Name: Temizlenmiş Beyinlerde Astrositler ve Nöronlar Arasındaki Mekansal Etkileşimin İncelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Öğrenin fare hipokampusunda astrositler ve nöronlar arasındaki mekansal ilişkileri CLARITY yöntemiyle incelemeyi. Bu teknik, kalın beyin dokularında hücresel organizasyonu görselleştirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı (hibe anlaşması No 803589), İsrail Bilim Vakfı (ISF hibe No. 1815/18) ve Kanada-İsrail hibeleri (CIHR-ISF, hibe No. 2591/18) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi'nden (ERC) finansman almıştır. Nechama Novic'e tüm el yazması hakkında yorum yaptığı için teşekkür ederiz.

Deneysel protokoller İbrani Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüsü Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun yönergelerini karşıladı.
1. Viral vektör transdüksiyonu
NOT: Viral vektör iletimi, beyindeki floroforları eksprese etmek için kullanılır.
<ol><li>Hedef alanın ilgili koordinasyonunu bulmak için bir atlas (örneğin, Allen Beyin Atlası) kullanın. NOT: 3B atlaslar çevrimiçi olarak bulunabilir (örneğin, http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).</li>
	<li>Stereotaktik cerrahi kullanarak, viral vektörleri ilgili beyin yapısına enjekte edin. Ayrıntılı bir protokol için9'a bakın.</li>
	<li>Florofor ekspresyonu için 3-6 hafta bekleyin. NOT: Sadece hücre gövdelerinin işaretlenmesi gerekiyorsa kısa bir süre yeterlidir. Aksonal projeksiyonlar soruyla ilgiliyse, floroforların birkaç milimetre uzunluğunda olabilen aksonlarda eksprese edilmesi daha uzun sürdüğü için uzun bir süreye ihtiyaç duyulacaktır.</li>
	<li>Florofor ekspresyonunun (hem viral ekspresyon hem de TG hayvanlarının) özgüllüğünü ve penetransını önceden doğrulayın (Şekil 1A). CLARITY prosedürüne geçmeden önce, ince dilimler için en az bir beyin belirleyin ve florofor ekspresyonunun hem güçlü hem de hedef hücre özelliğine özgü olduğundan emin olun.</li>
</ol>2. NETLİK
NOT: Bu yöntem beyni 2-6 hafta içinde saydam hale getirir.
<ol><li>Soğuk Fosfat tamponlu Salin (PBS) ve ardından PBS'de% 4 Paraformaldehit (PFA) kullanarak hayvanlar üzerinde transkraniyal perfüzyon uygulayın. Beyni çıkarın ve 50 mL'lik bir tüp veya benzeri bir kapta 4 ° C'de gece boyunca PFA'da tutun. NOT: Transkraniyal perfüzyon yapılmadan önce, hayvan derin anestezi altına alınmalıdır. Bu protokolde sunulan örneklerde, tüm hayvanlar Ketamin ve Ksilazin (sırasıyla% 90 ve% 10) kullanılarak uyuşturulmuştur.</li>
	<li>PFA'yı 4 °C'de 48 saat boyunca Hidrojel Çözeltisi (HS; bakınız Tablo 1) ile değiştirin. NOT: Bu aşamada malzemelerin soğutma sıcaklığından (4-8 ° C) daha sıcak olmasına izin vermeyin, aksi takdirde Hidrojel polimerize olur. Bu protokolde kullanılan HS, önceki protokollerin aksine% 4 veya% 17 öneren% 2 akrilamid içerir. %2'nin faydası tartışma bölümünde detaylandırılmıştır. HS'yi hazırlarken, buz gibi soğuk bir yüzey üzerinde çalışın. -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>Gazdan arındırma NOT: Bu aşamanın amacı,O2 polimerizasyon işlemine müdahale ettiği için dokudaki tüm serbest oksijeni uzaklaştırmaktır. O2 olmayan herhangi bir gaz kullanılabilir (örneğin, N 2, CO2); N2 önerilir.<ol>
<li>N2'yi , ucundaki 19 G'lik bir iğneye bağlı 5 mm'lik (iç) esnek bir boru ile tanktan aktarın (Şekil 1B).</li>
		<li>Tüpün kapağında iki küçük delik (iğne genişliğinde) açın: biri gazı sokmak için, diğeri havanın tüpten ayrılmasına izin vermek için (Şekil 1C).</li>
		<li>BoruyuN2 gazından tüpe takın ve gazları oda sıcaklığında (RT) yaklaşık 30 dakika boyunca değiştirin.</li>
		<li>Boruyu çıkarın ve delikleri hemen her tüpte modelleme kili ile kapatın (Şekil 1D).</li>
	</ol></li>
	<li>Gazdan arındırılmış sızdırmaz tüpleri, bir jel haline gelecek olan HS'yi polimerize etmek için 3,5 saat boyunca 37 ° C'lik bir banyoya aktarın. Tüpleri sallamamaya dikkat edin (Şekil 1E).</li>
	<li>Beyni tüpten çıkarın ve laboratuvar mendilleri kullanarak polimerize jeli etrafından yavaşça çıkarın. Doku yüzeyine bağlı artık jel kalmadığından emin olun, çünkü aşağıdaki adımlarda çözelti ile reaksiyona girerek doku temizleme işlemini inhibe edebilir (Şekil 1F). NOT: Jel PFA içerdiğinden, ekstraksiyon bir duman başlığı altında yapılmalıdır.</li>
	<li>Eldeki soru sadece bir kısmını gerektiriyorsa beyni dilimleyin. Ikiye veya tüm ilgi alanlarını içeren çok kalın dilimlere bölün (Şekil 1G).</li>
	<li>Dilimleri Birinci Temizleme Çözeltisine (CS1, bakınız Tablo 2) yeni bir kaba yerleştirin ve 37 °C'de 24 saat boyunca 70 rpm'de çalkalayın.</li>
	<li>Beyni CS1'den ikinci Temizleme Çözümüne aktarmak için aşağıda açıklanan adımları izleyin (CS2, bkz. Tablo 2).<ol>
<li>Beyin için önceden delikli bir tüp hazırlayın (Şekil 1H).</li>
		<li>CS2'yi tüpü içerecek kadar büyük bir beherde 40-45 °C'ye kadar önceden ısıtın. Bunu karıştırıcılı bir ocakta yapın. İfade edilen proteinlerin ağartılmasını önlemek için sıcaklığın 55 ° C'ye ulaşmadığından emin olun.</li>
		<li>CS2 ile doldurulmuş beheri ve delikli tüpü bir karıştırma cihazına ( Şekil 1I'de 2 L beher) yerleştirin. Sıvının dokuyu bozmadan akmasına neden olacak ılımlı bir karıştırma hızı ayarlayın. NOT: 2-6 hafta içinde doku saydam hale gelecektir (süreç çevreden başlar ve merkezi beyin yapılarına doğru içe doğru hareket eder). Dokunun ne zaman "yeterince açık" olduğuna dair karar kişisel yargıya bağlıdır. Beyin, mikroskop altında girişim olmadan görüntüleme için yeterince şeffaf olmalıdır (Şekil 1J yeterince açık değildir; Şekil 1K yeterince açık). Dokunun yeterince berrak olduğu noktanın aşılması doku sertliğinin kaybına neden olabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>CS2'den PBST'ye (PBS'de %0,5 Triton X-100, bakınız Tablo 2) 37 °C'de yeni bir kapta 24 saat boyunca hafif sarsıntı (70 rpm) ile aktarın. NOT: PBST'de doku beyazımsı hale gelecektir (Şekil 1L). Netlik, Kırılma İndisi Eşleştirme Çözümüne (RIMS, bkz. adım 2.14) yerleştirildiğinde geri döner (ve iyileşir).</li>
	<li>PBST'yi yeni PBST ile değiştirin. Aynı koşullar altında (hafif sallanma ile 37 ° C) 24 saat daha saklayın.</li>
	<li>PBST'yi tekrar yeni PBST ile değiştirin ve RT'de 24 saat boyunca saklayın.</li>
	<li>RT'de PBS'ye 24 saat boyunca aktarın.</li>
	<li>PBS'yi değiştirin ve RT'de 24 saat daha bekletin.</li>
	<li>Beyni PBS'den çıkarın ve gece boyunca 37 ° C'de RIMS'ye aktarın. NOT: Başlangıçta, RIMS'deki dalgalanmalar beyni çevreleyebilir. Bu protokol iki özel ticari RIMS kullanılarak tasarlanmış ve doğrulanmıştır (bkz. Tablo 3). Bununla birlikte, protokol diğer RIM'leri (ticari veya kendi kendine yapılan) kullanırken farklılık göstermemelidir.</li>
	<li>Dokuyu RT'de 24 saat daha veya çözelti tam dengeye ulaşana kadar, yani doku şeffaf hale geldiğinde ve çözelti artık görünür dalgalanmalar içermediğinde tutun (Şekil 1M).</li>
	<li>Doku şeffaf ise, oda hazırlığına devam edin. Bu noktada, doku şeffaf yerine beyaz hale gelirse (artık SDS moleküllerinin agregaları nedeniyle), 2.9 ve 2.10 adımlarını tekrarlayarak numuneyi tekrar temizleyin ve dokuyu birkaç gün boyunca CS2'ye (adım 2.8) aktarın, ardından adım 2.15'e kadar tüm adımları izleyin.</li>
</ol>3. Oda hazırlığı
NOT: Her numune, numunenin yerleştirileceği görüntüleme odasına sahip bir slayt gerektirir.
<ol><li>Örneği slaytın ortasına yerleştirin.</li>
	<li>Sıcak bir tutkal tabancası kullanarak, slaytın kenarlarında, neredeyse doku kadar yüksek duvarlar oluşturun. Köşelerden birinde küçük bir boşluk (yaklaşık 5 mm) bıraktığınızdan emin olun (Şekil 2A,B).</li>
	<li>Üst yüzeyi nemli tutmak ve kapak kayması ile doku arasında kabarcıklar oluşmasını önlemek için numuneye 1-2 damla RIMS uygulayın.</li>
	<li>RIMS damlalarını uyguladıktan hemen sonra, duvarlara son sıcak yapıştırıcı tabakasını ekleyin (böylece beynin / dilimin yüksekliğine ulaşırlar) ve hemen (sıcak tutkal hala sıvı iken) adım 3.5'e ilerleyin.</li>
	<li>Üstünü bir kapak kayması ile kapatın, hala ılık sıcak tutkal tabakasının üstüne mümkün olduğunca eşit bir şekilde yerleştirin (Şekil 2C).</li>
	<li>Odayı sıcak tutkal duvarlarında kalan boşluktan RIMS ile doldurun (Şekil 2D, E).</li>
	<li>Boşluğu sıcak tutkalla kapatın. İçeride hava bırakmayın (Şekil 2F).</li>
	<li>Sıcak tutkal duvarları kızağın kenarlıklarının ötesine uzanıyorsa, uzatma kenarlarını kesin (Şekil 2G).</li>
	<li>Görüntüleme için kullanılan objektif daldırılırsa, daldırma çözeltisinin daha uzun süre dayanması için kapak kaymasının üzerindeki duvarlara 2-3 mm yapıştırıcı daha ekleyin (Şekil 2H).</li>
</ol>4. Görüntüleme (konfokal veya iki foton)
<ol><li>Odanın kalınlığı birkaç milimetreye ulaşabileceğinden, sahnenin odayı tutup tutamayacağını kontrol edin. NOT: Örneğin, bu protokolde kullanılan konfokal mikroskop ( Malzeme Tablosuna bakınız) birkaç aşama (örneğin, dairesel, dikdörtgen) ile donatılmıştır. Odayı tutmak için hangi aşama seçilirse seçilsin, parametreleri oda boyutlarına uyduğu sürece önemsizdir.</li>
	<li>Yeterli bir çalışma mesafesine, yani 3 mm'≥ minimum çalışma mesafesine sahip bir hedefle çalışın, çünkü ilgilenilen beyin bölgesi birkaç milimetre derinlikte olabilir ve kapak kayması manuel olarak yerleştirildiği gibi tamamen düz olmayabilir. NOT: Bir gösterim olarak, Şekil 1, Video 1 ve Video 2'de sunulan sonuçlar, 652 x 483 μm görüş alanı ve düzlemler arasında 0.937 μm aralıklarla bir z-yığını elde etmek için 3 mm çalışma mesafesi ve 2.4 büyütme ile bir su daldırma 16x hedefi kullanılarak iki fotonlu bir mikroskop altında elde edilmiştir.</li>
	<li>Birkaç saat hatta günler sürebilen çok alanlı görüntüleme gerçekleştirin. Her görüntünün boyutu onlarca gigabit'e kadar ulaşabileceğinden, bilgisayarda bol miktarda boş depolama alanı olduğundan emin olun. NOT: CLARITY görüntüleme, derinlikte önemli ölçüde daha fazla görüntü bölümüne neden olabilir. Bu nedenle, görüntü toplama sırasında aşırı ifadeyi önlemek için ifadeyi yakalamak için kullanılan yoğunluklar nispeten düşük olmalıdır.</li>
	<li>Daldırma hedefleri için, görüntüleme sırasında sıvıyı rutin olarak kontrol edin ve gerekirse ek sıvı ile destekleyin. NOT: Video 3'te sunulan verilerin görüntülenmesi sırasında, buharlaşmayla mücadele etmek için odanın yüzeyine her 6-8 saatte bir su eklenmiştir.</li>
	<li>Görüntü alındıktan sonra, birkaç farklı yazılım paketi kullanarak görüntüleyin ve analiz edin. NOT: Önerilen yazılım, hem görselleştirme hem de analiz için Imaris ve SyGlass'ı içerir. Imaris yazılımı kullanılarak astrositlerin optimize edilmiş rekonstrüksiyonu için hassas boru hattı daha önce9 olarak tanımlanmıştır. Kısacası, bu çalışmada kullanılan Imaris özellikleri, hücre yapılarını tamamen yeniden yapılandırmak için Filamentler ve tüm somataların uzayındaki pozisyonu çıkarmak için Lekelerdi.</li>
</ol>

<ol><li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+astrocytes+process+and+control+synaptic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li>
<li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li>
<li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema%2C+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573(2021).</li>
<li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li>
<li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li>
<li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+in+memory+function%3A+pioneering+findings+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li>
<li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li>
<li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).</li>
<li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li>
<li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915(2016).</li>
<li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li>
<li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuit-specialized+astrocytes%3A+transcriptomic%2C+proteomic%2C+morphological%2C+and+functional+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li>
<li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159(2005).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Doku temizleme yöntemleri, beyin araştırmalarında devrim niteliğinde bir araç sunarak, daha önce sorulamayan soruları davet ediyor. Küçük bir hücre grubunun, tek bir hücrenin veya hatta tek bir sinapsın özelliklerini hedeflemekten, CLARITY artık ilgili floroforları kullanarak toplam hücre popülasyonlarının veya uzun menzilli bağlantı özelliklerinin hedeflenmesini sağlar.
Florofor ekspresyonu ve CLARITY prosedür kombinasyonunun sonucu ikili değildir; birçok faktör prosedüre müdahale edebilir ve...

Son yıllarda, astrosit fonksiyonu ve nöronal devrelerle nasıl etkileşime girdikleri bilgisi çarpıcı bir şekilde artmıştır. Astrositler plastisiteyi etkileyebilir 1,2, nöronal yaralanma sonrası iyileşmeye yardımcı olabilir3,4 ve hatta astrositlerin hafıza edinimi ve ödülündeki önemini gösteren son çalışmalarla, daha önce tamamen nöronal fonksiyonlar olarak kabul edilen 5,6,7 . Astrosit araştırmalarında özellikle ilgi çekici bir özellik, hipokampus ve diğer beyin yapılarında benzersiz mekansal organizasyonları koruyan hücrelerin mekansal düzenlemesidir 8,9,10. Hücre somataları arasında iç içe geçen nöronal dendritlerin aksine, hipokampal astrositler, süreçleri arasında hafif örtüşme ile görsel olarak ayırt edilebilir bölgelerde yaşarlar ve farklı alanlar yaratırlar 8,11,12,13. Astrositlerin nöronal devrelere katılımını destekleyen kanıtlar, bu tür popülasyonların ve alanlarındaki nöronların ayrıntılı anatomik tanımının eksikliğini desteklememektedir14.
Viral vektör transdüksiyon prosedürleri, transgenik hayvanlarla (TG) birlikte, beyin yapılarını, fonksiyonlarını ve hücre etkileşimlerini araştırmak için bir araç seti olarak popülerleştirilmiştir15,16. Farklı promotörlerin kullanılması, spesifik hücrelerin genetik özelliklerine, aktivasyon seviyelerine17,18 veya projeksiyon hedeflerine göre hedeflenmesini sağlar. Farklı virüsler, farklı popülasyonlarda farklı renkli floroforları ifade edebilir. Bir virüs, TG'deki floroforların endojen ekspresyonu ile birleştirilebilir veya TG hayvanları virüslere ihtiyaç duymadan kullanılabilir. Bu teknikler nöronal işaretleme için yaygın olarak kullanılmaktadır ve bazı laboratuvarlar bunları astrositler 5,9,19 gibi diğer hücre tiplerini hedeflemek için uzmanlaşmış modifikasyonlarla kullanmaya başlamıştır.
İlk olarak 201320,21'de tanımlanan CLARITY tekniği, mikroskobik yapıları sağlam bırakırken tüm beyni şeffaf hale getirerek kalın beyin dilimlerinin incelenmesini sağlar. İki yöntemi birleştirerek - viral vektör transdüksiyonu ve doku temizliği - farklı hücre tipi popülasyonları arasındaki uzamsal etkileşimleri inceleme seçeneği artık mevcuttur. Çoğu astrosit-nöron etkileşimi çalışması ince beyin dilimleri üzerinde gerçekleştirildi, bu da büyük alanları nedeniyle tamamlanmamış astrositlerin görüntüleriyle sonuçlandı ve böylece analiz edilen hücrelerin sayısını radikal bir şekilde kısıtladı. CLARITY tekniğinin kullanılması, aynı anda büyük ölçekli hacimlerde hücre popülasyonlarının tek hücreli çözünürlük karakterizasyonuna izin verir. Berrak beyinlerde floresan olarak etiketlenmiş hücre popülasyonlarının görüntülenmesi sinaptik çözünürlük sağlamaz, ancak astrositler ve çeşitli nöronal hücre tipleri arasındaki uzamsal etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesine izin verir.
Bu nedenle, astrositlerin dorsal CA1 boyunca özelliklerini araştırmak ve tüm laminaları (Stratum Radyatum, piramidal tabaka ve Stratum Oriens) görüntülemek için bu son teknoloji teknikleri kullandık. On binlerce astrositi ölçtük (viral penetransı >% 965 ile), böylece CA1 çevresindeki tüm astrositik popülasyonun bilgilerini analiz ettik. Nöronal belirteçlerin etkili penetransı ile, CA1 astrositlerinin tüm popülasyonu ile dört tip nöronal hücre-parvalbümin (PV), somatostatin (SST), VIP inhibitör nöronlar ve uyarıcı piramidal hücreler arasındaki etkileşimleri kaydedebiliriz9.
TG hayvanlarından floresan ve farklı renkli viral vektörlerin (tüm inhibitör hücreler) bir kombinasyonu kullanılarak çeşitli deneyler yapılırken, diğerleri (uyarıcı) farklı promotörler altında farklı floroforları ifade eden iki viral vektör kullandı9. Bu makale, beyinde istenen hücrelerin etiketlenmesi, değiştirilmiş bir CLARITY prosedürü kullanılarak beynin şeffaf hale getirilmesinin yanı sıra çeşitli prosedürler ve yazılımlar kullanarak tüm beyin yapılarının görüntülenmesi ve analiz edilmesi de dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>AAV1-GFAP::TdTomato</td><td>ELSC Vektör Çekirdek Tesisi (EVCF)</td><td></td><td>astrositleri tespit etmek için kullanılan viral vektör</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::eGFP</td><td>ELSC Vektör Çekirdek Tesisi (EVCF)</td><td></td><td>nöronları tespit etmek için kullanılan viral vektör</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td><td>ELSC Vektör Çekirdek Tesisi (EVCF)</td><td></td><td>nöronal çekirdekleri tespit etmek için kullanılan viral vektör</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td><td>ELSC Vektör Çekirdek Tesisi (EVCF)</td><td></td><td>nöronları tespit etmek için kullanılan viral vektör</td></tr><tr><td>Akrilamid (%40)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Bisakrilamid (%2)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Sigma</td><td>#B7901</td><td>Molekül ağırlığı - 61,83 g/mol</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop, tarama, FV1000</td><td>Olympus</td><td></td><td>4x objektif (UPlanSApo, 0.16 NA)</td></tr><tr><td>Imaris yazılımı</td><td>Bitplane, UK</td><td></td><td>Görüntülerin 3D analizine izin veren bir yazılım</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>#S5881</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA %4EMS</td><td></td><td>#15710</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear</td><td>SunJin lab</td><td>#RC147002</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear CS</td><td>SunJin lab</td><td>#RCCS002</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>#L3771</td><td></td></tr><tr><td>SyGlass yazılımı</td><td></td><td></td><td>Sanal gerçeklik kullanarak görüntülerin 3D analizine izin veren bir yazılım</td></tr><tr><td>Tris tabanı 1 M</td><td>Bio-rad</td><td>#002009239100</td><td>Molekül ağırlığı - 121,14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ChemCruz</td><td>#sc-29112A</td><td></td></tr><tr><td>İki foton mikroskobu</td><td>Neurolabware</td><td></td><td>Ti: safir lazer (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP foto çarpan tüpleri (Hamamatsu, H10770-40), bant geçiren filtre (Semrock), suya daldırma 16x objektif (Nikon, 0.8 NA) &nbsp;</td></tr><tr><td>VA-044 Başlatıcı</td><td>Wako</td><td>#011-19365</td><td></td></tr></tbody></table>

temizlenmiş beyinlerde astrositler ve nöronlar arasındaki mekansal etkileşimin İncelenmesi

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

CLARITY yöntemini kullanarak viral vektör iletimini ve doku temizlemeyi birleştirmek, aynı anda birkaç beyin hücresi türünü ve etkileşimlerini araştırmayı mümkün kılar. Viral vektör iletimi, aynı doku içinde farklı floresan renklerinde farklı hücre tiplerinin işaretlenmesini sağlar. Hücreler genetik olarak aktivite veya projeksiyon ile tanımlanabilir. Modifiye edilmiş bir CLARITY protokolü kullanarak, astrositlerin ve nöronların potansiyel örneklem büyüklüğü 2-3 büyüklük sırasına göre büyümüştür. CLARITY kullanımı, dilimler halinde bütününe sığmayacak kadar büyük olan astrositlerin tamamının görüntülenmesini ve somatanın tüm işlemleriyle incelenmesini sağlar. Ek olarak, astrositler ve farklı nöronal hücre tipleri arasındaki mekansal etkileşimi, yani her astrositik alandaki piramidal nöronların sayısını veya astrositler ile spesifik inhibitör nöron popülasyonları arasındaki yakınlığı araştırma fırsatı sunar. Bu makale, bu yöntemlerin nasıl uygulanacağını ayrıntılı olarak açıklamaktadır.

Kalın beyin dokusu dilimlerinin başarılı bir şekilde temizlenmesi, tek hücrelerin veya komşu hücre gruplarının özelliklerinin aksine, büyük hücre popülasyonlarının özellikleri hakkında sorulabilecek yeni bir dizi soruyla sonuçlanır. Başarılı sonuçlar elde etmek için, numuneler arasındaki varyansı azaltmak için dikkate alınması gereken çok çeşitli parametreler olduğundan (örneğin, berraklık yüzdesi, floresan bilgisi, şişlik parametreleri) CLARITY protokolüne kesinlikle uyulmalıdır.
<strong clas...

CLARITY yöntemini kullanarak viral vektör iletimini ve beyin temizlemeyi birleştirmek, aynı anda çok sayıda nöron ve astrositin araştırılmasına izin verir.

Temizlenmiş Beyinlerde Astrositler ve Nöronlar Arasındaki Mekansal Etkileşimin İncelenmesi

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

İlk olarak 2013 yılında tanımlanan berraklık tekniği, daha büyük miktarlarda hücrenin, kan damarlarının, yani proteinlerin bile kalın beyin dilimlerinde tek bir hücre çözünürlüğü gibi örneklemelerini sağlayan bir doku temizleme tekniğidir. Bu teknik, tüm beyni şeffaf hale getirerek bozulmamış mikroskobik yapıların incelenmesini sağlar. Bu protokol, doku temizliği için basit bir çip ve basit bir boru hattıdır.Bu teknik, beyin dokularına ek olarak diğer sistemlerdeki dokuları temizlemek için kullanılabilir. Başlamak için, tüpü ve kapağı parafilm kullanarak kapatın ve kapaktaki iki deliği delin. Ardından, beş milimetre iç çapa sahip esnek bir boru ve ucuna bağlı 19 gauge iğne kullanarak azot gazını tanktan aktarın.Boruyu tüpe bağlayarak ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca gaz değişimine izin vererek gaz gidermeye başlayın. Boruyu ayırın ve delikleri hemen modelleme kili ile kapatın. Daha sonra, hidrojel çözeltisini polimerize etmek için gaz giderici tüpleri 3 1/2 saat boyunca 37 santigrat derece banyoya aktarın.Beyni tüpten çıkarın. Laboratuvar mendilleri kullanarak, beynin etrafındaki polimerize hidrojeli çıkarın ve beynin yüzeyine bağlı kalan hiçbir artık jel kalmamasını sağlayın. Beyni tüm ilgi alanlarını içeren kalın dilimlere bölün.Dilimleri ilk temizleme çözeltisine koyun ve 24 saat boyunca 70 RPM'de rotasyonla 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu arada, beyni yerleştirmek için delikli bir tüp hazırlayın. Delikli tüpü, karıştırma cihazında ikinci temizleme çözeltisi ile doldurulmuş bir beherin içine koyun.Daha sonra beyni beherin içine yerleştirin ve ağartmayı önlemek için alüminyum folyo ile kapatın. Doku şeffaf hale geldikten sonra, beyni 24 saat boyunca 70 RPM'de rotasyonla 37 santigrat derecede inkübe halinde PBST'ye aktarın. Çözeltiyi taze PBST ile değiştirin ve inkübasyona 24 saat daha devam edin.Daha sonra beyni 24 saat boyunca oda sıcaklığında PBS'ye aktarın. 24 saat sonra, beyni PBS'den çıkarın ve kırılma indisi eşleştirme çözeltisine aktarın. Beyni bir gecede 37 santigrat derecede inkübe edin.İlk olarak, örneği slaytın ortasına yerleştirin. Sıcak tutkal kullanarak, slaytın kenarlarında, neredeyse doku kadar yüksek duvarlar oluşturun. Köşelerden birinde küçük bir boşluk bıraktığınızdan emin olun.Sıcak tutkal tabakası beyin diliminin yüksekliğine yaklaştıkça, üst yüzeyi nemlendirmek ve kabarcık oluşumunu önlemek için numune üzerine bir ila iki damla kırılma indisi eşleştirme çözeltisi uygulayın. Sıcak tutkal hala sıvı iken, üst kısmı bir kapak kayması ile kapatın, mümkün olduğunca eşit bir şekilde yerleştirin ve ardından odayı kırılma indisi eşleştirme çözeltisi ile doldurun. Boşluğu sıcak tutkalla kapatın.Sıcak tutkal duvarları kızağın sınırlarının ötesine uzanıyorsa, uzatma kenarlarını kesin. Görüntüleme için bir yağ daldırma hedefi kullanılıyorsa, daldırma çözeltisini korumak için kapak kaymasının üzerindeki duvarlara iki ila üç milimetre daha yapıştırıcı ekleyin. Bu protokolden sonra beyin dokusu temizlenecektir.Fare hipokampusunun CA1 bölgesindeki astrosit ve nöron popülasyonlarını görselleştirmek için bu protokol kullanılarak berrak beyin dilimleri hazırlandı. Tüm astrositler tdTomato eksprese etti ve uyarıcı nöronlar çekirdeklerinde H2B-GFP eksprese etti. Berraklaştırılmış doku için hazırlanan oda, iki foton veya konfokal mikroskop altında görüntüleme için en uygunuydu.İki foton mikroskobu kullanılarak, fare hipokampusunun CA1 bölgesinin temizlenmiş bir bölümünde 300'den fazla astrosit gözlendi. Kırmızı ve piramidal hücrelerdeki hipokampal astrositler, yeşil renkli somata, bu iki hücre tipi arasındaki uzamsal yakınlığı temsil eden görünür ve kalın, şeffaf dokulardı. Taramalı bir lazer konfokal mikroskop kullanılarak, uyarıcı nöronlardan aksonal demetler tüm yarımküre boyunca izlendi.Yeşil demetler dorsal hipokampustan süper mamillary cisimlere doğru izlendi. Kırmızı demetler, mamillary cisimlerden havalandırma hipokampüsündeki kökenlerine doğru izlendi. Sıcaklık, konsantrasyonlar ve inkübasyon süresi gibi faktörler netlik prosedürünün sonucunu etkiledi.Bu nedenle, protokolün her adımındaki hassasiyet, berrak dokuya ulaşmanın başarısı için hayati öneme sahiptir. Bu tekniği kullanarak, çeşitli beyin yapılarındaki nöronlar ve astrositler arasındaki mesafeleri ölçüyoruz. Bu protokol, önceki çalışmalara göre iki ila üç büyüklük sırasına göre daha fazla hücrenin analizine izin verdi.

investigation-spatial-interaction-between-astrocytes-neurons-cleared

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu çalışma, bir roman nöronal akson ve (astro) glia ko-kültür platformu kurma prosedürleri açıklar. Bu ko-kültür sisteminde, bir tek akson (ve tek bir glial hücre) arasındaki doğrudan etkileşim manipülasyon glial sinyalleşme karşılıklı nöronların mekanik analiz izin veren, uygun olur.

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Bu video, bölümlere ayrılmış bir yaklaşım kullanarak dolaylı bir nöron-astrosit ko-kültürü oluşturmak için bir yöntemi göstermektedir. Bu kurulumda, nöronlar ve astrositler uzamsal olarak ayrılır, ancak şartlandırılmış bir ortamı paylaşırlar. Astrositler tarafından salınan nörotrofik faktörler, nöron farklılaşmasını ve sinaptik bağlantıların oluşumunu teşvik ederek nöron-glia etkileşimlerini düşündürür.

Nöron-glia etkileşimlerini incelemek için dolaylı bir nöron-astrosit ko-kültür tekniği

Kaynak: Refaeli, R., et al., Temizlenmiş Beyinlerde Astrositler ve Nöronlar Arasındaki Uzamsal Etkileşimin İncelenmesi. J. Vis. Uzm.  (2022) Video, hazırlanışını göstermektedir. floresan etiketli astrositler ve uyarıcı nöronlar arasındaki uzamsal etkileşimleri görselleştirmek için iki foton mikroskobu kullanılarak temizlenmiş fare hipokampal dokusunun bir odası ve nörogörüntülemesi.

Temizlenmiş Bir Fare Hipokampal Dokusunda Astrositlerin ve Uyarıcı Nöronların İki Foton Mikroskobu

CNS'deki astrositler, zararlı uyaranlara yanıt olarak fonksiyonel ve yapısal özelliklerini değiştirir. Bu rapor, hastalıklı durumlarda veya terapötik müdahaleler sonrasında üç boyutlu astrosit morfolojisinin değerlendirilmesi için bir protokol sunmaktadır.

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

Bu protokol nöron glia etkileşimlerinin bölümlere analizi için dolaylı nöron astrosit kokültürü açıklar.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Biz kendi kendine montajı, üç boyutlu demetleri boyuna hizalanmış astrositik somata ve süreçlerin bir roman biomaterial encasement içindeki gelişimi vitrin. Bunlar "yaşam iskele santimetre uzunluğunda, genişletme hizmet edebilir henüz test-yatak nörogelişimsel mekanizmaları incelemek veya yönetmenlik nöronal göç ve/veya aksonal neuroregeneration kolaylaştırmak için mikron çaplı çapı sergileyen", mühendislik kılavuz.

Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

Burada astrositik ağlar organizasyonu değerlendirmek için bir protokol mevcut. Açıklanan yöntemi hücre sayısı, boyutu, alan ve bir çekirdek içinde pozisyon gibi bu ağların açıklayıcı ölçüleri sağlamak için önyargı en aza indirir. Anizotropi vektörel bir analizi ile değerlendirilir.

Boyut, şekil ve yön ağlar yönetim eşleşmiş Astrocytes analiz

Açıklanan boru hattı, gigabaytlardan daha büyük elektron mikroskobu veri kümelerinin tüm hücre morfolojilerini ayıklamak için segmentasyonu için tasarlanmıştır. Hücreler 3B olarak yeniden oluşturulduktan sonra, bireysel ihtiyaçlar etrafında tasarlanmış özelleştirilmiş yazılım, görüntüleme tıkanıklığının üstesinden gelmek için sanal gerçekliği kullanarak doğrudan 3D olarak nitel ve nicel bir analiz yapmak için kullanılabilir.

Glial ve Nöronal Hücrelerin 3D Rekonstrüksiyonu ve Sanal Gerçeklik Analizi Için Bir Yöntem

Burada, organellerin hücre içi naklini ve murine astrositlerinde plazma membran proteinlerinin ticaretini görselleştirmek için in vitro canlı görüntüleme yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol aynı zamanda kargo taşımacılığı güzergahları ve kinetik belirlemek için bir görüntü analizi metodolojisi sunar.

Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

Bu protokol, fare beyninin serbest yüzen doku bölümlerini bölümleme, boyama ve görüntüleme yöntemlerini açıklar, ardından astrosit bölgesi hacminin ve astrosit bölgesi örtüşmesinin veya döşemesinin analizinin ayrıntılı bir açıklaması gelir.

Astrosit Bölgesi Hacminin Analizi ve Kalın Serbest Yüzen Doku Kesitlerinde Döşeme

Öğrenin fare hipokampusunda astrositler ve nöronlar arasındaki mekansal ilişkileri CLARITY yöntemiyle incelemeyi. Bu teknik, kalın beyin dokularında hücresel organizasyonu görselleştirmeyi sağlar.

Temizlenmiş Beyinlerde Astrositler ve Nöronlar Arasındaki Mekansal Etkileşimin İncelenmesi

Daha fazla video keşfet