Name: Olgun Hava Yolu Organoidleri Üretmek için İnsan Akciğer Organoidlerinin ve Proksimal Farklılaşmasının Kurulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Keşfedin insan akciğer organoidleri kültürü ve proksimal farklılaşma protokolü kullanarak olgun hava yolu organoidleri üretme yöntemini. Bu sistem solunum biyolojisi ve hastalık modelleri için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hong Kong Üniversitesi PanorOmik Bilimler ve Elektron Mikroskobu Birimi Merkezi, Li Ka Shing Tıp Fakültesi'ne konfokal görüntüleme ve akış sitometrisindeki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Gıda ve Sağlık Bürosu'nun Sağlık ve Tıbbi Araştırma Fonu'ndan (HMRF, 17161272 ve 19180392) gelen fonlarla desteklenmiştir; Araştırma Hibeleri Konseyi Genel Araştırma Fonu (GRF, 17105420); ve Health@InnoHK, İnovasyon ve Teknoloji Komisyonu, Hong Kong Özel İdari Bölgesi Hükümeti.

Burada açıklanan insan dokularını kullanan tüm deneyler, Hong Kong Üniversitesi / Hastane Otoritesi Hong Kong Batı Kümesi (UW13-364 ve UW21-695) Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Doku toplanmasından önce hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı.
1. İnsan akciğer organoidinin türetilmesi
<ol><li>Deney materyallerinin hazırlanması<ol>
<li>Gelişmiş DMEM / F12 ortamını 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile destekleyerek bazal ortam hazırlayın.</li>
		<li>Bazal besiyeri% 10 R-spondin 1 şartlı ortam,% 10 Noggin şartlı ortam,% 10 Noggin şartlı ortam, 1x B27 takviyesi, 1.25 mM N-asetilsistein, 10 mM nikotinamidin, 5 μM Y-27632, 500 nM A-83-01, 1 μM SB202190, 5 ng / mL fibroblst büyüme faktörü (FGF)-7, 20 ng / mL FGF-10 ve 100 μg / mL primosin ile takviye ederek insan akciğer organoid genişleme ortamı hazırlayın (bkz. NOT: R-spondin 1 ve Noggin şartlandırılmış ortam, ticari rekombinant R-spondin 1 (500 ng / mL) ve Noggin (100 ng / mL) ile değiştirilebilir.</li>
		<li>Bir hücre kültürü inkübatöründe 24 kuyucuklu bir süspansiyon kültür plakasını önceden ısıtın. % 5 CO2 ve 37 ° C'de nemlendirilmiş atmosfere sahip standart bir hücre kültürü inkübatörü kullanın. Bodrum matrisini 4 °C buzdolabında çözün. Deney sırasında bodrum matrisini ve kültür ortamını buz üzerinde tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>3D organoid kültür için insan akciğer dokularından hücre izolasyonu<ol>
<li>Çeşitli hastalıklar nedeniyle cerrahi rezeksiyon yapılan hastalardan yaklaşık 0,5 cm büyüklüğünde taze rezeke edilmiş insan akciğer dokuları temin edilir. Akciğer dokularını oda sıcaklığında 30 mL bazal ortamda taşıyın ve bir biyogüvenlik başlığı içinde mümkün olduğunca çabuk işleyin.</li>
		<li>Akciğer dokularını 10 cm'lik bir hücre kültürü kabında steril bir neşterle küçük parçalara (0.5-1 mm) doğrayın. Doku parçalarını 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde 10 mL soğuk bazal ortam ile yıkayın, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleme yapın.</li>
		<li>Süpernatantı atın ve peleti, 2 mg / mL'lik son konsantrasyonda kollajenaz ile desteklenmiş 8 mL bazal ortamda yeniden askıya alın. Tüpü 120 rpm'de 37 ° C'de 30-40 dakika çalkalayarak doku parçalarını sindirin.</li>
		<li>10 mL'lik serolojik pipet kullanarak sindirilen doku parçalarını kesmek için 20x yukarı ve aşağı pipetleyin. 100 μm'lik bir süzgeci 50 mL'lik bir santrifüj tüpü üzerine istifleyin ve süspansiyonu filtreleyin.</li>
		<li>Süzgeçteki doku parçalarını bazal ortamla geri kazanın ve bunları 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, ardından ikinci bir kesme ve filtreleme turu izleyin. Daha fazla hücreyi izole etmek için ek kesme filtreleme 1x-2x yapılabilir, özellikle küçük bir doku parçası (örneğin, <0,5 cm) tedarik edildiğinde.</li>
		<li>Sindirimi sonlandırmak için akışa %2'lik son konsantrasyonla FBS ekleyin, ardından 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleme yapın.</li>
		<li>Hücre peletini 10 mL bazal ortamda yeniden askıya alın, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleme yapın. Süper natantı atın.</li>
		<li>(İsteğe bağlı) Pelette birçok eritrosit, pelet görülürse (peletin rengine göre tahmin edilir), hücre peletini 2 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden askıya alın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra, tüpe 10 mL bazal ortam ekleyin, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleme yapın. Süper natantı atın.</li>
		<li>Pelet'i soğuk bodrum matrisinde yeniden askıya alın ve buz üzerinde tutun. Yaklaşık 0,5 cm büyüklüğünde bir akciğer dokusundan kurtarılan hücreler için 80-160 μL bodrum matrisi ekleyin; miktar 2-4 damlacık tohumlamak için yeterlidir.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış 24 delikli süspansiyon kültür plakasının her bir kuyucuğuna 40 μL süspansiyon dağıtın. Kültür plakasını 10-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bodrum matrisinin bir damlacık oluşturmak için katılaşmasına izin verin.</li>
		<li>Her bir kuyucuğa 5 nM Heregulin beta-1 ile desteklenmiş 500 μL insan akciğer organoidi genişleme ortamı ekleyin ve plakayı bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.</li>
		<li>Ortamı her 3 günde bir yenileyin. Damlacığı sağlam tutarken eski ortamı çıkarın ve dikkatli bir şekilde taze ortam ekleyin. Organoidleri inkübasyondan sonra 10-14 gün boyunca geçirin. Heregulin beta-1'i sadece ilk geçişten önceki ilk kültürde kullanın.</li>
		<li>Organoidlerin çok yüksek bir hücre yoğunluğu ile gömülmediğinden emin olmak için organoidleri mikroskop altında gözlemleyin. Bir damlacık aşırı yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle parçalanırsa, daha düşük ve arzu edilen bir hücre yoğunluğuna sahip daha fazla damlacık yapmak için organoidleri ve hücreleri daha yüksek hacimli bir bodrum matrisi ile geri kazanın ve yeniden gömün.</li>
	</ol></li>
</ol>2. İnsan akciğer organoidlerinin genişlemesi
<ol><li>Açıklığı 1,5 mm'den yaklaşık 1,0 mm çapa daraltmak için Pasteur pipetinin ucunu Bunsen brülör gibi bir alev üzerine yakarak bir Pasteur pipeti hazırlayın. Pipetleri soğutun, ardından sterilize etmek için otoklavlama yapın. Mekanik kesme sırasında hücre yapışmasını ve kaybını önlemek için pipetleri bazal ortamla ıslatın.</li>
	<li>Mekanik kesme ile akciğer organoidleri geçişi<ol>
<li>Yukarıda elde edilen damlacıkları kırmak için 1 mL'lik bir uç ve pipet yukarı ve aşağı kullanın. Daha sonra, organoidleri ortamla birlikte 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve soğuk bazal ortam ile hacmi 10 mL'ye ayarlayın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjlemeden sonra süpernatantı atın</li>
		<li>Organoidleri bir kez daha 10 mL soğuk bazal ortam ile yıkayın. Organoidleri 2 mL soğuk bazal ortamda yeniden askıya alın. Organoidleri bir Pasteur pipet ile küçük parçalara ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
		<li>Bazal orta ile toplam 10 mL hacme kadar takviye edin, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleme yapın. Organoid fragmanları, 1:3 ila 1:5 genişlemeyi sağlamak için yeterli soğuk bodrum matrisi ile yeniden askıya alın. Buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 40 μL organoid süspansiyon yerleştirin. Kültür plakasını 10-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bodrum matrisinin katılaşmasına izin verin.</li>
		<li>Her bir oyuğa 500 μL akciğer organoid genleşme ortamı ekleyin ve bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Ortamı her 3 günde bir yenileyin. Organoidleri her 2 haftada bir 1: 3 ila 1: 5 oranında geçirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akciğer organoidlerinin tripsinizasyon ile geçişi NOT: Tripsinizasyon, akciğer organoidini bir Pasteur pipet kullanarak küçük parçalara ayırmak zor olduğunda veya organoidlerin boyutu oldukça değişken olduğunda veya sonraki deneyler daha düzgün boyutta organoidler gerektirdiğinde tercih edilir.<ol>
<li>Akciğer organoidlerini adım 2.2.1'de gösterildiği gibi toplayın. Organoidi 1 mL ayrışma enziminde yeniden askıya alın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 3-5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Tüpe 1 mL bazal ortam ekleyin. Bir Pasteur pipet kullanarak organoidleri yukarı ve aşağı küçük parçalara ayırarak organoidleri mekanik olarak kesin. Organoid parçaların boyutunu mikroskop altında 4x büyütmede kontrol edin. Ardından, sindirimi sonlandırmak için 40 μL FBS ekleyin. NOT: Deneysel düzenlemeye göre mikroskop altında organoid fragmanlarının boyutunu belirleyin. Bir deney daha fazla organoide veya daha düzgün boyutta organoidlere ihtiyaç duyarsa, organoidleri daha küçük parçalara veya hatta tek hücrelere ayırın. Daha sonra, organoidlerin deneye hazır olması daha uzun bir zaman, muhtemelen 3 hafta sürer.</li>
		<li>Bazal orta ile 10 mL'lik son hacme kadar doldurun, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleme yapın. Organoid parçaları soğuk bodrum matrisinde 1:5-1:10 oranında geçiş için yeterli hacimle yeniden askıya alın. Buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 40 μL organoid süspansiyon yerleştirin. Kültür plakasını 10-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bodrum matrisinin katılaşmasına izin verin.</li>
		<li>Kuyu başına 500 μL akciğer organoid genleşme ortamı ile takviye edin ve bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Genişletme ortamını her 3 günde bir yenileyin. Organoidleri 2-3 hafta sonra geçirin. NOT: Yaklaşık 100 organoid, 40 μL'lik bir bodrum matrisi damlacığı içine monte edilmiştir. Akciğer organoidleri normalde nispeten yüksek hücre yoğunluğu ile daha iyi büyür. Damlacıklar parçalanırsa veya aşırı yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle büyüyen organoidler birbirine bağlanırsa, organoidleri daha düşük hücre yoğunluğu ile yeniden gömün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Olgun hava yolu organoidleri üretmek için proksimal farklılaşma
<ol><li>Hava sıvı arayüzü bazal ortamını 1x hava sıvı arayüz takviyesi, 1x hava sıvı arayüzü bakım takviyesi, 4 μg / mL heparin, 1 μM hidrokortizon, 10 μM Y-27632 ve 10 μM DAPT ile destekleyerek proksimal farklılaşma ortamı (PD ortamı) hazırlayın (bkz.</li>
	<li>3D hava yolu organoidleri<ol>
<li>Akciğer organoidlerini mekanik kesme yoluyla geçtikten sonra 7-10 gün boyunca genleşme ortamında inkübe edin. Genleşme ortamını PD ortamıyla değiştirin. Organoidleri PD ortamında bir hücre kültürü inkübatöründe 14 gün boyunca inkübe edin.</li>
		<li>PD ortamını her bir kuyucukta atın. RNA ekstraksiyonu ve RT-qPCR testi ile hücresel gen ekspresyonunun tespiti için farklılaşmış hava yolu organoidini toplamak için hücre lizat tamponu ekleyin.</li>
		<li>Alternatif olarak, organoidleri tek hücrelere ayırmak için 10 mM EDTA ilavesinden sonra organoidleri 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin, ardından hücre popülasyonlarını incelemek için akış sitometri analizi yapın. Organoidler çeşitli deneysel manipülasyonlar için hazırdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2D hava yolu organoidi<ol>
<li>2D farklılaşma kültürü için yeterli 3D akciğer organoidleri hazırlayın. 24 delikli geçirgen destek kesici ucu ve 12 delikli geçirgen destek kesici ucu için sırasıyla toplam 1,3 x 105 ve 4,5 x 105 hücre gerekir.</li>
		<li>3D akciğer organoidleri 2 hafta boyunca genişleme ortamında büyüdükten sonra, organoidleri tek hücrelere sindirir ve 2D hava yolu organoidleri üretmek için 24 kuyucuklu ve 12 delikli eklere tohum atar.</li>
		<li>Ekleri bir hücre kültürü inkübatöründe gece boyunca bazal ortamla önceden inkübe edin. 24 delikli bir plakanın üst ve alt odasına sırasıyla 250 μL ve 500 μL bazal ortam ekleyin. 12 delikli bir plaka için, üst ve alt odaya sırasıyla 500 μL ve 1.000 μL bazal ortam ekleyin.</li>
		<li>Adım 2.2.1'de açıklandığı gibi 3D akciğer organoidlerini hasat edin. Organoidleri 1 mL ayrışma enzimi ile yeniden askıya alın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 3-5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Tüpe 1 mL bazal ortam ekleyin. Pipet, organoidleri bir Pasteur pipet ile tek hücrelere ayırmak ve hücreleri mikroskop altında kontrol etmek için yukarı ve aşağı doğru pişirin. Ardından, sindirimi sonlandırmak için 40 μL FBS ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri 40 μm'lik bir süzgeçten 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne filtreleyin. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Bazal orta ile toplam 10 mL hacme kadar doldurun, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleme yapın.</li>
		<li>24 damlacıktan (40 μL) toplanan peleti, damlacıklardaki hücre yoğunluğuna bağlı olarak 1-2.5 mL akciğer organoid genleşme ortamında yeniden askıya alın. Mikroskop altında bir hücre sayacı olan hücrelerin sayısını sayın. Hücre konsantrasyonunu 1,3 x 106/mL (24 delikli kesici uçlar için) veya 9 x 105/mL (12 delikli kesici uçlar için) olarak ayarlayın.</li>
		<li>Bazal ortamı üst ve alt odalardan çıkarın. 24 delikli kesici ucun ve 12 delikli kesici ucun alt haznesine sırasıyla 500 μL ve 1.000 μL genleşme ortamı ekleyin. 3.3.7 adımında hazırlanan tohum 100 μL ve 500 μL hücre süspansiyonu, sırasıyla 24 delikli kesici uç ve 12 delikli kesici ucun apikal odasına yerleştirilir.</li>
		<li>2 gün boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Genleşme ortamını, plakaların hem apikal hem de alt haznesindeki PD ortamı ile değiştirin. Organoidleri hücre kültürü inkübatöründe 14 gün boyunca inkübe edin ve PD ortamını her 3 günde bir yenileyin. NOT: Mobil kirpikler, PD ortamında inkübasyondan sonraki 7. günden itibaren mikroskop altında 3D ve 2D organoidlerde ayırt edilebilir. PD ortamında 14 günlük farklılaşma kültüründen sonra, hava yolu organoidleri çeşitli deneysel manipülasyonlar için olgunlaşır.</li>
		<li>Trans-epitelyal elektrik direncini (TEER) her gün bir elektriksel direnç ölçüm sistemi kullanarakölçün, 17'de açıklanan standart bir protokole göre.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3D+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li>
<li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li>
<li>Wroblewski, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+targets+cancer-associated+apical-junctional+constituents+in+gastroids+and+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells.</a> Gut. 64 (5), 720-730 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+human+airway+organoids+to+assess+infectivity+of+emerging+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Lancaster, M. A., Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modelling+in+human+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Disease modelling in human organoids.</a> Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).</li>
<li>Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F">https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</a> (2021).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, 05098(2015).</li>
<li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+grow+a+lung%3A+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pathobiology+Reports%22%5BJournal%5D)">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).</li>
<li>Glinka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LGR4+and+LGR5+are+R-spondin+receptors+mediating+Wnt%2Fbeta-catenin+and+Wnt%2FPCP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling.</a> EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).</li>
<li>Groppe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+BMP+signalling+inhibition+by+the+cystine+knot+protein+Noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin.</a> Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).</li>
<li>Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+and+cellular+dynamics+during+regeneration+of+airway+epithelium+from+basal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors.</a> Development. 143 (5), 764-773 (2016).</li>
<li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li>
<li>Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR2+is+required+for+airway+basal+cell+self-renewal+and+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation.</a> Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).</li>
<li>Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+immunological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organoids in immunological research.</a> Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+applications+of+adult+stem+cell-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Translational applications of adult stem cell-derived organoids.</a> Development. 144 (6), 968-975 (2017).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li>
<li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+SARS-CoV-2+inhibitors+using+lung+and+colonic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.</a> Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).</li>
<li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508(2021).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li>
<li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li>
<li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li>
</ol>

J. Z., C.L. ve M.C.C., hava yolu organoidlerinin patentinde mucit olarak listelenmiştir (yayın No: US-2021-0207081-A1). Diğer yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

İnsan hava yolları, psödostratifiye siliyer epitel olarak da bilinen hava yolu epiteli ile kaplıdır. Üst solunum yolu epitelinin ana hücre tipleri, apikal kirpiklerinin mukus ve solunan parçacıkları hava yollarından dışarı atmak için koordineli hareketini sağlayan siliye hücreler, mukus üreten ve salgılayan kadeh hücreleri ve bazal membranı kaplayan ve rejenerasyonda rol oynayan bazal hücrelerdir. Bronşiyoller gibi küçük hava yolunda, küboidal hava yolu epiteli, salgı kulübü hücreleri ve üst solunum yolu bölgelerine göre...

Organoidler, organ gelişiminin in vitro modellenmesi ve biyoloji ve hastalıkların incelenmesi için sağlam ve evrensel bir araç haline gelmiştir. Büyüme faktörü tanımlı bir kültür ortamında kültürlendiğinde, çeşitli organlardan gelen yetişkin kök hücreler (ASC) 3 boyutlu (3B) olarak genişletilebilir ve organoidler olarak adlandırılan çoklu hücre tiplerinden oluşan organ benzeri hücresel kümelere kendiliğinden monte edilebilir. Clevers'in laboratuvarı, 2009 yılında ilk ASC türevi organoid, insan bağırsak organoidinin türetildiğini bildirdi 1,2. Daha sonra, prostat 3,4, karaciğer 5,6, mide 7,8,9, pankreas 10, meme bezi 11 ve akciğer 12,13 dahil olmak üzere çeşitli insan organları ve dokuları için ASC türevi organoidler kurulmuştur. . Bu ASC türevi organoidler, doğal organın kritik hücresel, yapısal ve fonksiyonel özelliklerini korumuş ve uzun süreli genişleme kültüründe genetik ve fenotipik stabiliteyi korumuştur14,15.
Organoidler ayrıca embriyonik kök (ES) hücreler ve indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücre16 dahil olmak üzere pluripotent kök hücreden (PSC) türetilebilir. PSC türevi organoidler, kuruluşları için organ gelişim mekanizmalarından yararlanırken, ASC'ler, fizyolojik doku kendini yenileme veya doku onarımı sırasında kök hücre nişini taklit eden koşulları yeniden inşa ederek organoidler oluşturmaya zorlanabilir. PSC türevi organoidler, ASC türevi organoidlerin karşılaştırılabilir olgunlaşma seviyesine ulaşamasalar da, gelişim ve organogenezi araştırmak için elverişli modellerdir. PSC türevi organoidlerin fetal benzeri olgunlaşma durumu ve bu organoidlerin kurulmasının karmaşıklığı, olgun dokularda biyoloji ve patolojiyi incelemek için geniş uygulamalarını büyük ölçüde engellemektedir.
Burundan terminal bronşiyolele kadar insan solunum yolu, dört ana hücre tipinden, yani siliye hücre, kadeh hücresi, bazal hücre ve kulüp hücresinden oluşan psödostratifiye siliyer epitel olarak da adlandırılan hava yolu epiteli ile kaplıdır. ASC türevi insan akciğer organoidini, Clevers'in laboratuvarı12,13 ile işbirliği içinde insan akciğer dokularından kurduk. Bu akciğer organoidleri, bir yıldan fazla bir süredir genişleme ortamında ardışık olarak genişletilir; kesin süre, farklı donörlerden elde edilen farklı organoid çizgiler arasında değişir. Bununla birlikte, doğal hava yolu epiteli ile karşılaştırıldığında, bu uzun süreli genişleyen akciğer organoidleri, insan hava yolundaki ana hücre popülasyonu olan siliyer hücreler bu akciğer organoidlerinde yeterince temsil edilmediğinden, yeterince olgun değildir. Bu nedenle, proksimal bir farklılaşma protokolü geliştirdik ve hava yolu epitelini morfolojik ve fonksiyonel olarak fizyolojik bir seviyeye yakın bir seviyeye kopyalayan 3D ve 2D hava yolu organoidleri ürettik.
Burada, birincil akciğer dokularından insan akciğer organoidlerini türetmek, akciğer organoidlerini genişletmek ve 3D ve 2D hava yolu organoidleri üretmek için proksimal farklılaşmayı indüklemek için bir video protokolü sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>< Akciğer organoid kültürü için güçlü > reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gelişmiş DMEM / F12</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>12634010-A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500nM</td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>Cultrex Azaltılmış Büyüme Faktörü Bodrum Membran Matrisi, Tip 2 (BME 2)</td><td>Trevigen</td><td>3533-010-0</td><td>%70-80</td></tr> <tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>GlutaMAX (glutamin)</td><td>İnvitrojen</td><td></td><td>35050061 1x</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>İnvitrojen</td><td>15630-056</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Heregulin &beta;-1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td>5 nM</td></tr><tr><td>N-Asetilsistein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin (koşullu orta)</td> <td>ev</td><td></td> <td>yapımı-10x</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL)</td> <td>İnvitrojen</td><td>15140-122</td><td>1x</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 ve mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Rspondin1 (koşullu orta)</td><td>ev</td><td></td> <td>yapımı-10x</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067</td><td>1 & mikro; M</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>5 & M</td></tr><tr><td><güçlü>Proksimal farklılaşma ortamı</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Tocris</td><td>2634</td><td>10 & mikro; M</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Solüsyonu Kök Hücre Teknolojisi</td><td>7980</td><td>4 & g/mL</td></tr><tr><td>Hidrokortizon Stok Çözeltisi</td><td>Kök Hücre Teknolojisi</td><td>7925</td><td>1 & M</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 10X Takviyesi</td><td></td><td></td><td>hava sıvı arayüz takviyesi</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI Bazal Orta Kök</td><td>Hücre Teknolojisi</td><td>05001</td><td>hava sıvı arayüzü bazal ortam</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI Bakım Takviyesi</td><td></td><td></td><td>hava sıvı arayüzü bakım takviyesi</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>10 &mikro; M</td></tr><tr><td>Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyolojik güvenlik kabini</td><td>Baker</td><td>1-800-992-2537</td><td></td></tr><tr><td>Carl Zeiss LSM 780 veya 800</td><td>Zeiss</td><td></td><td>konfokal mikroskop</td></tr><tr><td>CO2 İnkübatörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>42093483</td><td></td></tr><tr><td>Stereo-mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31SF</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5418BG040397</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetleyici</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN siyah veya ZEN mavi yazılım</td><td>Zeiss</td><td></td><td>analiz yazılımı</td></tr><tr><td><güçlü>Sarf malzemeleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12mm Trans-kuyu</td><td>Kök Hücre Teknolojisi</td><td># 38023</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu hücre kültürü plakası</td><td>Cellstar</td><td>665970</td><td></td></tr><tr><td>15 ve 50 ml konik tüpler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L6BF5Z8118</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu hücre kültürü plakası</td><td>Cellstar</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>6.5mm Trans-kuyu</td><td>Kök Hücre Teknolojisi</td> <td># 38024</td><td></td></tr><tr><td>Tıbbi Şırınga Filtre Ünitesi, 0.22 &; mikro; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofüj tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet uçları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TFLR140-200-Q21190531</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet camı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-378893</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler (5ml, 10ml, 25ml)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BA08003, 08004, 08005</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Keçi Anti-Fare Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Tavşan Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Tavşan Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Sıçan Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td></td></tr><tr><td>Fare Anti-Sitokeratin 5</td><td>Abcam</td><td>ab128190</td><td></td></tr><tr><td>Fare Anti-FOX J1</td><td>Invitrogen</td><td>14-9965-82</td><td></td></tr><tr><td>Fare Anti-Müsin 5AC</td><td>Abcam</td><td>ab3649</td><td></td></tr><tr><td>Fare Anti-&beta;-tubulin 4</td><td>Sigma</td><td>T7941</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan Anti-p63</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan Anti-Uteroglobin / CC-10</td><td>R& D Sistemleri</td><td>MAB4218-SP</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Diğer reaktif</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TripLE Enzimi Seçin (10X)</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>A1217701</td><td>ayrışma enzimi</td></tr></tbody></table>

olgun hava yolu organoidleri Üretmek için İnsan akciğer organoidlerinin ve proksimal farklılaşmasının kurulması

Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

İnsan solunum epitelinin sağlam bir in vitro modelinin olmaması, solunum sisteminin biyolojisinin ve patolojisinin anlaşılmasını engellemektedir. İnsan akciğer organoidlerini akciğer dokusundaki yetişkin kök hücrelerden türetmek ve olgun hava yolu organoidleri oluşturmak için proksimal farklılaşmayı indüklemek için tanımlanmış bir protokol tanımladık. Akciğer organoidleri daha sonra yüksek stabilite ile 1 yıldan fazla bir süre boyunca ardışık olarak genişletilirken, farklılaşmış hava yolu organoidleri morfolojik ve fonksiyonel olarak insan hava yolu epitelini fizyolojik bir seviyeye yakın bir seviyeye kadar simüle etmek için kullanılır. Böylece, insan hava yolu epitelinin sağlam bir organoid modelini oluşturuyoruz. Akciğer organoidlerinin ve farklılaşmış hava yolu organoidlerinin uzun süreli genişlemesi, bilim adamlarının kültür yemeklerinde insan hava yolu epitel hücrelerini yeniden yapılandırmalarını ve genişletmelerini sağlayan istikrarlı ve yenilenebilir bir kaynak oluşturur. İnsan akciğer organoid sistemi, virüs-konakçı etkileşimi, ilaç testi ve hastalık modellemesinin incelenmesi de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için benzersiz ve fizyolojik olarak aktif bir in vitro model sağlar.

Bu protokol, insan akciğer organoidlerinin yüksek başarı oranıyla türetilmesini sağlar. Taze insan akciğer dokusu küçük parçalara ayrılır ve daha sonra kollajenaz ile ayrıştırılır. Elde edilen tek hücreler bodrum matriksine gömülür ve epitel kök hücrelerinin büyümesi için niş faktörlerin bir kokteyli ile desteklenen akciğer organoid genişleme ortamında inkübe edilir (adım 1.1.2). Şekil 1 , indirgenmiş büyüme faktörü bazal membran matrisi Tip 2'ye gömülü yeni izole edilmiş akciğer hücrelerini...

Protokol, insan akciğer organoidlerini birincil akciğer dokularından türetmek, akciğer organoidlerini genişletmek ve insan hava yolu epitelini sadık bir şekilde fenotoskopik eden 3D ve 2D hava yolu organoidleri üretmek için proksimal farklılaşmayı indüklemek için bir yöntem sunar.

Olgun Hava Yolu Organoidleri Üretmek için İnsan Akciğer Organoidlerinin ve Proksimal Farklılaşmasının Kurulması

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...

Kültür plakalarında insan hava yolu epitelinin organoid kültürünü oluşturmak için bir yöntem sunuyoruz. İnsan akciğer organoidini doğrudan primer akciğer dokularından yüksek verimlilikle elde ediyoruz. Türetilmiş insan akciğer organoidi bir yıldan fazla bir süre boyunca istikrarlı bir şekilde genişletilir ve bir proksimal farklılaşma protokolü, insan hava yolu epitelini yakın bir fizyolojik seviyeye sadık bir şekilde simüle edebilen olgun hava yolu organoidlerinin üretilmesine izin verir.Bu nedenle, kültür sistemi, bilim adamlarının kültür plakalarındaki insan hava yolu epitelini yeniden yapılandırmalarına ve genişletmelerine izin verir. Prosedürü gösteren Man Chun Chiu ve Yifei Yu, laboratuarımızdaki doktora öğrencileri 3D organoid kültür için insan akciğer dokularından hücre izolasyonuna başlamak için, akciğer dokularını steril bir neşterle bir milimetre küçük parçalara ayırın ve doku parçalarını 10 mililitre soğuk bazal ortam ile yıkayın. Dokuları dört santigrat derecede beş dakika boyunca 400 kez G'de santrifüj edin ve peleti, mililitre başına iki miligramlık son bir konsantrasyonda kollajenaz ile desteklenmiş sekiz mililitre bazal ortamda yeniden askıya almadan önce süpernatantı atın.Daha sonra, tüpü 120 RPM'de 37 santigrat derecede 30 ila 40 dakika çalkalayarak doku parçalarını sindirin. Sindirimden sonra, sindirilen doku parçalarını kesmek için 10 mililitrelik serolojik pipet kullanarak 20 kez yukarı ve aşağı pipet uygulayın. Ardından, süspansiyonu 100 mikronluk bir süzgeçle 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin.Doku parçalarını süzgeçten geri kazanın ve bazal ortama sahip 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Sindirimi sonlandırmak için, akışa% 2'lik bir son konsantrasyona fetal sığır serumu ekleyinDaha sonra, tüpü santrifüj edin ve hücre peletini daha önce tarif edildiği gibi bazal ortamın 10 mililitresinde yeniden askıya alın. Santrifüjlemeden sonra, peleti 80 ila 160 mikrolitre soğuk bodrum matrisi ortamında yeniden askıya alın ve tüpleri buz üzerine yerleştirin.Daha sonra, önceden ısıtılmış 24 delikli bir süspansiyon kültürü plakasının her bir kuyucuğuna 40 mikrolitre süspansiyon dağıtın. Plakayı 10 ila 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bodrum matrisinin katılaşmasına ve bir damlacık oluşturmasına izin verin.Kuluçkadan sonra, her bir kuyucuğa beş nanomolar heregulin-beta 1 ile desteklenmiş 500 mikrolitre insan akciğer organoidi genişleme ortamı ekleyin ve plakayı bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Üç gün sonra, damlacığı sağlam tutarken eski ortamı çıkarın ve dikkatlice taze ortam ekleyin. 10 ila 14 günlük geçişten sonra, organoidleri mikroskop altında gözlemleyin ve organoidlerin çok yüksek bir hücre yoğunluğu ile gömülmediğinden emin olun.Akciğer organoidlerini kesme ile geçirmek için, damlacıkları bir mililitrelik bir uçla yukarı ve aşağı pipetleyerek, kırın. Daha sonra, organoidleri ortamla birlikte 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve soğuk bir bazal ortamla hacmi 10 mililitreye ayarlayın. Tüpü dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın, süpernatanı atın ve organoidleri 10 mililitre soğuk bazal ortam ile yıkayın.Daha sonra, organoidleri iki mililitre soğuk bazal ortamda yeniden askıya alın ve bir Pasteur pipet ile küçük parçalara ayırın. Daha sonra, organoid parçalarını 1: 3 ila 1: 5 genleşme sağlamak için yeterli soğuk bir bodrum matrisi ile yeniden askıya almadan önce toplam 10 mililitrelik bir hacme bazal ortam ekleyin ve tüpleri buz üzerine yerleştirin. Bodrum matrisinin 10 ila 15 dakika boyunca katılaşmasını sağlamak için 37 santigrat derecede inkübe etmek için önceden ısıtılmış 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 40 mikrolitre organoid süspansiyon dağıtın.Daha sonra, her bir oyuğa 500 mikrolitre akciğer organoid genleşme ortamı ekleyin ve bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Ortamı her üç günde bir yenileyin ve organoidleri her iki haftada bir geçirin. Akciğer organoidlerini tripsinizasyonla geçirmek için, hasat edilen akciğer organoidlerini bir mililitre ayrışma enziminde yeniden askıya alın.Organoidi 37 santigrat derecelik bir su banyosunda üç ila beş dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, tüpe bir mililitre bazal ortam ekleyin ve organoidleri yukarı ve aşağı pipetleyerek, mekanik olarak kesin. 40 mikrolitre fetal sığır serumu ile sindirimi sonlandırmadan önce mikroskop altında organoid parçaların boyutunu 100X büyütmede kontrol edin.Organoid parçaları soğuk bir bodrum matrisinde 1:5 ila 1:10 oranında geçmek için yeterli hacme sahip yeniden askıya almadan önce bazal ortam ve santrifüj ile hacmi 10 mililitreye kadar yapın. Daha sonra, 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 40 mikrolitre organoid süspansiyon dağıtın ve plakayı daha önce gösterildiği gibi kültürleyin. 3D hava yolu organoidleri üretmek için, akciğer organoidlerini mekanik kesme yoluyla geçtikten sonra yedi ila 10 gün boyunca genleşme ortamında inkübe edin.Daha sonra, genişleme ortamını proksimal farklılaşma ortamı ile değiştirin ve organoidleri bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. 14 gün sonra, ortamı her bir kuyucukta atın ve RNA ekstraksiyonu ve RT-qPCR testi ile hücresel gen ekspresyonunun tespiti için farklılaşmış hava yolu organoidini toplamak için hücre lizat tamponu ekleyin. Hücre kültürü inkübatöründeki ekleri, sırasıyla 24 delikli bir plakanın üst ve alt haznesinde 250 ve 500 mikrolitre bazal ortam ile önceden inkübe edin.Daha sonra, organoidleri tek hücrelere kesmek için tüpe bir mililitre bazal ortam ve pipet yukarı ve aşağı ekleyin. 40 mikrolitre fetal sığır serumu ile sindirimi sonlandırmadan önce hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Hücreleri 40 mikronluk bir süzgeçten 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin ve filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.Süspansiyonu bazal orta ile toplam 10 mililitre hacme doldurun. Santrifüjlemeden sonra, hücre yoğunluğuna bağlı olarak, 1 ila 2,5 mililitre akciğer organoid genleşme ortamında 24 damlacıktan toplanan peleti yeniden askıya alın. Mikroskop altında hücre sayacı olan hücre sayısını sayın, ardından 24 kuyucuklu ekler için hücre konsantrasyonunu mililitre başına 1.3 çarpı 10'a altı katına ayarlayın.Alt hazneye 500 mikrolitre genleşme ortamı eklemeden önce bazal ortamı üst ve alt odalardan çıkarın. Tohum 100 mikrolitre hücre süspansiyonu, 24 kuyucuklu ekin apikal odasına daha önce hazırlanır ve inkübe edilir. İki gün sonra, genleşme ortamını plakanın hem apikal hem de alt odasında proksimal farklılaşma ortamı ile değiştirin.Organoidleri 14 gün boyunca inkübe edin ve ortamı her üç günde bir yenileyin. Transepitelyal elektrik direncini her gün bir elektriksel direnç ölçüm sistemi kullanarak ölçün. Temsili mikrofotoda, yeni izole edilmiş akciğer hücreleri, indirgenmiş büyüme faktörü bazal membran matrisi tip ikide gömülü olarak görülebilir.Kistik organoidler zamanla ortaya çıkmış ve büyümüştür. Dördüncü pasajdan sonraki akciğer organoidleri burada gösterilmiştir. Mekanik kesmeden sonraki iki saat içinde, bazal membran ekstraktına gömülü organoid fragmanlar kistik alanları oluşturdu.Aynı alanın beşinci gündeki mikrofotografı, zamanla organoid büyümesini doğruladı. Genişleyen organoidler, ACCTUB-pozitif veya FOXJ1-pozitif siliye hücre, P63-pozitif bazal hücre, CC10-pozitif kulüp hücresi ve MUC5AC-pozitif kadeh hücresi dahil olmak üzere dört ana hava yolu epitel hücre tipinin tümünü erken bir durumda barındırıyordu. Genleşme ve proksimal farklılaşma ortamında inkübe edilen organoidler zamanla farklı morfoloji geliştirmiştir.Proksimal farklılaşma ortamında iki haftalık farklılaşmadan sonra, her organoidde hareketli kirpikler fark edilebildi. Senkron olarak dövülen celia'nın hücre kalıntılarını organoid lümenin içine sürdüğü ve solunan parçacıkları çıkarmak için tek yönlü olarak döndürdüğü gözlendi. Ayrıca, akım sitometrisi analizi, farklılaşmış organoidlerin proksimal diferansiyasyon ve genişleme ortamında dört hava yolu epitel hücre tipini barındırdığını göstermiştir.İki haftalık farklılaşmadan sonra, 2D hava yolu organoidleri sağlam bir epitel bariyeri geliştirdi. 2D hava yolu organoidlerinde oluşan epitel bariyerinin bütünlüğünü değerlendirmek için bir dekstran blokaj testi yapıldı. 2D organoidler bol miktarda siliyer hücre içeriyordu.Uzun süreli genişletilebilir akciğer organoidi ve farklılaşmış hava yolu organoidi, COVID-19 dahil olmak üzere solunum biyolojisi ve patolojisini incelemek için fizyolojik olarak aktif ve evrensel bir model sistemi sağlar.

establishing-human-lung-organoids-proximal-differentiation-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol verimli hava yolu epitel hücreleri olgun fare embriyonik kök hücre kaynaklı kesin endoderm yönlendirir. Bu farklılaşma tekniği tanımlanmış bir serum içermeyen kültür ortamında, akciğer soy özellikleri doğrudan 3 boyutlu hücresizleştirilmiş akciğer iskeleleri kullanır.

Decellularized Akciğer Yapı iskeleleri kullanarak ESC türetilmiş Fare Havayolu Epitel Hücreleri Üretimi

Bu makalede, insan akciğerinin proksimal ve distal bölgelerinden canlı epitel hücrelerinin zenginleştirilmesine izin veren doku dissosiyasyonu ve hücresel fraksiyonasyon yaklaşımları için ayrıntılı bir metodoloji sunulmaktadır. Bu yaklaşımlar, akciğer epitel progenitör hücrelerinin fonksiyonel analizi için 3D organoid kültür modelleri kullanılarak uygulanmaktadır.

Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Xenopus laevis embriyolarından izole edilmiş derin ektoderm hücrelerinden mukozisel epitel organoidleri geliştirmek için basit bir protokol uyguluyoruz. Çok güçlü atalar epitel goblet hücre öncüllerini yeniler ler ve organoidlerin yüzeyinde hücre geçişlerinin başlatılmasıve ilerlemesinicanlı olarak izlemesağlarlar.

Kenopus Embriyonik Hücrelerden Mukosiyaliyer Epitel Organoidler: Nesil, Kültür ve Yüksek Çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Makalede, indüklenen pluripotent kök hücrelerin mezenkim ile birlikte hem proksimal hem de distal epitel akciğer hücrelerini içeren üç boyutlu tüm akciğer organoidlerine yönlendirilmiş adım bilgeliği açıklanmaktadır.

Akciğer Gelişim Biyolojisi ve Hastalığının Modellenerek İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden 3D Bütün Akciğer Organoidlerinin Üretimi

Protokol, endojen epitelin sıçan trakeasından seçici olarak çıkarılmasına ve lümen yüzeyindeki eksojen hücrelerin homojen dağılımına izin veren, ardından hücre dokusu yapısının uzun süreli in vitro kültürüne izin veren görüntüleme özellikli bir biyoreaktörü tanımlar.

Biyomühendislik hava yolu dokusu üretmek için görüntüleme kılavuzlu biyoreaktör

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre farklılaşma protokollerindeki son gelişmeler, organa özgü hücre tiplerinin kademeli olarak türetilmesine izin vermektedir. Burada, iPSC türevi hava yolu bazal hücrelerinin bakımı ve genişlemesi ve hava-sıvı arayüz kültürlerinde mukosiliyer bir epitel halinde farklılaşması için ayrıntılı adımlar sunuyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Hava Yolu Epitel Hücresi Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

Bu makale, bir hava-sıvı arayüz kültüründe indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi akciğer epiteli, mezenşim, endotel hücreleri ve makrofajlardan oluşan karmaşık, çok hücreli bir hava yolu bariyer modelinin oluşturulmasını açıklamaktadır.

Akciğer Sağlığı ve Hastalığında Hava Yolu Bariyeri Bütünlüğünü Modellemek için iPSC'den Türetilmiş Epitelyal, Mezenkimal ve İmmün Hücre Ko-Kültürü

Bu video protokolünde, primer intestinal epitel organoidlerinde lentiviral transdüksiyonun ve bu kültürlerin kantitatif RT-PCR, RNA-mikroarray ve immünohistokimya ile işlenmesi ve aşağı akış analizinin adım adım açıklamasını veriyoruz.

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Membran olgun adiposit agrega kültürü (MAAC) kültür olgun insan adipositler için yeni bir yöntemdir. Burada insan yağlarından adipositleri nasıl izole edebileceğimizi ve MAAC'ı nasıl kurabileceğimizi ayrıntılarıyla anlatıyoruz.

Membran Olgun Adiposit Agrega Kültürleri (MAAC) Kullanarak İnsan Olgun Adipositlerin İzolasyon ve Kültürü

Organoidlerin tüm 3Boyutlu yapısı ve hücresel içeriği nin yanı sıra orijinal dokuya olan henotipik benzerlikleri burada açıklanan tek hücreli çözünürlükte 3D görüntüleme protokolü kullanılarak yakalanabilir. Bu protokol, kökeni, büyüklüğü ve şekli değişen çok çeşitli organoidlere uygulanabilir.

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Keşfedin insan akciğer organoidleri kültürü ve proksimal farklılaşma protokolü kullanarak olgun hava yolu organoidleri üretme yöntemini. Bu sistem solunum biyolojisi ve hastalık modelleri için değerli bir araç sunar.

Olgun Hava Yolu Organoidleri Üretmek için İnsan Akciğer Organoidlerinin ve Proksimal Farklılaşmasının Kurulması

Daha fazla video keşfet