve izotermal titrasyon kalorimetrisi kullanarak. Bu yöntem metal-peptit etkileşimlerini kapsamlı şekilde anlamak için araştırmacılara güçlü bir çerçeve sunar.

Kromoforların Varlığında ve Yokluğunda Cu(II) ve Peptit Kalıntıları Arasındaki Bağlanma Etkileşimlerinin Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet