Farelerde Salmonella Typhimurium ile İndüklenen Septik Peritonitin Karakterizasyonu

Sepsis, mikrobiyal invazyon veya doku hasarına karşı düzensiz bir konakçı immün tepkisidir ve enfeksiyon veya hasardan uzak bir bölgede organ hasarına yol açar. Genel halk, COVID-19 pandemisi sırasında bu bozukluğun daha fazla farkına varmıştır. 2017 yılında, 48,9 milyon sepsis insidansı ve dünya çapında 11 milyon ölüm vardı ve bu da tüm küresel ölümlerin neredeyse% 20'sini oluşturuyordu.

Tahmin edilebileceği gibi, vakaların çoğu hastanelerdedir. Aslında, bir çalışma, sepsisli YBÜ'lerdeki hastalardan pozitif izolatların neredeyse% 62'sinin gram-negatif organizmalar olduğunu bulmuştur. Birkaç model vardır ve sepsisin yaygın olarak kullanılan fare modellerinden bazıları LPS kaynaklı endotoksemi, çekal ligasyon ve delinme modeli ve monobakteriyel enfeksiyon modeli sistemlerini içerir.

Laboratuvarımızda Salmonella Typhimurium kullanarak periton sepsisini indüklemek için fare model sistemini standartlaştırdık. Bu model diğerlerine göre avantajlıdır, çünkü Salmonella Typhimurium, gram-negatif sepsisin klinik olarak ilgili durumunu taklit eden hücre içi bir patojendir. Bu modelde peritonit sepsisinin sonucu, enfeksiyondan sonraki 96 saat içinde %100 mortalite ile sistematiktir.

Bu nedenle, bu model inflamatuar konakçı yanıtlarının incelenmesinde etkilidir. Bu modelde sepsis, 8-10 haftalık bir C57BL/6 farede intraperitoneal olarak 0.5 milyon CFU Salmonella Typhimurium enjekte edilerek indüklenir. Sistemik enfeksiyon, enfeksiyondan yaklaşık 16 saat sonra organ bakteri yükünü değerlendirerek doğrulanabilir.

Salmonella Typhimurium kullanılarak yapılan deneyler, BSL-2 tesisi ve BSL-2 kılavuzlarına bağlılık gerektirir. Uygun KKD'lerin kullanılmasına, güvenliğin sağlanmasına özen gösterilmeli ve standart BSL-2 biyolojik tehlike bertaraf yöntemlerine uyulmalıdır. Tüm deneyler kurumsal hayvan etik kurulu tarafından onaylanmıştır.

Salmonella Typhimurium'un kültür hazırlığı. 3 mL LB suyuna yüz mikrolitre Salmonella Typhimurium NCTC 12023 gliserol stoğu ekleyin. Kültürü dakikada 160 devirde, bir gecede 37 santigrat derecede inkübe edin.

LB suyunda bir gecede yetiştirilen kültürün 50 mikrolitresini bir Salmonella Shigella agar plakasına yerleştirin ve 12 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bir mikro uç kullanarak çizgili SS agar plakasından tek bir koloni seçin. Mikroucu 3 mL LB suyuna ve kültürü gece boyunca 37 santigrat derecede 160 RPM'ye çıkarın.

50 mL LB suyuna 0.1 mL bakteri kültürü ekleyin ve logaritmik büyüme aşamasına ulaşmak için üç ila dört saat boyunca 160 RPM'de bir çalkalayıcı inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. LB suyu kullanarak kültürü iki kat seyreltin. Bir spektrofotometrede 600 nanometre ışık dalga boyunda kültürün optik yoğunluğunu ölçün.

OD bire ulaştığında, 1.5 mL mikrofüj tüplerinde 1 mL kültürden iki aliquot yapın. Tüpleri 15 dakika boyunca 7.750 G'de santrifüj yapın. Bu süpernatanı atın ve peleti 1 mL 1XPBS ile iki kez yıkayın.

Tüpleri 15 dakika boyunca 7.750 G'de santrifüj yapın. Peleti 0,5 mL 1XPBS'de, iki farklı 1,5 mL mikrofüj tüpünde yeniden askıya alın. Her iki tüpten gelen süspansiyonları, şimdi içeren, yaklaşık iki tanesi 10 ile çarpılarak mL başına sekiz koloni oluşturan birimin gücüne yükseltilmiş 1,5 mL'lik bir tüpte birleştirin.

Stok çözeltisini seyrelterek 10 güç altı CFU / mL'lik bir bakteriyel hücre süspansiyonu hazırlayın. Önemli not, deneyleri başlatmadan önce OD için CFU'yu belirlemek üzere laboratuvarınızdaki OD'ye karşılık gelen CFU'yu optimize edin. Fareler ve enfeksiyonlar.

Enfeksiyon gününde, fareyi bir elinizle tutun, karın derisini% 70 etanol ile silin ve karın duvarının daha iyi erişilebilir olması için arka bacakları yayın. 1 mL'lik bir şırınga yardımıyla intraperitoneal olarak altı CFU / mL bakteriyel süspansiyona yükseltilmiş 10'un 0,5 mL'sini enjekte edin. Enfeksiyon sonrası, enjekte edilen gerçek CFU'yu kontrol etmek için kültürü plakalar, bu da 0,5 mL başına 0,2 ila 0,8 milyon CFU arasında değişebilir.

Organların CFU değerlendirmesi. Fare, karbondioksit boğulması kullanılarak kurban edildi. Enfekte fareyi feda ettikten sonra,% 70 etanol içine batırılmış bir parça pamukla karnı silin.

Karın derisini kesin. Bir video protokolü için Ray ve Dittle'ın periton lavaj sıvısının nasıl toplanacağına dair makalesine bakın. Peritoneal boşluğu kesin ve ilgilenilen organı toplayın.

Bu videoda, organ CFU'sunun karaciğerden sayımını gösteriyoruz. Karaciğer, bu sepsis modelinde geniş histopatolojik hasara uğrar. Küçük bir karaciğer parçasını kesin ve bir mikrofüj tüpüne yerleştirin.

Bu, bir sonraki adıma geçmeden önce iki ila üç saat boyunca buzda saklanabilir. Parçayı tartın ve bir mikrofüj tüpüne aktarın. Tercihen, uygun homojenizasyon için yaklaşık 10 ila 15 mg ağırlığındaki parçaları kesin.

Tüpe 0,5 mL 1XPBS ekleyin ve bir el homojenizatörü kullanarak organları homojenize edin. Organların tamamen homojenize edildiğinden emin olun. 0,5 mL'lik 1XPBS ekleyerek hacmi 1 mL'ye yükseltin.

Tüpleri 200 G'de beş dakika boyunca, dört santigrat derecede santrifüj yapın. Süpernatantı taze mikrofüj tüplerine toplayın. 96 kuyucuklu bir plakada 10'luk bir güç eksi bir ve güç eksi iki için 10 seyreltme hazırlayın.

Seyrelticinin 50 mikrolitresini taze SS agar plakalarına yayın ve plakaları 12 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Aşağıdaki formülü kullanarak her koşulda görünen koloni sayısını sayın ve verileri organ ağırlığıyla normalleştirin. CFU / mg, koloni sayısına eşittir, 20 ile çarpılır, seyreltme faktörü ile çarpılır, tamamı mg cinsinden organ ağırlığına bölünür.

Not, formülde plaka başına kolonileri CFU / mL'ye dönüştürmek için 20 sayısı kullanılır. Bu sayıya, kaplanan belirli bir kültür hacminin miktarının 1 mL'sine bölünerek ulaşılır. Bu durumda, 50 mikrolitre.

Örneğin, bir SS agar plakasında, 10 mg ağırlığındaki homojenize organın 50 mikrolitresi eksi homojenize organın bir seyreltilmesinin yayıldığı yüz koloni bulursanız, CFU / mg, 100 ile çarpıldığında 100'e eşit olacaktır, 10 ile çarpılır, tamamı 10'a bölünür, bu da 2000 CFU / mg'a eşittir. Peritoneal eksüdada çeşitli immün hücre popülasyonlarının akım sitometrik analizi. Peritoneal hücreleri daha önce tarif edildiği gibi, Ray ve Dittle tarafından toplayın.

Hücre peletini periton lavaj sıvısından resüspane edin,% 10 FBS ile desteklenmiş 1 mL RPMI'da. Bir hemositometre kullanarak periton lavajındaki toplam hücre sayılarını numaralandırın. Hücre numarasını, her tüp iki ila beş alacağı ve beş hücrenin gücüne yükseltilmiş 10 ile çarpıldığı şekilde ayarlayın.

Hücreleri 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 200 G'de döndürün. Süper natantı atın. Hücreleri 1XPBS ile bir kez yıkayın.

Hücreleri 10 dakika boyunca 200 G'de santrifüj yapın. FcR blokerini kullanarak Fc reseptörlerini bloke edin. Bunlardan biri, PBS'de% 5 FBS ve% 0.02 sodyum azidden oluşan, bloke edici tamponda hazırlanan 400 seyreltmedir.

15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Hücreleri 10 dakika boyunca 200 G'de santrifüj yapın. Süper natantı atın.

Bloke edici tamponla ilgilenen florokrom konjuge antikorları seyreltin. Burada, nötrofilleri boyamak için fare karşıtı Ly6G'nin 500 seyreltilmesine bir tane kullanıyoruz. Not, B hücreleri için fare karşıtı B220, T hücreleri için fare karşıtı CD3, makrofajlar için fare karşıtı F4/80 vb. kullanılarak diğer bağışıklık hücresi popülasyonları da gösterilebilir.

Ayrı tüplerde, 200 mikrolitre seyreltilmiş antikor çözeltisinde yaklaşık 0.2 milyon hücreyi inkübe edin. Negatif kontrol olarak, lekesiz kontrol için her florokrom tipinde bir tüp ayırın. Bu tüpte, hücreleri antikorsuz 200 mikrolitre bloke edici tampon ile inkübe edin.

Numuneleri buz üzerinde 45 dakika boyunca inkübe edin, her 15 dakikada bir aralıklı dokunma yapın. Hücreleri 200 G'de 10 dakika boyunca, dört santigrat derecede santrifüj yapın. Süper natantı atın.

Birkaç gün saklamak gerekirse, hücreleri% 4 paraformaldehit ile oda sıcaklığında 15 dakika sabitleyin. Hücreleri 200 mikrolitre FACS boyama tamponunda, PBS'de% 2 FBS'de yeniden askıya alın. Akış sitometresindeki verileri alın.

Burada gösterilen SS agar plakalarının görüntüleri, septik farelerin karaciğerinde ve dalağında organ CFU yükünü göstermektedir. Homojenize edilmiş organ Lys6, 10'un seyreltilmesiyle eksi bir güce yayıldı ve 37 santigrat derecede inkübe edildi. Siyah pigmentli S.Typhimurium kolonileri, inkübasyondan yaklaşık 12 saat sonra ortaya çıktı.

Plakanın bir kısmı, kolonileri vurgulamak için yakınlaştırılmış iç kısım olarak burada gösterilmiştir. Bu sonuçlar, patojenin sistemik olarak başarılı bir şekilde yayıldığını ve iç organları kolonize ettiğini göstermektedir. Bu şekil, sağlıklı ve septik farelerden izole edilen serumları göstermektedir.

Septik farelerden toplanabilir kan hacmi, sağlıklı kontrollerden daha azdır, bu nedenle elde edilen serum daha azdır. Bu, sepsiste artan pıhtılaşma nedeniyle olur. Ayrıca septik farelerden elde edilen serumlar, geniş hemoliz oluşumunu gösteren belirgin kırmızı renklenme gösterir.

Şekil, anti-Ly6G antikoru ile boyanmış sağlıklı ve septik farelerden periton hücrelerinin sitometrik grafiklerini göstermektedir. Bu görüntüler bir sağlıklı ve iki enfekte fareyi temsil etmektedir. Septik fareler, nötrofillerin periton boşluğuna infiltrasyonunun arttığını gördü.

Bu videoda, Salmonella Typhimurium'un intraperitoneal enjeksiyonu ile farelerde bakteriyel sepsisi indükleme yöntemini gösterdik. Bu, sepsisi zayıflatmada terapötik müdahalelerin etkilerini incelemek için yararlı bir modeldir. Bu model sistemde, periton boşluğunun hücresel bileşimi, patojenle mücadele etmek için çarpıcı biçimde değişir.

Bu nedenle, sepsis sırasında bağışıklık hücresi bileşimlerindeki ve işlevlerindeki kinetik değişiklikleri incelemede yararlı bir modeldir. Model ayrıca, hepsi sepsis sırasında meydana gelen hücreler arası reaktif oksijen türleri, pro-inflamatuar sitokin seviyeleri, hemoliz ve kan pıhtılaşmasındaki artışı anlamada da yararlıdır.