Fare Beyin Bölümlerinde Amiloid-Beta Yükünün Tam ve Alt Bölgesel Nicelleştirilmesi
19 Mayıs 2022
Mevcut protokol, Alzheimer hastalığının APP / PS1 transgenik fare modelinde amiloid-beta yükünü ölçmek için sagital fare beyin bölümlerinin tam bölge veya alt bölge analizini gerçekleştirme prosedürünü açıklar ve karşılaştırır.
Bu protokol, APP / PS1 transgenik farelerden beyin bölümlerinde ilgi alanlarının tam bölümlerinde ve ilgi alanlarının alt bölgelerinde amiloid-beta plak yükünü karşılaştırır. Bu özel protokolde sunulan yöntem ve sonuçlar, okuyucuların veya araştırmacıların, fare beyin bölümlerinde bir beta yükünü belirlemek için tam ilgi alanı veya alt ilgi alanı analizi arasında seçim yapmalarını sağlayacaktır. Başlamak için görüntü analiz yazılımını indirin.
Kurulumdan sonra, yazılımı başlatın ve dosyaya tıklayın, ardından analiz edilecek görüntüyü açın ve seçin. Yazılım araç çubuğundan düz aracı seçin ve ölçek çubuğunun uzunluğu boyunca düz bir çizgi çizin. Analize tıklayın, ardından ölçek ayarla sekmelerine tıklayın.
Yine, analize tıklayın, ardından ölçek çubuğunun uzunluğunu veya mesafesini piksel cinsinden not etmek için sekmeleri ölçün. Açılır pencerede, mesafeyi piksel cinsinden, ölçek çubuğunun bilinen mesafesini girin ve uzunluk birimini mikrometre olarak girin. Ardından, birden fazla görüntü işleniyorsa, yeni ölçek ayarını aşağıdaki tüm görüntülere uygulamak için genel kutuyu işaretleyin.
Ayarları uygulamak için Tamam'ı tıklatın. İstediğiniz ölçümü bölümün alanına ayarlamak için analize gidin, ardından ölçümleri ayarlayın ve alanı seçin ve etiket kutularını görüntüleyin. Analiz edilen görüntünün Yeniden Yönlendir sekmesi altında seçildiğinden emin olun.
Hipokampus veya korteks görselleştirme kolaylığı için görüntüye gidin ve parlaklığı veya kontrastı ayarlayın. Beynin ilgilendiği bölgeler veya yatırım getirisi tanımlanana kadar doku netliğini artırmak için maksimum kaydırma çubuğunu kademeli olarak sola sürükleyin. Hipokampus bölgesini özetlemek için çokgen veya serbest el seçim aracını kullanın.
Bölge ana hatlarıyla belirtildikten sonra, orijinal parlaklığa geri dönmek için parlaklık veya kontrast ayarlarının sıfırlama seçeneğine tıklayın. Seçilen bölgenin toplam doku alanını ölçmek için, düzenle'ye tıklayın ve dışarıyı temizleyin. Seçilen bölge ekrandaki tek görüntü olduğunda, analiz etmeyi tıklayın, ardından bir açılır pencerede analiz edilen toplam doku alanını elde etmek için ölçüm sekmelerini tıklayın.
Ardından, verileri bir Excel dosyasına kaydedin. 6-E10 lekeli pozitif alanı ölçmek için sırayla görüntü, ayar ve renk eşiği sekmelerine gidin. Eşik yönteminin altında önceden hazırlanmış bir filtre, en güçlü sinyalleri kırmızı renkte vurgulayarak istenen sonuçları sağlar.
Uygun eşiği seçtikten sonra, siyah bir arka plan üzerinde amiloid beta noktalarını vurgulamak için koyu arka planı kontrol edin. Seç, ardından orijinal üzerine tıklayın ve beyaz bir arka plan üzerinde amiloid beta birikintilerinin karanlık sinyallerini vererek tekrar seçin. Açılır pencere oluşturulduğunda, parçacıkları analiz et ve analiz et sekmesine tıklayın ve Tamam'a basın. Düzenle ve kopyala düğmelerine tıklayarak yazılım tarafından oluşturulan özet çıktıyı kopyalayın.
Ardından, daha önce başlatılmış Excel dosyasına ilgili etiketlerle yapıştırın. Formülü kullanarak yüzde 6E-10 pozitif alanını hesaplayın Görüntü analiz yazılımını indirdikten sonra, daha önce gösterildiği gibi, beyin yatırım getirisi tanımlanabilir olana kadar adımları uygulayın. Ardından, dikdörtgen aracını kullanarak, korteksteki veya hipokampustaki yatırım getirisini seçin.
Araç çubuğunda, düzenle'ye tıklayın, ardından yüksekliği ve genişliği önceden tanımlanmış bir değere dönüştüren sekmeyi seçin ve belirtin. Kutuyu tamamen doku tarafından kaplanacak şekilde ayarlayın. Parlaklığı veya kontrastı orijinal parlaklığa sıfırlayın.
Seçilen YG'yi kutuya sağ tıklayıp kopyaya tıklayarak çoğaltın. Seçilen bölgeyi içeren yeni bir pencere açılacaktır. Çoğaltılan görüntüyü, bulunduğu bölgeyi görüntüleyecek şekilde yeniden adlandırın.
Araç çubuğunu kullanarak ve görüntüye tıklayarak çoğaltılan görüntü türünü ayarlayın, ardından plakları en iyi şekilde analiz etmek için çoğaltılan RGB görüntüsünü 8 bit'e dönüştürmek için 8 bit tuşlar yazın. Düzenle'yi tıklayarak görüntüyü tersine çevirin, ardından ters çevirin. 6E-10 pozitif alanını ölçmek için görüntüye gidin, ardından ayarlayın ve eşik değerini belirleyin.
Eşik yönteminin altında önceden tanımlanmış bir filtre, en güçlü sinyalleri kırmızı renkle vurgulayarak istenen sonuçları sağlayacaktır. Uygun eşiği seçtikten sonra uygula'ya basın. 6E-10 pozitif alanını analiz etmek için, araç çubuğunu kullanın ve parçacıkları analiz et ve analiz et sekmelerine tıklayarak özetleme sonuçlarının kontrol edildiğinden emin olun.
Düzenle ve kopyala sekmelerine tıklayarak özet çıktısını yüzde alanıyla kopyalayın. Ardından, özet çıktısını ilgili etiketlerle önceden başlatılmış Excel dosyasına yapıştırın. Dokudaki farklı bölgeler için prosedürü tekrarlayın ve YG'yi ana hatlarıyla belirtmek için her kutunun yerleştirilmesinin her görüntü arasında tutarlı olmasını sağlayın.
Bu temsili değerlendirmede, korteks ve hipokampus beyin dokularındaki 6E-10 pozitif alanı ölçmek için tam ve alt ROI analiz yöntemleri karşılaştırılır. Tam ROI analizi, tüm ROI'nin ana hatlarını çizmeyi içerir. Buna karşılık, alt ROI analizi, ROI içinde önceden tanımlanmış bir bölgenin seçilmesini içerir.
Tam ve alt ROI 6E-10 pozitif alan ölçümü için kademeli prosedür, alt ROI ölçümü için ROI rotasyonu ile burada gösterilmiştir. Tam ve alt ROI analizleri arasındaki korelasyon burada gösterilmiştir. Korteks ve hipokampus için alt ROI analizi yapan iki okuyucu tarafından bildirilen 6E-10 pozitif alan arasında anlamlı bir pozitif korelasyon gözlenmiştir.
Ayrıca, ortalama alt ROI 6E-10 pozitif alanı, tam ROI kullanılarak elde edilen alanla güçlü, anlamlı bir pozitif korelasyon paylaştı. Alt ROI analizlerinde ortalama 6E-10 pozitif alan için, korteks ve hipokampusta anlamlı bir fark gözlenmedi. Eliza tarafından tüm beyin homojenatı ve çözünür amiloid beta 1-42 ölçümleri arasında anlamlı bir korelasyon gözlendi ve çalışmadan tam ROI analizi Eşik seçimi doğru veri ölçümü elde etmede anahtardır.
Pozitif lekelerin seçilen filtreyle doğru bir şekilde seçilmesini sağlamak için kullanıcı müdahalesi gerekir. Amiloid beta miktarının yanı sıra, bu yöntem diğer floresan immüno-lekeleri için de kullanılabilir. Örneğin, Iba-1, mikroglial pozitif alan niceliğinden.
Genel Bakış
Bu protokol, Alzheimer hastalığının APP/PS1 transgenik fare modelinde amiloit-beta yükünü ölçmek için tam bölge ve alt bölge analizlerinin sagit sağ fare beyin kesitlerinde detaylı bir karşılaştırmasını sağlar. Araştırmacıların beta yükünü değerlendirmek için yöntemlerini etkili bir şekilde seçmelerini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Alzheimer Hastalığı Araştırması
- Görüntü Analiz Teknikleri
Arka Plan
- Amiloit-beta plak birikimi, Alzheimer hastalığının bir özelliğidir.
- APP/PS1 fare modeli bu durumu incelemek için yaygın olarak kullanılır.
- Plak niceliği için yöntembilimi anlamak araştırma için kritiktir.
- Bu protokol, Alzheimer araştırmalarında yaklaşımları standartlaştırmaya katkıda bulunur.
Çalışmanın Amacı
- Amiloid-beta nicellemede tam bölge ve alt bölge analizinin etkinliğini karşılaştırmak.
- Araştırmacıların tekrar edebileceği adım adım bir prosedürü sağlamak.
- İki analitik yaklaşım arasındaki korelasyonu ve farklılıkları açıklamak.
Kullanılan Yöntemler
- Amiloit-beta yüklerini nicellemek için görüntü analiz yazılımı kullanılır.
- Analiz, APP/PS1 transgenik farelerden alınan beyin kesitleri üzerinde yapılır.
- Prosedürler, alan analizi için ölçümlerin ayarlanmasını ve doğru eşik belirlemesi için filtreler uygulanmasını içerir.
- Çoklu görüntüler, uygulanan küresel ölçekleme ayarlarıyla işlenebilir.
Ana Sonuçlar
- Karşılaştırmalı analiz, tam ve alt bölge analizleri arasında güçlü pozitif korelasyonlar gösterdi.
- İki yöntem arasında nicellenen amiloit-beta alanı arasında önemli farklılıklar gözlenmedi.
- Eşik seçimi, kesin nicelleme sonuçları için kritik olduğu kanıtlandı.
- Sonuçlar, amiloit-beta'nın ötesinde diğer floresan immüno boyalarının nicellenmesinde uygulanabilirliğini gösterdi.
Sonuçlar
- Çalışma, araştırmacıların amiloit-beta nicellemesinde uygun yöntemleri seçmelerine olanak tanır.
- Doğru eşik belirleme ve ölçüm tekniklerinin önemini vurgular.
- Elde edilen bilgiler, Alzheimer patolojisi ve ilgili sinir mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of amyloid-beta plaque load in transgenic mouse brain sections is critical for target validation and mechanistic de-risking in Alzheimer's disease research. This protocol enables standardized comparison of full-region versus sub-region quantification, supporting predictive confidence in preclinical model selection and assay development. Reliable measurement of amyloid-beta burden informs early discovery decisions and portfolio triage for neurodegenerative disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of amyloid-beta pathology in disease-relevant mouse models.
- Supports functional target validation by quantifying plaque burden across brain regions.
- Facilitates mechanistic de-risking by correlating full and sub-regional quantification outputs.
- Improves predictive confidence for advancing Alzheimer's disease targets.
Screening & Assay Development
- Standardizes image analysis workflows for reproducible quantification of immunostained brain sections.
- Provides quantitative outputs suitable for assay benchmarking and cross-study comparisons.
- Enables preparation of validated biological systems for downstream compound screening.
- Supports scalability and platform reuse for other fluorescent immuno-stains.
Translational & Preclinical Research
- Aligns quantification methods with translational biomarker strategies in Alzheimer's models.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by correlating ELISA and image-based readouts.
- Reduces biological risk in preclinical advancement decisions by providing reliable plaque load metrics.
Pipeline & Workflow Integration
This quantification protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for neurodegenerative disease research, supporting both early hypothesis testing and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise amyloid-beta measurement.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides statistical outputs and correlation analyses to compare full and sub-regional measurements.
- Translational Research: Connects image-based quantification with biochemical assays for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow adaptable to other immuno-stains and neurodegenerative targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in Alzheimer's disease models.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of plaque quantification workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing reliable target engagement metrics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodegenerative disease assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in image analysis and immunostaining interpretation.
- Depends on access to validated image analysis software and quantitative data infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of region-of-interest selection and thresholding parameters.
- Adaptable to various brain regions and fluorescent markers with consistent methodology.
- Accuracy is contingent on user intervention for threshold selection and region delineation.
