Temizlenmiş Beyinlerde Astrositler ve Nöronlar Arasındaki Mekansal Etkileşimin İncelenmesi
31 Mart 2022
CLARITY yöntemini kullanarak viral vektör iletimini ve beyin temizlemeyi birleştirmek, aynı anda çok sayıda nöron ve astrositin araştırılmasına izin verir.
İlk olarak 2013 yılında tanımlanan berraklık tekniği, daha büyük miktarlarda hücrenin, kan damarlarının, yani proteinlerin bile kalın beyin dilimlerinde tek bir hücre çözünürlüğü gibi örneklemelerini sağlayan bir doku temizleme tekniğidir. Bu teknik, tüm beyni şeffaf hale getirerek bozulmamış mikroskobik yapıların incelenmesini sağlar. Bu protokol, doku temizliği için basit bir çip ve basit bir boru hattıdır.
Bu teknik, beyin dokularına ek olarak diğer sistemlerdeki dokuları temizlemek için kullanılabilir. Başlamak için, tüpü ve kapağı parafilm kullanarak kapatın ve kapaktaki iki deliği delin. Ardından, beş milimetre iç çapa sahip esnek bir boru ve ucuna bağlı 19 gauge iğne kullanarak azot gazını tanktan aktarın.
Boruyu tüpe bağlayarak ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca gaz değişimine izin vererek gaz gidermeye başlayın. Boruyu ayırın ve delikleri hemen modelleme kili ile kapatın. Daha sonra, hidrojel çözeltisini polimerize etmek için gaz giderici tüpleri 3 1/2 saat boyunca 37 santigrat derece banyoya aktarın.
Beyni tüpten çıkarın. Laboratuvar mendilleri kullanarak, beynin etrafındaki polimerize hidrojeli çıkarın ve beynin yüzeyine bağlı kalan hiçbir artık jel kalmamasını sağlayın. Beyni tüm ilgi alanlarını içeren kalın dilimlere bölün.
Dilimleri ilk temizleme çözeltisine koyun ve 24 saat boyunca 70 RPM'de rotasyonla 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu arada, beyni yerleştirmek için delikli bir tüp hazırlayın. Delikli tüpü, karıştırma cihazında ikinci temizleme çözeltisi ile doldurulmuş bir beherin içine koyun.
Daha sonra beyni beherin içine yerleştirin ve ağartmayı önlemek için alüminyum folyo ile kapatın. Doku şeffaf hale geldikten sonra, beyni 24 saat boyunca 70 RPM'de rotasyonla 37 santigrat derecede inkübe halinde PBST'ye aktarın. Çözeltiyi taze PBST ile değiştirin ve inkübasyona 24 saat daha devam edin.
Daha sonra beyni 24 saat boyunca oda sıcaklığında PBS'ye aktarın. 24 saat sonra, beyni PBS'den çıkarın ve kırılma indisi eşleştirme çözeltisine aktarın. Beyni bir gecede 37 santigrat derecede inkübe edin.
İlk olarak, örneği slaytın ortasına yerleştirin. Sıcak tutkal kullanarak, slaytın kenarlarında, neredeyse doku kadar yüksek duvarlar oluşturun. Köşelerden birinde küçük bir boşluk bıraktığınızdan emin olun.
Sıcak tutkal tabakası beyin diliminin yüksekliğine yaklaştıkça, üst yüzeyi nemlendirmek ve kabarcık oluşumunu önlemek için numune üzerine bir ila iki damla kırılma indisi eşleştirme çözeltisi uygulayın. Sıcak tutkal hala sıvı iken, üst kısmı bir kapak kayması ile kapatın, mümkün olduğunca eşit bir şekilde yerleştirin ve ardından odayı kırılma indisi eşleştirme çözeltisi ile doldurun. Boşluğu sıcak tutkalla kapatın.
Sıcak tutkal duvarları kızağın sınırlarının ötesine uzanıyorsa, uzatma kenarlarını kesin. Görüntüleme için bir yağ daldırma hedefi kullanılıyorsa, daldırma çözeltisini korumak için kapak kaymasının üzerindeki duvarlara iki ila üç milimetre daha yapıştırıcı ekleyin. Bu protokolden sonra beyin dokusu temizlenecektir.
Fare hipokampusunun CA1 bölgesindeki astrosit ve nöron popülasyonlarını görselleştirmek için bu protokol kullanılarak berrak beyin dilimleri hazırlandı. Tüm astrositler tdTomato eksprese etti ve uyarıcı nöronlar çekirdeklerinde H2B-GFP eksprese etti. Berraklaştırılmış doku için hazırlanan oda, iki foton veya konfokal mikroskop altında görüntüleme için en uygunuydu.
İki foton mikroskobu kullanılarak, fare hipokampusunun CA1 bölgesinin temizlenmiş bir bölümünde 300'den fazla astrosit gözlendi. Kırmızı ve piramidal hücrelerdeki hipokampal astrositler, yeşil renkli somata, bu iki hücre tipi arasındaki uzamsal yakınlığı temsil eden görünür ve kalın, şeffaf dokulardı. Taramalı bir lazer konfokal mikroskop kullanılarak, uyarıcı nöronlardan aksonal demetler tüm yarımküre boyunca izlendi.
Yeşil demetler dorsal hipokampustan süper mamillary cisimlere doğru izlendi. Kırmızı demetler, mamillary cisimlerden havalandırma hipokampüsündeki kökenlerine doğru izlendi. Sıcaklık, konsantrasyonlar ve inkübasyon süresi gibi faktörler netlik prosedürünün sonucunu etkiledi.
Bu nedenle, protokolün her adımındaki hassasiyet, berrak dokuya ulaşmanın başarısı için hayati öneme sahiptir. Bu tekniği kullanarak, çeşitli beyin yapılarındaki nöronlar ve astrositler arasındaki mesafeleri ölçüyoruz. Bu protokol, önceki çalışmalara göre iki ila üç büyüklük sırasına göre daha fazla hücrenin analizine izin verdi.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, fare hipokampusundaki nöronlar ve astrositler arasındaki mekansal ilişkileri araştırmak için viral vektör transdüksiyonu ile birleştirilmiş CLARITY yöntemini kullanır. Dokuyu şeffaf hale getirerek, bu teknik araştırmacıların daha fazla hücreyi incelemesine olanak tanır ve hücresel organizasyon ve etkileşimler hakkında bilgiler ortaya çıkarır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Doku şeffaf hale getirme teknikleri
- Hücresel görüntüleme
Arka Plan
- CLARITY tekniği, beyin dokusunun hücresel düzeyde görselleştirilmesini sağlar.
- Büyük nöron ve astrosit popülasyonlarının bütün dokular içinde analizini sağlar.
- Bu yöntem, geleneksel görüntüleme yöntemlerine kıyasla kalın beyin dilimlerinin netliğini artırır.
- Çalışma, nöronal mimari anlamında doku şeffaflığının rolünü vurgular.
Çalışmanın Amacı
- Fare hipokampusundaki astrositler ve nöronlar arasındaki yapısal ilişkileri araştırmak.
- Farklı beyin yapıları boyunca çeşitli hücre tipleri arasındaki mesafeleri ölçmek.
- Hücresel görüntülemede CLARITY yönteminin etkinliğini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Çalışmada beyin dilimlerinde doku şeffaf hale getirme için CLARITY tekniği kullanıldı.
- Astrositler ve eksitatör nöronları görselleştirmek için fare hipokampal dokusu kullanıldı.
- Çoklu omikler iş akışlarından bahsedilmedi.
- Ana adımlar arasında degazlama, hidrojel polimerizasyonu ve şeffaf hale getirme solüsyonlarında inkübasyon bulunuyordu.
- Doku, iki foton ve konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülendi.
Ana Sonuçlar
- Şeffaf hale getirilmiş hipokampal kesitlerde 300'den fazla astrosit görselleştirildi.
- Astrositlerin ve eksitatör nöronların mekansal bağlamı belirlendi ve yakınlıkları gösterildi.
- Şeffaf dokularda nöronal popülasyonlar arasında aksonel demetlerin önemli gözlemleri yapıldı.
- Dokuların netliğini etkileyen çeşitli faktörler, hassas metodolojinin gerekliliğini vurguladı.
Sonuçlar
- Bu çalışma, CLARITY yönteminin beyindeki hücresel ilişkilerin görselleştirilmesini önemli ölçüde artırabildiğini gösterir.
- Bulgular, nöronların ve glial hücrelerin mekansal organizasyonunu daha iyi anlamamızı sağlar.
- Bu yöntemden elde edilen bilgiler, nöronal mekanizmalar ve olası hastalık modelleri üzerindeki araştırmalar için etkileri olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
High-resolution mapping of astrocyte-neuron spatial interactions in intact brain tissue addresses a critical gap in early CNS target validation and mechanistic de-risking. The integration of viral vector labeling with CLARITY tissue clearing enables quantitative, large-scale analysis of cellular domains, supporting predictive confidence in neurobiological discovery. This capability enhances portfolio triage by providing robust, scalable data on cell-type interactions relevant to disease modeling and target prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of astrocyte-neuron spatial relationships in disease-relevant brain regions.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular domain boundaries and proximity metrics.
- Facilitates functional target validation through genetically defined cell-type labeling and imaging.
- Provides high-content data for predictive confidence in CNS target selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, intact brain tissue systems for downstream imaging-based assays.
- Standardizes sample preparation for reproducible, quantitative spatial measurements.
- Enables scalable imaging of hundreds to thousands of cells per sample for robust screening.
- Supports assay development for compound evaluation targeting neuron-glia interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial mapping outputs with disease-relevant CNS models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by providing quantitative benchmarks for cell-type interactions.
- Supports biomarker discovery through high-resolution mapping of cellular domains.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation in neurobiology portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content spatial analysis of genetically defined brain cell populations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on astrocyte-neuron interactions and clarifies mechanistic pathways in CNS tissue.
- Screening: Provides reproducible, quantitative spatial readouts for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Delivers cell proximity and domain occupancy metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects spatial mapping data to disease models and biomarker strategies when supported by the system.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for CNS tissue clearing and imaging across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes tissue clearing and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiological assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector transduction, tissue clearing, and advanced microscopy.
- Demands access to two-photon or confocal imaging platforms and analytical infrastructure.
- Necessitates strict protocol standardization for cross-team reproducibility.
- Adaptation may be needed for different brain regions or model systems.
- Protocol precision is critical; temperature, reagent concentrations, and timing directly affect data quality.
