Name: Farelerde Salmonella Typhimurium ile İndüklenen Septik Peritonitin Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Öğrenin, farelerde Salmonella Typhimurium ile septik peritonit modeli oluşturma yöntemini. Bu model, sepsis sırasında inflamatuar yanıtları ve ölümcül konak tepkilerini araştırmak için etkili bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Merkezi Hayvan Tesisi, IISc'ye araştırma için bize fareler sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü ve Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu'ndan DpN'ye verilen hibelerle finanse edilmiştir. DBT-IISc programından gelen altyapı desteği ve DST-FIST hibeleri büyük ölçüde kabul edilmektedir. DpN laboratuvarının önceki ve mevcut tüm üyelerine destekleri için teşekkür ederiz.

Salmonella Typhimurium kullanılarak yapılan tüm deneyler Biyo Güvenlik Seviye 2 (BSL-2) tesislerinde gerçekleştirilmiştir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanmak, güvenliği sağlamak ve standart BSL-2 biyolojik tehlike bertaraf yöntemlerini takip etmek için özen gösterilmelidir. Tüm fare deneyleri, Kurumsal Hayvan Etiği Komitesi, IISc tarafından belirtilen yönergeleri izleyerek gerçekleştirilmiştir. Fareler, Hindistan Hükümeti Çevre ve Orman Bakanlığı tarafından onaylanan IISc Merkezi Hayvan Tesisi'nde (Kayıt numarası: 48/1999/CPCSEA, 1/3/1999 tarihli) yetiştirildi ve bakımı yapıldı. Deney protokolleri, Hayvanlar Üzerinde Yapılan Deneylerin Amaç ve Kontrol ve Denetimi Komitesi tarafından CAF/Ethics/797/2020 onaylı izin numarası ile onaylanmıştır.
BSL2 tanımı: BSL2 derecesi, biyotehlikeli ajanların çevre ve laboratuvar personeli için orta derecede tehdit oluşturduğunu gösterir5.
1. Salmonella Typhimurium'un kültür hazırlığı         
<ol><li>3 mL Luria Bertani (LB) suyuna 100 μL Salmonella Typhimurium NCTC 12023 gliserol stoğu ekleyin. Kültürü gece boyunca 37 ° C'de 160 rpm'de inkübe edin.</li>
	<li>LB suyunda gece yetiştirilen kültürün 50 μL'sini bir Salmonella Shigella (SS) agar plakasına yerleştirin ve ~ 12 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. SS agar plakasını, in vivo enfeksiyon deneyinden önce birkaç gün boyunca bakteri kolonileri ile 4 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Bir mikrouç kullanarak çizgili SS agar plakasından tek bir koloni seçin. Mikroucu gece boyunca 37 ° C'de 160 rpm'de 3 mL LB et suyu ve kültürüne çıkarın.</li>
	<li>50 mL LB suyuna 0,1 mL bakteri kültürü ekleyin ve logaritmik büyüme aşamasına ulaşmak için 3-4 saat boyunca 160 rpm'de bir çalkalayıcı inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. LB suyu kullanarak kültürü 2 kat seyreltin. NOT: Logaritmik aşamada, bakteri hücreleri en iyi sağlıklarındadır ve aktif olarak bölünürler.</li>
	<li>Bir spektrofotometre veya mikroplaka okuyucuda 600 nm ışık dalga boyunda kültürün optik yoğunluğunu (OD) ölçün. OD 1.0'a ulaştığında, 1.5 mL mikrofüj tüplerinde 1 mL kültürden iki aliquot yapın.</li>
	<li>Tüpleri 15 dakika boyunca 7.750 × g'da santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve peleti 1 mL 1x PBS 2x ile yıkayın. Tüpleri 15 dakika boyunca 7.750 × g'da santrifüj yapın.</li>
	<li>Pelet, iki farklı 1,5 mL mikrofüj tüpünde 0,5 mL 1x PBS'de yeniden askıya alın. Her iki tüpten gelen süspansiyonları, şimdi ~2 × 108 koloni oluşturan birim (CFU) / mL içeren bir 1,5 mL tüpte birleştirin.</li>
	<li>Bu stok çözeltisini seyrelterek 1 × 106 CFU / mL'lik bir bakteriyel hücre süspansiyonu hazırlayın. DİKKAT: Deneyleri başlatmadan önce OD 1.0 için CFU'yu belirlemek üzere belirli laboratuvar koşullarında OD'ye karşılık gelen CFU'yu optimize edin.</li>
</ol>2. Fareler ve enfeksiyonlar
<ol><li>Ev 8-10 haftalık erkek C57BL / 6 fareleri, alışma için birkaç gün boyunca hayvan tesisinin temiz hava odasında ~ 20 g ağırlığındadır.</li>
	<li>Enfeksiyon gününde, fareyi bir elinizle tutun, karın derisini% 70 etanol ile silin ve karın duvarının daha iyi erişilebilir olması için arka bacakları yayın.</li>
	<li>1 mL'lik bir şırınga yardımıyla intraperitoneal olarak 0,5 mL'lik 1 × 106 CFU / mL bakteriyel süspansiyon enjekte edin. Bu nedenle, her fare 5 × 105 CFU alır. Kontrol, enfekte olmamış fareler tek başına 0.5 mL PBS alır. Enfeksiyon sonrası, enjekte edilen gerçek CFU'yu kontrol etmek için kültürü plakalayın, bu da 0.2-0.8 milyon CFU / 0.5 mL arasında değişebilir.</li>
	<li>Fareleri atandığı gibi kafeslere geri koyun.</li>
	<li>En iyi yanıt için CO 2 boğulması ~12-18 saat enfeksiyon sonrası kullanarak fareleri feda edin. Genellikle, tüm enfekte fareler 96 saat içinde ölür. Bazı deneysel müdahaleler altında, bazı fareler hayatta kalabilir. Bu fareleri 96 saat sonra ötenazileştirin. Ayrıca, vücut ısısı 33.2 ° C'nin altında olan ve 96 saatte akut sıkıntı çeken herhangi bir fareyi insancıl bir son nokta olarak ötenazi yapın. NOT: Bu modelde, bazı fareler 12 saatlik Salmonella enjeksiyonundan sonra ölmeye başlayabilir. Bu nedenle, birden fazla zaman noktasını içeren deneyleri uygun şekilde planlayın.</li>
</ol>3. Organların CFU değerlendirmesi
<ol><li>Enfekte fareyi CO2 boğulması ile feda edin ve% 70 etanol içine batırılmış bir parça pamukla karnı silin. Karın derisini kesin. Peritoneal lavaj sıvısının nasıl toplanacağına dair bir video protokolü için Ray ve Dittel'in makalesine bakın6. Peritoneal boşluğu kesin ve mikrofüj tüplerinde ilgilenilen organları toplayın. Ek olarak, sepsisli farelerde kan hızlı bir şekilde pıhtılaştığından ve miktarlar düşük olduğundan, fedakarlıktan sonra hızlı bir şekilde toplayın. NOT: Bu video, bu sepsis modelinde karaciğer geniş histopatolojik hasara uğradığı için organ CFU'sunun karaciğerden sayımını göstermektedir.</li>
	<li>Karaciğerin küçük bir parçasını kesin ve bir mikrofüj tüpüne yerleştirin. NOT: Bu, bir sonraki adıma geçmeden önce en fazla 2-3 saat buz üzerinde saklanabilir.</li>
	<li>Parçaları tartın ve mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Tercihen, uygun homojenizasyon için ~ 10-15 mg ağırlığındaki kesilmiş parçalar. Mezenterik lenf düğümleri (MLN'ler) veya timus gibi daha küçük organlarda tüm organları kullanın.</li>
	<li>Tüpe 0,5 mL 1x PBS ekleyin ve bir el homojenizatörü kullanarak organları homojenize edin. Organların tamamen homojenize edildiğinden emin olun. 0,5 mL'lik 1x PBS ekleyerek hacmi 1 mL'ye yükseltin.</li>
	<li>Tüpleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj yapın.</li>
	<li>Süpernatantı taze mikrofüj tüplerine toplayın ve 96 delikli bir plakada 1 × 10−1 ve 10−2 seyreltmeleri hazırlayın.</li>
	<li>Seyrelticinin 50 μL'sini taze SS agar plakalarına yayın ve plakaları 12 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Her koşulda görünen kolonilerin sayısını sayın ve Denklem (1)'i kullanarak verileri organ ağırlığıyla normalleştirin: CFU/mg = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63695/63695eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1) NOT: Formülde plaka başına kolonileri CFU / mL'ye dönüştürmek için 20 sayısı kullanılır. Bu sayıya, 1 mL'nin, kaplanan kültürün belirli bir hacminin miktarına bölünmesiyle elde edilir - bu durumda, 50 μL. Örneğin, 10 mg ağırlığındaki homojenize bir organın 1 × 10-1 seyreltilmesinin 50 μL'sinin yayıldığı bir SS agar plakasında 100 koloni bulunursa, o zaman CFU/mg = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63695/63695eq02.jpg" style="margin: auto;">
</li>
</ol>4. Peritoneal eksüdada çeşitli immün hücre popülasyonlarının akış sitometrik analizi
<ol><li>Daha önce Ray ve Dittel6 tarafından tanımlandığı gibi periton hücrelerini toplayın.</li>
	<li>Hücre peletini peritoneal lavaj sıvısından fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 1 mL RPMI içinde yeniden askıya alın. Bir hemositometre kullanarak periton lavajındaki toplam hücre sayılarını numaralandırın. Hücre numarasını, her tüp 0.2-0.5 milyon hücre alacak şekilde ayarlayın. NOT: Sepsisli farelerde periton lavajı, muhtemelen kanama nedeniyle ortaya çıkan RBC'ler içerebilir. Peritoneal hücreleri sayarken RBC'leri dışlamaya dikkat edin. Parlak alan mikroskobunda, RBC'ler bağışıklık hücrelerinden çok daha küçük görünür. Bunlar, ortada bir girinti bulunan, ancak içi boş olmayan, yuvarlak, düz diskler veya çörekler olarak görünür. RBC'leri lize etmek için bir adımeklenebilir 7.</li>
	<li>Hücreleri 10 dakika boyunca 4 ° C'de 200 × g'da döndürün, süpernatanı atın ve hücreleri 1x soğuk PBS ile 1x yıkayın. Hücreleri 10 dakika boyunca 4 °C'de 200 × g'da santrifüj yapın.</li>
	<li>PBS'de% 5 FBS ve% 0.02 sodyum azidden oluşan blokaj tamponunda hazırlanan FcR blokeri (1:400 seyreltme) kullanarak PEC'lerdeki Fc reseptörlerini bloke edin. 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hücreleri 10 dakika boyunca 4 °C'de 200 × g'da santrifüj yapın. Süper natantı atın. Bloke edici tamponla ilgilenen florokrom konjuge antikorları seyreltin. Nötrofilleri boyamak için fare karşıtı LY6G'nin 1:500 seyreltilmesini kullanın. NOT: Diğer bağışıklık hücresi popülasyonları, örneğin, B hücreleri için fare karşıtı B220, T hücreleri için fare karşıtı CD3 ve makrofajlar için fare karşıtı F4/80 kullanılarak da tespit edilebilir.</li>
	<li>Ayrı tüplerdeki seyreltilmiş antikor çözeltilerinin 200 μL'sinde ~ 0.2 milyon hücreyi inkübe edin. Negatif bir kontrol olarak, lekesiz kontrolün hücreleri antikorsuz 200 μL bloke edici tamponla inkübe etmesi için her florokrom tipinde bir tüp ayırın.</li>
	<li>Her 15 dakikada bir aralıklı dokunma ile numuneleri 45 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj yapın. Süper natantı atın. Birkaç gün boyunca saklanmaları gerekiyorsa, hücreleri% 4 paraformaldehit ile oda sıcaklığında ~ 15 dakika sabitleyin. Bununla birlikte, bir akış sitometresinde taze boyanmış örneklerden veri elde etmek en iyisidir.</li>
	<li>Hücreleri 200 μL FACS boyama tamponunda (PBS'de% 2 FBS) yeniden askıya alın. Verileri bir akış sitometresinde alın.</li>
</ol>

<ol><li>Hotchkiss, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+and+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Sepsis and septic shock.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).</li>
<li>Rudd, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regional%2C+and+national+sepsis+incidence+and+mortality%2C+1990-2017%3A+Analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).</li>
<li>Vincent, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+study+of+the+prevalence+and+outcomes+of+infection+in+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units.</a> JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).</li>
<li>Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+murine+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Infections%22%5BJournal%5D)">Current murine models of sepsis.</a> Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).</li>
<li>Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+and+biohazards%3A+Understanding+biosafety+levels+and+meeting+safety+requirements+of+a+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22Biobanking%22%5BJournal%5D)">Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank.</a> Biobanking. 1897, 213-225 (2019).</li>
<li>Ray, A., Dittel, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mouse+Peritoneal+Cavity+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488(2010).</li>
<li>Liu, X., Quan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+isolation+from+mouse+femur+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Immune cell isolation from mouse femur bone marrow.</a> Bio-protocol. 5 (20), 1631(2015).</li>
<li>Yadav, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+2+enhances+the+survival+of+mice+during+Salmonella+Typhimurium+infection-induced+sepsis+by+increasing+reactive+oxygen+species%2C+inflammatory+cytokines+and+recruitment+of+neutrophils+to+the+peritoneal+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity.</a> Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).</li>
<li>Verma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+hemoglobin+is+a+marker+of+systemic+inflammation+in+mouse+models+of+sepsis%3A+A+Raman+spectroscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study.</a> Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).</li>
<li>Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+mouse+peritoneal+macrophages%3A+Heterogeneity%2C+development%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function.</a> Frontiers in Immunology. 6, 225(2015).</li>
<li>Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+pathophysiology+of+sepsis%2C+an+inflammatory+disorder%3A+Key+roles+of+oxidative+and+nitrosative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress.</a> Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2(2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Bu makalede, Salmonella Typhimurium'un intraperitoneal enjeksiyonu ile ciddi bir bakteriyel sepsis formunu indükleme yöntemi açıklanmaktadır. Bu model, Salmonella Typhimurium'un hücre içi bir patojen olması ve dolayısıyla Gram-negatif sepsisin klinik olarak ilgili durumunu taklit eden oldukça patojenik olması nedeniyle diğerlerine göre avantajlıdır. Bu modelde peritonit sepsisinin sonucu sistemiktir ve enfeksiyon sonrası 96 saat içinde %100 mortalite vardır. Bu nedenle, bu model enflamatuar ve ölümcül k...

Sepsis, mikrobiyal invazyon veya doku hasarına karşı düzensiz sistemik inflamatuar ve immün yanıt olarak tanımlanır ve enfeksiyon veya hasar bölgesinden uzakta organ hasarına yol açar. Septik şok, hacim resüsitasyonu sırasında devam eden hipotansiyon ile karakterize bir sepsis alt kümesidir ve mortalite riski önemli ölçüde artmıştır1. Genel halk, COVID-19 pandemisi sırasında bu bozukluğun daha fazla farkına varmıştır. Yüksek ilişkili mortalitesine rağmen, sepsisin küresel yükü ile ilgili kapsamlı epidemiyolojik veriler, tanısının karmaşıklığı nedeniyle eksiktir. 2017 yılında, dünya çapında 48,9 milyon sepsis insidansı ve 11 milyon ölüm meydana gelmiş olup, tüm küresel ölümlerin %19,7'sini oluşturmaktadır2. Ayrıca, yoğun bakım hastalarında enfeksiyon ve buna bağlı sepsis prevalansının uzaması üzerine yapılan bir çalışmada, hastalardan pozitif izolatların% 62'sinin Gram-negatif organizmalar olduğu bulunmuştur3.
Sepsis üzerine yapılan araştırmalar başlangıçta mikrobiyal patogenezi tanımlamaya odaklanmıştır. Bununla birlikte, konağın kendini ve benlik olmayanı nasıl ayırt ettiğini belirleyen "tehlike hipotezini" anlamak, sepsis araştırmasının dengesinin, istilacı bir patojene karşı konakçı tepkisini anlamaya doğru eğilmesine yol açmıştır. Sepsisin yaygın olarak kullanılan fare modelleri arasında lipopolisakkarit (LPS) kaynaklı endotoksemi modeli, polimikrobiyal sepsis modelleri, çekal ligasyon ve ponksiyon (CLP) ve kolon ascendens stent peritonit (CASP) ve monobakteriyel enfeksiyon modelleri4 bulunmaktadır.
Salmonella Typhimurium kullanarak periton sepsisini indükleyerek fare model sistemi standartlaştırdık. Bu model diğerlerine göre avantajlıdır, çünkü Salmonella Typhimurium, Gram-negatif sepsisin klinik olarak ilgili durumunu taklit eden hücre içi bir patojendir. Bu modelde peritonit sepsisinin sonucu sistemiktir ve enfeksiyon sonrası 96 saat içinde %100 mortalite vardır. Bu nedenle, bu model enflamatuar ve ölümcül konakçı yanıtlarını incelemede etkilidir. Bu modelde sepsis, intraperitoneal olarak 0.5 milyon koloni oluşturan Salmonella Typhimurium biriminin (CFU) 8-10 haftalık bir C57BL / 6 fareye enjekte edilmesiyle indüklenir. Sistemik enfeksiyon, enfeksiyon sonrası organ bakteri yükünün ~ 16 saat değerlendirilmesiyle doğrulanabilir. Bu makalede, farelerde Salmonella Typhimurium kaynaklı peritonit sepsisi gösterilmektedir, periton hücre kompozisyonunda ortaya çıkan değişiklikleri karakterize etmekte ve farklı organlardaki bakteri yükünü ölçmektedir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Sarf Malzemeleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 26 G iğneli Steril Şırınga</td><td>Beckton Dickinson, Singapur</td><td>303060</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Mikrosantrifüj Tüpü</td><td>Tarsons, ABD</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>21 G iğneli 10 mL Steril Şırınga</td><td>Beckton Dickinson, İspanya</td><td>307758</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konik Şişe</td><td>Tarsons, ABD</td><td>441150</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Dereceli Santrifüj Tüpü</td><td>Tarsons, ABD</td><td>546041</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Dereceli Santrifüj Tüpü</td><td>Tarsons, ABD</td><td>546021</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Yayıcı</td><td>VWR, ABD</td><td>VWRU60828-680</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin</td><td>HiMedia, Mumbai, Hindistan</td><td>TS1006</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>FcR engelleyici</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FITC Sıçan anti-fare Ly6G (Klon 1A8)</td> <td>BD Pharmingen</td><td>551460</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>El bazlı Homojenizatör</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hemositometre (Neubauer sayma odası)</td> <td>Rohem, Hindistan</td><td>I.S. 10269</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>HiMedia, Mumbai, Hindistan</td><td>M1245</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Petriplates</td><td>Tarsons, ABD</td><td>460091</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Himedia, Mumbai, Hindistan</td><td>AT060-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella-Shigella Agar</td><td>HiMedia, Mumbai, Hindistan</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Ekipmanlar < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Santrifüj</td><td>Kubota</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>BD FACSverse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuluçka makinesi</td><td>N-biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tartı makinesi</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

farelerde salmonella typhimurium ile İndüklenen septik peritonitin karakterizasyonu

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

Sepsis, mikrobiyal invazyon veya doku hasarına karşı düzensiz bir konakçı immün tepkisidir ve enfeksiyon veya hasardan uzak bir bölgede organ hasarına yol açar. Günümüzde sepsisin yaygın olarak kullanılan fare modelleri arasında lipopolisakkarit (LPS) kaynaklı endotoksemi, çekal ligasyon ve ponksiyon (CLP) ve monobakteriyel enfeksiyon modeli sistemleri bulunmaktadır. Bu protokol, farelerde Salmonella Typhimurium enfeksiyonuna bağlı septik peritonit sırasında konakçı yanıtlarını incelemek için bir yöntemi açıklar. S. Gram-negatif hücre içi patojen olan tifimuryum, farelerde tifo benzeri hastalığa neden olur.
Bu protokol, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla farelerde septik peritonitin indüklenmesi ve sistemik konakçı yanıtlarını incelemek için kullanılan yöntemler hakkında kültür hazırlığı, indüksiyon konularını detaylandırır. Ayrıca, farklı organlardaki bakteri yükünün değerlendirilmesi ve periton lavajında artmış nötrofil sayılarının akış sitometrik analizi sunulmaktadır. Salmonella Farelerde tifimuryuma bağlı sepsis, proinflamatuar sitokinlerde bir artışa ve periton boşluğunda nötrofillerin hızlı infiltrasyonuna yol açarak daha düşük sağkalıma yol açar.
Bu protokoldeki her adım optimize edilmiş ve septik peritonit patogenezinin yüksek tekrarlanabilirliği ile sonuçlanmıştır. Bu model, bakteriyel sepsis sırasında immünolojik yanıtları, farklı genlerin hastalık progresyonundaki rollerini ve ilaçların sepsiyi zayıflatma etkilerini incelemek için yararlıdır.

Bu özel model kullanılarak konakçı immün yanıtının ayrıntılı bir karakterizasyonu önceki yayınlarda gösterilmiştir 8,9. Açıklanan protokolün birkaç temsili sonucu bu bölümde gösterilmiştir. Bu model S'nin sistemik enfeksiyonunu indüklemeyi amaçlamaktadır. Sepsisi indüklemek için bakteri kültürünün intraperitoneal enjeksiyonu ile typhimurium. Enfeksiyonu doğrulamak için, septik farelerden karaciğer lizatları ve dalak SS agar plakalarına yayıldı ve kolonil...

Bu protokol, bir fare modeli sisteminde Gram-negatif monobakteriyel sepsisin indüksiyonunu açıklar. Model, sepsis sırasında inflamatuar ve ölümcül konakçı yanıtlarının araştırılmasında yararlıdır.

Farelerde Salmonella Typhimurium ile İndüklenen Septik Peritonitin Karakterizasyonu

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection ...

Sepsis, mikrobiyal invazyon veya doku hasarına karşı düzensiz bir konakçı immün tepkisidir ve enfeksiyon veya hasardan uzak bir bölgede organ hasarına yol açar. Genel halk, COVID-19 pandemisi sırasında bu bozukluğun daha fazla farkına varmıştır. 2017 yılında, 48,9 milyon sepsis insidansı ve dünya çapında 11 milyon ölüm vardı ve bu da tüm küresel ölümlerin neredeyse% 20'sini oluşturuyordu.Tahmin edilebileceği gibi, vakaların çoğu hastanelerdedir. Aslında, bir çalışma, sepsisli YBÜ'lerdeki hastalardan pozitif izolatların neredeyse% 62'sinin gram-negatif organizmalar olduğunu bulmuştur. Birkaç model vardır ve sepsisin yaygın olarak kullanılan fare modellerinden bazıları LPS kaynaklı endotoksemi, çekal ligasyon ve delinme modeli ve monobakteriyel enfeksiyon modeli sistemlerini içerir.Laboratuvarımızda Salmonella Typhimurium kullanarak periton sepsisini indüklemek için fare model sistemini standartlaştırdık. Bu model diğerlerine göre avantajlıdır, çünkü Salmonella Typhimurium, gram-negatif sepsisin klinik olarak ilgili durumunu taklit eden hücre içi bir patojendir. Bu modelde peritonit sepsisinin sonucu, enfeksiyondan sonraki 96 saat içinde %100 mortalite ile sistematiktir.Bu nedenle, bu model inflamatuar konakçı yanıtlarının incelenmesinde etkilidir. Bu modelde sepsis, 8-10 haftalık bir C57BL/6 farede intraperitoneal olarak 0.5 milyon CFU Salmonella Typhimurium enjekte edilerek indüklenir. Sistemik enfeksiyon, enfeksiyondan yaklaşık 16 saat sonra organ bakteri yükünü değerlendirerek doğrulanabilir.Salmonella Typhimurium kullanılarak yapılan deneyler, BSL-2 tesisi ve BSL-2 kılavuzlarına bağlılık gerektirir. Uygun KKD'lerin kullanılmasına, güvenliğin sağlanmasına özen gösterilmeli ve standart BSL-2 biyolojik tehlike bertaraf yöntemlerine uyulmalıdır. Tüm deneyler kurumsal hayvan etik kurulu tarafından onaylanmıştır.Salmonella Typhimurium'un kültür hazırlığı. 3 mL LB suyuna yüz mikrolitre Salmonella Typhimurium NCTC 12023 gliserol stoğu ekleyin. Kültürü dakikada 160 devirde, bir gecede 37 santigrat derecede inkübe edin.LB suyunda bir gecede yetiştirilen kültürün 50 mikrolitresini bir Salmonella Shigella agar plakasına yerleştirin ve 12 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bir mikro uç kullanarak çizgili SS agar plakasından tek bir koloni seçin. Mikroucu 3 mL LB suyuna ve kültürü gece boyunca 37 santigrat derecede 160 RPM'ye çıkarın.50 mL LB suyuna 0.1 mL bakteri kültürü ekleyin ve logaritmik büyüme aşamasına ulaşmak için üç ila dört saat boyunca 160 RPM'de bir çalkalayıcı inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. LB suyu kullanarak kültürü iki kat seyreltin. Bir spektrofotometrede 600 nanometre ışık dalga boyunda kültürün optik yoğunluğunu ölçün.OD bire ulaştığında, 1.5 mL mikrofüj tüplerinde 1 mL kültürden iki aliquot yapın. Tüpleri 15 dakika boyunca 7.750 G'de santrifüj yapın. Bu süpernatanı atın ve peleti 1 mL 1XPBS ile iki kez yıkayın.Tüpleri 15 dakika boyunca 7.750 G'de santrifüj yapın. Peleti 0,5 mL 1XPBS'de, iki farklı 1,5 mL mikrofüj tüpünde yeniden askıya alın. Her iki tüpten gelen süspansiyonları, şimdi içeren, yaklaşık iki tanesi 10 ile çarpılarak mL başına sekiz koloni oluşturan birimin gücüne yükseltilmiş 1,5 mL'lik bir tüpte birleştirin.Stok çözeltisini seyrelterek 10 güç altı CFU / mL'lik bir bakteriyel hücre süspansiyonu hazırlayın. Önemli not, deneyleri başlatmadan önce OD için CFU'yu belirlemek üzere laboratuvarınızdaki OD'ye karşılık gelen CFU'yu optimize edin. Fareler ve enfeksiyonlar.Enfeksiyon gününde, fareyi bir elinizle tutun, karın derisini% 70 etanol ile silin ve karın duvarının daha iyi erişilebilir olması için arka bacakları yayın. 1 mL'lik bir şırınga yardımıyla intraperitoneal olarak altı CFU / mL bakteriyel süspansiyona yükseltilmiş 10'un 0,5 mL'sini enjekte edin. Enfeksiyon sonrası, enjekte edilen gerçek CFU'yu kontrol etmek için kültürü plakalar, bu da 0,5 mL başına 0,2 ila 0,8 milyon CFU arasında değişebilir.Organların CFU değerlendirmesi. Fare, karbondioksit boğulması kullanılarak kurban edildi. Enfekte fareyi feda ettikten sonra,% 70 etanol içine batırılmış bir parça pamukla karnı silin.Karın derisini kesin. Bir video protokolü için Ray ve Dittle'ın periton lavaj sıvısının nasıl toplanacağına dair makalesine bakın. Peritoneal boşluğu kesin ve ilgilenilen organı toplayın.Bu videoda, organ CFU'sunun karaciğerden sayımını gösteriyoruz. Karaciğer, bu sepsis modelinde geniş histopatolojik hasara uğrar. Küçük bir karaciğer parçasını kesin ve bir mikrofüj tüpüne yerleştirin.Bu, bir sonraki adıma geçmeden önce iki ila üç saat boyunca buzda saklanabilir. Parçayı tartın ve bir mikrofüj tüpüne aktarın. Tercihen, uygun homojenizasyon için yaklaşık 10 ila 15 mg ağırlığındaki parçaları kesin.Tüpe 0,5 mL 1XPBS ekleyin ve bir el homojenizatörü kullanarak organları homojenize edin. Organların tamamen homojenize edildiğinden emin olun. 0,5 mL'lik 1XPBS ekleyerek hacmi 1 mL'ye yükseltin.Tüpleri 200 G'de beş dakika boyunca, dört santigrat derecede santrifüj yapın. Süpernatantı taze mikrofüj tüplerine toplayın. 96 kuyucuklu bir plakada 10'luk bir güç eksi bir ve güç eksi iki için 10 seyreltme hazırlayın.Seyrelticinin 50 mikrolitresini taze SS agar plakalarına yayın ve plakaları 12 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Aşağıdaki formülü kullanarak her koşulda görünen koloni sayısını sayın ve verileri organ ağırlığıyla normalleştirin. CFU / mg, koloni sayısına eşittir, 20 ile çarpılır, seyreltme faktörü ile çarpılır, tamamı mg cinsinden organ ağırlığına bölünür.Not, formülde plaka başına kolonileri CFU / mL'ye dönüştürmek için 20 sayısı kullanılır. Bu sayıya, kaplanan belirli bir kültür hacminin miktarının 1 mL'sine bölünerek ulaşılır. Bu durumda, 50 mikrolitre.Örneğin, bir SS agar plakasında, 10 mg ağırlığındaki homojenize organın 50 mikrolitresi eksi homojenize organın bir seyreltilmesinin yayıldığı yüz koloni bulursanız, CFU / mg, 100 ile çarpıldığında 100'e eşit olacaktır, 10 ile çarpılır, tamamı 10'a bölünür, bu da 2000 CFU / mg'a eşittir. Peritoneal eksüdada çeşitli immün hücre popülasyonlarının akım sitometrik analizi. Peritoneal hücreleri daha önce tarif edildiği gibi, Ray ve Dittle tarafından toplayın.Hücre peletini periton lavaj sıvısından resüspane edin,% 10 FBS ile desteklenmiş 1 mL RPMI'da. Bir hemositometre kullanarak periton lavajındaki toplam hücre sayılarını numaralandırın. Hücre numarasını, her tüp iki ila beş alacağı ve beş hücrenin gücüne yükseltilmiş 10 ile çarpıldığı şekilde ayarlayın.Hücreleri 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 200 G'de döndürün. Süper natantı atın. Hücreleri 1XPBS ile bir kez yıkayın.Hücreleri 10 dakika boyunca 200 G'de santrifüj yapın. FcR blokerini kullanarak Fc reseptörlerini bloke edin. Bunlardan biri, PBS'de% 5 FBS ve% 0.02 sodyum azidden oluşan, bloke edici tamponda hazırlanan 400 seyreltmedir.15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Hücreleri 10 dakika boyunca 200 G'de santrifüj yapın. Süper natantı atın.Bloke edici tamponla ilgilenen florokrom konjuge antikorları seyreltin. Burada, nötrofilleri boyamak için fare karşıtı Ly6G'nin 500 seyreltilmesine bir tane kullanıyoruz. Not, B hücreleri için fare karşıtı B220, T hücreleri için fare karşıtı CD3, makrofajlar için fare karşıtı F4/80 vb. kullanılarak diğer bağışıklık hücresi popülasyonları da gösterilebilir.Ayrı tüplerde, 200 mikrolitre seyreltilmiş antikor çözeltisinde yaklaşık 0.2 milyon hücreyi inkübe edin. Negatif kontrol olarak, lekesiz kontrol için her florokrom tipinde bir tüp ayırın. Bu tüpte, hücreleri antikorsuz 200 mikrolitre bloke edici tampon ile inkübe edin.Numuneleri buz üzerinde 45 dakika boyunca inkübe edin, her 15 dakikada bir aralıklı dokunma yapın. Hücreleri 200 G'de 10 dakika boyunca, dört santigrat derecede santrifüj yapın. Süper natantı atın.Birkaç gün saklamak gerekirse, hücreleri% 4 paraformaldehit ile oda sıcaklığında 15 dakika sabitleyin. Hücreleri 200 mikrolitre FACS boyama tamponunda, PBS'de% 2 FBS'de yeniden askıya alın. Akış sitometresindeki verileri alın.Burada gösterilen SS agar plakalarının görüntüleri, septik farelerin karaciğerinde ve dalağında organ CFU yükünü göstermektedir. Homojenize edilmiş organ Lys6, 10'un seyreltilmesiyle eksi bir güce yayıldı ve 37 santigrat derecede inkübe edildi. Siyah pigmentli S.Typhimurium kolonileri, inkübasyondan yaklaşık 12 saat sonra ortaya çıktı.Plakanın bir kısmı, kolonileri vurgulamak için yakınlaştırılmış iç kısım olarak burada gösterilmiştir. Bu sonuçlar, patojenin sistemik olarak başarılı bir şekilde yayıldığını ve iç organları kolonize ettiğini göstermektedir. Bu şekil, sağlıklı ve septik farelerden izole edilen serumları göstermektedir.Septik farelerden toplanabilir kan hacmi, sağlıklı kontrollerden daha azdır, bu nedenle elde edilen serum daha azdır. Bu, sepsiste artan pıhtılaşma nedeniyle olur. Ayrıca septik farelerden elde edilen serumlar, geniş hemoliz oluşumunu gösteren belirgin kırmızı renklenme gösterir.Şekil, anti-Ly6G antikoru ile boyanmış sağlıklı ve septik farelerden periton hücrelerinin sitometrik grafiklerini göstermektedir. Bu görüntüler bir sağlıklı ve iki enfekte fareyi temsil etmektedir. Septik fareler, nötrofillerin periton boşluğuna infiltrasyonunun arttığını gördü.Bu videoda, Salmonella Typhimurium'un intraperitoneal enjeksiyonu ile farelerde bakteriyel sepsisi indükleme yöntemini gösterdik. Bu, sepsisi zayıflatmada terapötik müdahalelerin etkilerini incelemek için yararlı bir modeldir. Bu model sistemde, periton boşluğunun hücresel bileşimi, patojenle mücadele etmek için çarpıcı biçimde değişir.Bu nedenle, sepsis sırasında bağışıklık hücresi bileşimlerindeki ve işlevlerindeki kinetik değişiklikleri incelemede yararlı bir modeldir. Model ayrıca, hepsi sepsis sırasında meydana gelen hücreler arası reaktif oksijen türleri, pro-inflamatuar sitokin seviyeleri, hemoliz ve kan pıhtılaşmasındaki artışı anlamada da yararlıdır.

characterizing-salmonella-typhimurium-induced-septic-peritonitis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kalıcı kronik bakteriyel enfekte fare modelinin...

Kronik Salmonella Infected Fare Modeli

Şeffaf zebrabalıkları embriyolar gibi görselleştirmek için faydalı model bilgisayarlar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ve hücre içi bakteriyel patojenler arasında işlevsel çalışma etkileşimleri,...

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Kaynak: Lo, B. C. ve diğerleri. Kronik Salmonella enfeksiyonu bağırsak fibrozisine neden olmuştur. J. Vis. Exp. (2019)Video, streptomisin dirençli Salmonella typhimurium ile kronik enfeksiyonun fare modelinde bakteriyel yükün nicelendirilmesini gösteriyor. Ötenazi ve steril diseksiyondan sonra, çek ve dalak dokuları toplanır, bakteriler salınmak için çelik boncuklarla homojenleştirilir ve seri olarak seyreltilir. Sulandırmalar seçici agar'da kaplanır ve görünür koloniler sayılır; böylece...

Kronik bağırsak enfeksiyonu fare modelinde doku bakteriyel yükünün nicelendirilmesi

Citrobacter rodentium enfeksiyonu enterik bakteriyel enfeksiyonlar çalışma yanı sıra farelerde bağışıklık yanıtları ve kolit barındırmak için değerli bir model sunar. Bu protokol bariyer bütünlüğünü, patojen yük ve murin infeksiyöz kolit patojen ve konak katkıların tam karakterizasyonu izin histolojik hasar ölçümü özetliyor.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Bulaşıcı Kolit için çalışılması Patojen ve Host Katılımlar

In vitro olarak fenotip Salmonella veya diğer bakteri federasyonu, invazyon ve yüksek verimlilik kapasitesine sahip fagositik hücreler içerisinde replikasyon için yüksek verimli bir deney geliştirildi. Yöntem konak-patojen etkileşimleri onların tutulumlarla için Salmonella gen nakavt mutant suşlar değerlendirmek için kullanılmıştır.

Fenotipinin yüksek verim Deneyi Salmonella enterica Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma

Bu iletişim kuralı kurmak ve 7 günlük eski farelerde neonatal sepsis değerlendirmek için gerekli adımları sağlar.

Yenidoğan Polymicrobial Sepsis için kontrollü fare modeli

Bu protokol, transmural inflamasyon ve fibrozis de dahil olmak üzere Crohn hastalığının önemli patolojik işaretleri benzer Salmonella tahrikli bağırsak fibrozis bir fare modeli açıklar. Bu yöntem, C57Bl/6 genetik arka planda tutulan mutant fareler kullanılarak fibrotik sonuçları değiştiren konak faktörlerinin değerlendirilmesi için kullanılabilir.

Kronik Salmonella EnfeksiyonuNa Bağlı Bağırsak Fibrozisi

Küçük bir kodlamayan RNA micC'nin delesyon mutantını oluşturmak için λ-Kırmızı aracılı bir rekombinasyon sistemi kullanıldı.

Kodlamayan küçük RNA MicC, salmonella enteritidisteki dış zar proteinlerinde virülansa katkıda bulunur

Salmonella, hem Salmonella'ya özgü vakuollerde hem de sitosolde serbest (hiper-replikasyon) bağırsak epitel hücrelerinin içinde istila eder ve çoğalır. Burada, Salmonella'nın hücre içi fenotiplerini ImageJ aracılığıyla iki tamamlayıcı görüntü analizi ile ölçmek, tek hücreli çözünürlüğe ve puanlamaya ulaşmak için yüksek verimli floresan mikroskopi tabanlı bir protokol açıklanmaktadır.

ImageJ Kullanarak Salmonella'nın Hücre İçi Fenotiplerinin Otomatik Analizi

Kolon Ascendens Peritonit Stent (CASP) kemirgenlerde polimikrobiyal abdominal sepsis için oldukça iyi standardize edilmiş bir model. Bu makale CASP cerrahi prosedürü açıklar. CASP model ve türevleri, sepsis konu ile ilgili çeşitli sorunlar sistematik soruşturma izin verir.

Kolon Peritonit Stent Ascendens (CASP) - polimikrobik Abdominal Sepsis için bir Standart Model

Öğrenin, farelerde Salmonella Typhimurium ile septik peritonit modeli oluşturma yöntemini. Bu model, sepsis sırasında inflamatuar yanıtları ve ölümcül konak tepkilerini araştırmak için etkili bir araçtır.

Farelerde Salmonella Typhimurium ile İndüklenen Septik Peritonitin Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet