Name: Optik Cımbız Kullanarak Aktin Filament Demetlerinde Myosin Topluluk Mekaniğinin İncelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Öğrenin, optik cımbız kullanarak aktin filament demetlerinde myosin topluluk mekaniğini nasıl ölçebilirsiniz. Bu modüler yöntem, motor protein dinamiklerini yüksek hassasiyetle incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Mississippi Üniversitesi Lisansüstü Öğrenci Konseyi Araştırma Bursu (OA), Mississippi Üniversitesi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), NNX15AH78H (JCW, DNR) hibe numarası altında Mississippi Uzay Hibe Konsorsiyumu ve 848586 hibe numarası (DNR) altında Amerikan Kalp Derneği tarafından desteklenmektedir.

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Aktin filamentlerle etkileşime giren miyozin topluluklarının dinamiklerini araştırmak için floresan görüntüleme ile birlikte optik cımbız kullanan in vitro bir çalışma yapıldı. Aktin-miyosin-aktin demetleri, kas miyozin II, demetin dibinde ve kapak kayma yüzeyinde rodamin aktin ve demetin üstünde 488 etiketli, biyotinile aktin filamentleri kullanılarak birleştirildi. Tavşan kasından elde edilen aktin proteini, genel aktin tamponları (GAB) ve aktin polimerize edici tamponlar (APB) kullanılarak polimerize edildi v...

Motor proteinleri, kimyasal enerjiyi mekanik çalışmaya dönüştürerek yaşam için gereklidir 1,2,3. Myosin motorları, bir ize benzer filamentler boyunca adımlar atarak aktin filamentleri ile etkileşime girer ve aktin-miyozin ağlarının dinamikleri, diğer temel görevlerin yanı sıra kas kasılması, hücre hareketliliği, sitokinezi sırasında kasılma halkası ve hücre içindeki yükün hareketini gerçekleştirir 3,4,5,6,7,8 . Miyosinlerin çok önemli rolleri olduğundan, miyozin-aktin ağının işlevselliğindeki başarısızlık, hipertrofik kardiyomiyopatide (HCM) kalp hiperkontraktilitesine neden olan miyozin ağır zincirindeki mutasyonlar gibi hastalık gelişimine yol açabilir 9,10,11,12,13,14 . Kas kasılmasında, bireysel miyozin motorları, AF'lerin 4,15,16,17,18'in göreceli kaymasını gerçekleştiren gerekli mekanik enerjiyi sağlamak için bir topluluk olarak çalışarak birbirleriyle işbirliği yapar. Myosin motorları, AF'ler arasında çapraz köprüler oluşturur ve hizalanmış filamentlerin17,18,19,20,21 dikenli ucuna doğru toplu olarak hareket etmek için mekanokimyasal döngüsü nedeniyle konformasyonel değişiklikler kullanır.
Optik yakalama gibi teknikler kullanılarak SM düzeyinde kantitatif in vitro motiliteli testlerin geliştirilmesi, SM kuvvet üretiminin ve adım boyutlarının ölçülmesi de dahil olmak üzere bireysel miyozin motorlarının nasıl çalıştığına dair benzeri görülmemiş ayrıntıların toplanmasını kolaylaştırmıştır 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer ve ark., tek miyozin II motorlarının kuvvet oluşturma mekaniğini araştırmak için "üç boncuk" veya "dambıl" optik yakalama testini geliştirdiler23,31. Kas miyozin II, AF'leri sözleşmek için ekipler halinde çalıştığından, ancak SM seviyesinde işlemsel olmadığından, optik yakalama testi oryantasyonunun klasik motora bağlı boncuk yaklaşımı32'den yeniden düzenlenmesi gerekiyordu. Dambıl tahlilini oluşturmak için, bir AF'yi bir kapaklı boncuğa bağlı bir miyozin motoru üzerinde tutmak için iki optik tuzak kullanıldı ve tek motor tarafından kuvvet çıkışı, AF'nin tuzak23 içindeki hareketleriyle ölçüldü.
Bununla birlikte, SM kuvvetleri ve tek bir motor / tek filament tahlili oryantasyonu kullanarak, sistem düzeyinde kuvvet üretimi hakkında tam bir görüntü vermez, çünkü miyozin II de dahil olmak üzere birçok motor proteini izolasyonda çalışmaz ve genellikle parçalarının toplamı olarak işlev görmez 15,16,17,32,33,34,35,36 . Birden fazla filament ile etkileşime giren birden fazla motor içeren daha karmaşık yapılar, miyozin ve aktin filamentlerinin ağlarının sinerjisini daha iyi anlamak için gereklidir15,32. Dambıl tahlili oryantasyonu, bir boncuğa bağlı birden fazla miyozin bulundurarak veya bir yüzeye bağlı miyozin kalınlığında bir filament kullanarak ve motorların asılı AF 4,23,34,37,38,39,40 ile etkileşime girmesine izin vererek küçük topluluk kuvveti oluşumunu araştırmak için kullanılmıştır.
Diğer küçük topluluk tahlilleri arasında, miyozin motorlarının bir kapak kayması yüzeyine kaplandığı ve 4,35,36,38,39,40,41,42,43 motor ekibi tarafından üretilen kuvveti araştırmak için bir AF'ye bağlı bir boncuk kullanıldığı bir in vitro filament kayma testi bulunmaktadır. . Her iki durumda da, miyosinler sert bir yüzeye bağlanır - boncuk veya örtü kayması - ve bir AF kullanır. Bu gibi durumlarda, motorlar serbestçe hareket edemez veya birbirleriyle iletişim kuramazlar ve miyozinlerin katı bir şekilde bağlanmış olması, motorların sarkomer32'de birlikte çalışacağı uyumlu, hiyerarşik ortamı yansıtmaz. Önceki çalışmalar, miyozin II'nin çevresini algılayabildiğini ve kuvvet üretimi ve görev oranı41,44,45 gibi özellikleri değiştirerek değişen viskoelastik veya motor konsantrasyon koşullarına göre uyum sağlayabileceğini öne sürmüştür. Bu nedenle, miyozin II topluluk kuvveti üretiminin mekanik temellerinin daha gerçekçi bir resmini çizmek için motor iletişimini ve sistem uyumluluğunu teşvik eden ve yakalayan bir optik yakalama testi geliştirmeye ihtiyaç vardır.
Burada, iki aktin filamenti arasında etkileşime giren çoklu miyozin motorlarından oluşan aktomiyozin demetleri veya sandviçler oluşturarak hiyerarşik yapıyı in vitro optik yakalama ile birleştirmek için bir yöntem geliştirdik. Bu modüler tahlil geometrisi, moleküler ve çevresel faktörlerin topluluk miyozin kuvveti üretimini nasıl etkilediğini doğrudan araştırma yeteneğine sahiptir. Ayrıca, bu aktin-miyozin toplulukları aracılığıyla kuvvet oluşturma mekanizmalarının araştırılması, kas kasılması gibi büyük ölçekli hücresel görevlerinmoleküler seviye 9,10,13'ten nasıl yayıldığını modellemeye ve anlamaya yardımcı olma potansiyeline sahiptir.

<table><tbody><tr><td>Aktin proteini (biotin): iskelet kası</td><td>Hücre iskeleti</td><td>AB07-A</td><td>Biyotinile aktin proteini</td></tr><tr><td>Aktin proteini, tavşan iskelet kası</td><td>Hücre iskeleti</td><td>AKL99-A</td><td>Aktin proteini</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Aktin stabilizatörü ve Alexa Fluor 488 lekesi</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher scientific</td><td>BP413-25</td><td>Aktin için gereklidir montaj ve miyozin motilitesi</td></tr><tr><td>Beta-D-glukoz</td><td>Fisher bilimsel</td><td>MP218069110</td><td>Floresan görüntüleme sırasında fotoağartmayı azaltmak için kullanılan oksijen süpürme sisteminin bir parçası</td></tr><tr><td>Kurutma Derecesi Bloker (kazein)</td><td>Biorad</td><td>1706404</td> Spesifik olmayan bağlayıcı CaCl2Fisher scientific C79500'den <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>yüzeyi bloke etmek için kullanılırKalsiyum klorür, aktin miyozin ağının dinamikleri üzerinde gerekli kontrolü sağlar</td></tr><tr><td>Katalaz</td><td>bilimsel</td><td>ICN10040280</td><td>Floresan görüntüleme sırasında fotoağartmayı azaltmak için kullanılan oksijen süpürme sisteminin bir parçası</td></tr><tr><td>Lameller</td><td>Fisher scientific</td><td>12544C</td><td>Akış hücreleri yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher bilimsel</td><td>AC327190010</td><td>Tampon hazırlama</td></tr> <tr><td>için kullanılırEtanol</td><td>Fisher scientific</td><td>A4094</td><td>Regent lamelleri temizlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Glikoz oksidaz</td><td>Fisher scientific</td><td>34-538-610KU</td><td>Floresan görüntüleme sırasında fotoağartmayı azaltmak için kullanılan oksijen süpürme sisteminin bir parçası</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher scientific</td><td>P217-500</td><td>Tampon hazırlama için kullanılır</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher scientific</td><td>P250-1</td><td>Lamelleri aşındırmak ve ayarlamak için kullanılır tampon pH</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>M33-500</td><td>Tampon hazırlama için kullanılır</td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>Fisher scientific</td><td>12-544-2</td><td>Akış hücreleri yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Miyozin II proteini: tavşan iskelet kası</td><td>Hücre iskeleti</td><td>MY02</td><td>Tavşan iskelet kasından izole edilen tam uzunlukta miyozin motor proteini</td></tr><tr><td>Nanotracker2</td><td>Bruker/JPK</td><td>NT2</td><td>Optik yakalama aleti</td></tr><tr><td>Poli-l-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Aktin filamentlerinin lamel cam yüzeyine yapıştırılması</td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Hücre iskeleti</td><td>PHDR1</td><td>Aktin stabilizatörü ve rodamin floresan boyası</td></tr><tr><td>Streptavidin boncukları, 1 & mu; m</td><td>Spherotech</td><td>SVP-10-5</td><td>Optik yakalama kolu</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher scientific</td><td>PR H5121</td><td>Tampon hazırlama için kullanılır</td></tr></tbody></table>

optik cımbız kullanarak aktin filament demetlerinde myosin topluluk mekaniğinin İncelenmesi

Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

Miyosinler, ATP'yi aktin filament (AF) izleri boyunca adım atmak için hidrolize eden motor proteinlerdir ve motilitesi ve kas kasılması gibi hücresel süreçlerde gereklidir. Kuvvet üretme mekanizmalarını anlamak için, miyozin II hem tek moleküllü (SM) seviyede hem de optik yakalama gibi biyofiziksel yöntemler kullanılarak in vitro motor ekipleri olarak araştırılmıştır.
Bu çalışmalar, üç boncuklu bir düzenlemedeki tek moleküllü seviyeden, sert bir boncuk veya kayma düzeninde örtü kayması yüzeyinde birlikte çalışan motor gruplarına geçerken miyozin kuvvet üretme davranışının büyük ölçüde farklılık gösterebileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, bu tahlil yapıları, miyozin grup dinamiklerinin viskoelastik yapısal hiyerarşi içinde bir hücre içinde olduğu gibi değerlendirilmesine izin vermez. Çoklu aktin filamentlerle etkileşime giren miyozin toplulukları tarafından kuvvet oluşturma mekaniğini araştırmak için optik cımbız kullanan bir yöntem geliştirdik.
Bu aktomiyozin demetleri, motor iletişimi ve topluluk kuvveti çıkışını yakalayan hiyerarşik ve uyumlu bir ortamda araştırmayı kolaylaştırır. Tahlilin özelleştirilebilir doğası, miyozin topluluğundaki, aktin filament demetindeki veya çevredeki ortamdaki değişikliklerin farklı kuvvet çıktılarına nasıl yol açtığını anlamak için deneysel koşulların değiştirilmesine izin verir.

Aktomiyozin demet sistemlerini içeren akış hücreleri, mikroskop sürgüsü ve çift taraflı yapışkan banttan yapılmış bir kanalla ayrılmış kazınmış bir kapak kaymasından oluşan standart bir tasarıma sahiptir (Şekil 1). Tahlil daha sonra protokolde açıklandığı gibi aşamalı tanıtımlar kullanılarak kapaktan yukarı doğru oluşturulur. Son tahlil, şablon rodamin etiketli aktin filamentlerinden oluşur; istenen miyozin konsantrasyonu ( Şekil 2 ve Şekil 3'teki temsili sonuçl...

Aktomiyozin demetlerinin in vitro oluşumu ve optik cımbız kullanılarak miyozin topluluk kuvveti oluşumunun ölçülmesi sunulmuş ve tartışılmıştır.

Optik Cımbız Kullanarak Aktin Filament Demetlerinde Myosin Topluluk Mekaniğinin İncelenmesi

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

Bu protokolü kullanarak aktin davranışını araştırmak önemlidir, çünkü kullanıcının optik yakalama hassasiyetini kullanarak motor protein topluluk dinamiklerini araştırmasına izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, birçok optik yakalama deneyinde kullanılan geleneksel tek motorlu tek filament oryantasyonunun aksine, aktin yapısal hiyerarşisi içindeki miyozin mekaniğini ölçme yeteneğidir. Bu protokolün bir diğer avantajı, kullanıcının tahlili seçtikleri hiyerarşik sitoiskelet sistemine göre özelleştirmesini sağlayan modüler doğasıdır.Başlamak için, mikroskop slaytının ortasına birbirinden üç ila dört milimetre uzakta iki parça çift taraflı yapışkan bant uygulayın. Ardından, slaytın kenarından sarkan fazla bandı yırtın veya kesin. Daha sonra, bir kanal oluşturmak için mikroskop slaytının uzun eksenine dik olarak bandın üstüne PLL kaplı kapak kaymasını ekleyin.Kapak kaymasını bant ve mikroskop üzerine sıkıştırmak için küçük bir tüp kullanarak, bant şeffaf olana kadar iyice kaydırın, böylece akış kanalından sızıntıya neden olabileceğinden bantta kabarcık olmadığından emin olun. PLL akış hücresine 15 mikrolitre seyreltilmiş rodamin aktinini ekleyin ve fazla çözeltiyi akış hücresinden geç

probing-myosin-ensemble-mechanics-actin-filament-bundles-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu amaç, işletme ve roman yerçekimi kuvveti spektrometresi temsilcisi sonuçları gösteren bir adım adım kılavuz.

Fibröz Proteinler gerin ve Tedbir Roman Yerçekimi Kuvveti Spektrometresi kullanır gösterilmesi

Burada sunulan miyosin 5a'yı ifade etmek ve arındırmak için bir prosedür ve ardından hem topluluk hem de tek moleküllü in vitro floresan mikroskopi bazlı tahliller kullanılarak karakterizasyonu ve bu yöntemlerin nonmuscle miyosin 2b'nin karakterizasyonu için nasıl değiştirilebileceği tartışılmıştır.

İn vitro Floresan Mikroskopi Bazlı Hareketlilik Testlerinin Miyosin'e Özgü Uyarlamaları

Burada, prosesif miyosin-5 motorları üzerinde ultra hızlı kuvvet kelepçesi deneyleri gerçekleştirmek için kapsamlı bir protokol sunulmaktadır ve bu, diğer proses motor sınıflarının çalışmasına kolayca genişletilebilir. Protokol, deney cihazının kurulumundan numune hazırlama, veri toplama ve analize kadar gerekli tüm adımları detaylandırır.

İşlemsel Miyosinlerin Mekanoenzimatik Özelliklerinin Ultra Hızlı Kuvvet-Kelepçe Spektroskopisi ile Diseksiyonu

Bu protokol, optik cımbız kullanarak RNA-protein etkileşimlerini incelemek için eksiksiz bir deneysel iş akışı sunar. Optik cımbızın konfokal mikroskopi ile kombinasyonu da dahil olmak üzere çeşitli olası deneysel kurulumlar özetlenmiştir.

Çeviri Yönetmeliğinde RNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Optik Cımbız

Burada, izole embriyonik zebra balığı hücrelerinin hücre içi mekanik özelliklerini optik bir tuzakla doğrudan kuvvet ölçümü ile üç boyutlu hapsetmede araştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

Burada, mikrotübül demetlerini in vitro olarak yeniden yapılandırmak ve eşzamanlı optik yakalama ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak içlerinde uygulanan kuvvetleri doğrudan ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, aktif mikrotübül ağları içindeki protein toplulukları tarafından üretilen kuvvetlerin ve yer değiştirmelerin nano ölçekte ölçülmesine izin verir.

Yeniden yapılandırılmış aktif mikrotübül demetleri içindeki kuvvetleri doğrudan ölçme

Basit aktin filament mikroakışkan tahlilleri için, floresan mikroskobu ile birlikte, bireysel aktin filamentlerini gerçek zamanlı olarak doğru bir şekilde izlemeyi ve sırayla farklı protein çözeltilerine maruz bırakmayı sağlayan protokoller sunuyoruz.

Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

Bu yazıda, birlikte dolaşık aktin filamentleri ve mikrotübüllerinin ayarlanabilir üç boyutlu kompozit ağlarının mühendisliği ve karakterizasyonu için protokoller sunulmaktadır. Kompozitler, miyozin II ve kinesin motorları tarafından tahrik edilen aktif yeniden yapılanma ve balistik harekete uğrar ve aktin, mikrotübüller, motor proteinler ve pasif çapraz bağlayıcıların göreceli konsantrasyonları tarafından ayarlanır.

Aktin-Mikrotübül Kompozitlerinin Ayarlanabilir Motor Tahrikli Dinamiği ve Mekaniği ile Yeniden Yapılandırılması ve Karakterize Edilmesi

Bu çalışmada, kontrollü koşullar altında aktomiyosin jellerinin poroelastisitesini incelemek için in vitro rekonstrüksiyon yaklaşımı kullanılmıştır. Aktomiyosin jelinin ve gömülü çözücünün dinamikleri, ağ poroelastisitesinin gösterildiği şekilde ölçülür. Ayrıca deneysel zorlukları, ortak tuzakları ve hücre hücre iskeleti mekaniği ile olan ilgisini tartışıyoruz.

Hücre Hücre İskeletinin Model Sistemi Olarak (Poro-)Elastik Kasılma Aktomyosin Ağlarının Mekaniği

Burada, saflaştırılmış proteinlerden yarı iki boyutlu (2D) dolaşık, çapraz bağlı ve sıvı kristal aktin düzeneklerinin hazırlanması için yöntemler sunuyoruz.

Aktif Aktin Bazlı Montajların Kasılma ve Deformasyon Modlarının In Vitro Olarak Ayarlanması: İki Boyutlu Aktif Ağlardan Sıvı Kristal Damlalara

Öğrenin, optik cımbız kullanarak aktin filament demetlerinde myosin topluluk mekaniğini nasıl ölçebilirsiniz. Bu modüler yöntem, motor protein dinamiklerini yüksek hassasiyetle incelemenizi sağlar.

Optik Cımbız Kullanarak Aktin Filament Demetlerinde Myosin Topluluk Mekaniğinin İncelenmesi

Daha fazla video keşfet