Mutant Metiyonin tRNA Sentetaz Fare Hattı Kullanılarak Hücre Tipi Özgül Protein Saflaştırma ve Kompleks Dokulardan Tanımlama

Bu protokol, proteinleri hücre tipine özgü bir şekilde etiketlemeyi mümkün kılar. Bu, böyle bir olasılık sunan ilk tekniktir ve in vitro veya in vivo olarak yapılabilir. Tekniğin temel avantajı, etiketli hücre tipine özgü proteinlerin tanımlanamayan saflaştırılabilmesi veya immünofloresan ile in situ olarak görselleştirilebilmesidir.

Dokunun ıslak ağırlığının 12 ila 15 katı hacimde lizis tamponu ekleyerek doku lizatını hazırlamaya başlamak ve homojenize olana kadar dokuyu tritürize etmek. Proteini denatüre etmek için bu homojenatı 15 dakika ila 75 santigrat derece ısıtın, ardından numuneyi santrifüj edin ve süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Bu örnek eksi 80 santigrat derecede saklanabilir.

Daha sonra, alkilasyon için homojenize numuneyi, EDTA içermeyen bir proteaz inhibitörü içeren fosfat salin tamponunda iki ila üç kez seyreltin. Daha sonra taze hazırlanmış iyodoasetamid'i 20 milimollük bir son konsantrasyona ekleyin. Numuneyi karanlıkta 20 santigrat derecede bir ila iki saat bekletin.

İyodoasetamid ekleme ve inkübasyon adımlarını iki kez tekrarlayın. Sütunu, önce sütunları vortekleyerek üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Ardından kapağı çıkararak alt kısmı kesin ve santrifüj yapın.

Ardından, önce tıklama kimyası değişim arabelleğini kullanarak tampon değişim sütunlarını dengeleyerek ve ardından tüm alkillenmiş numuneleri değiştirerek bir arabellek değişimi gerçekleştirin. Azidonorlösin birleşmesini değerlendirmek için, ima edilen numunenin 40 mikrolitresini alın ve 120 mikrolitrelik son hacme fosfat salin tamponu ekleyin. Ardından, reaksiyonu 20 saniye boyunca vortekleyerek tıklama kimyası reaksiyonunu ayarlayın.

Her bir reaktifi belirtilen sırayla mümkün olduğunca hızlı bir şekilde ekledikten sonra, numuneleri karanlıkta sürekli rotasyonla gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, santrifüjlemeden sonra numuneleri 17.000 kez G'de beş dakika boyunca santrifüj edin, hafif turkuaz bir pelet görünecektir. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve numuneyi eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Etiketli protein saflaştırma için. Tüm numuneleri, denge tamponu olarak nötravidin bağlayıcı tampon kullanarak serbest alkinin artıklarını temizlemek için gösterildiği gibi bir tampon değişim prosedürüne tabi tutun. Daha sonra nötravidin yüksek kapasiteli boncukları, boncukları bağlayıcı tamponla karıştırarak üç kez yıkayın.

Karışımı santrifüj edin, süpernatantı atın ve bunu üç kez tekrarlayın. Daha sonra aynı miktarda nötravidin kuru boncuk ve nötravidin bağlayıcı tampon ekleyerek bire bir bulamaç hazırlayın. Her numunenin 20 ila 40 mikrolitresini önceden saflaştırılmış lizat olarak bir kenara koyun ve eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Numunenin protein konsantrasyonunu ölçtükten sonra, 40 mikrolitre boncuk bulamacı ile bir miligram protein karıştırın. Karışımı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin ve etiketli proteinlerin boncuklara bağlanmasını sağlayan sürekli rotasyonla inkübe edin. Ertesi gün süpernatantı santrifüjleme ile toplayın.

Daha sonra analiz etmek için süpernatantın 20 ila 40 mikrolitrelik bir alikotunu bir kenara koyun ve geri kalanını eksi 80 santigrat derecede dondurun. Daha sonra, soğutulmuş nötravidin yıkama tamponu ekleyerek boncukları üç kez yıkayın. Boncukları tortulamak ve süpernatantı atmak.

Daha sonra aynı tamponu ekleyin ve süpernatanı atmadan önce boncukları dört santigrat derecede sürekli dönüş altında 10 dakika boyunca inkübe edin. Yıkamayı iki ve üç nötravidin yıkama tamponu ile tekrarlayın ve kullanılan kuru boncukların bir hacmine karşılık gelen bir miktar nötravidin elüsyon tamponu ile boncukları 20 santigrat derecede 30 dakika inkübe ederek tıklanan proteinleri süzün. Elüsyon sırasında, boncukları bir termo blok çalkalayıcıda dakikada 1000 devirde süspansiyonda tutun ve iki kez kaçın ve her iki elutu birleştirin.

Tıklama reaksiyonları SDS sayfası ve Western immün lekesi ile analiz edildi. Deneylerin temsili görüntüleri, intraperitoneal enjeksiyon ile azidonorlösin uygulaması ve içme suyu yoluyla azidonorlösin uygulaması için gösterilmiştir. Başka bir deney, optimal disülfür biyotin bölünebilir alkin konsantrasyonunun belirlenmesi için bir örnek sunmaktadır.

Bu örnekte, etiketli numune ile kontrol arasındaki kıvrım değişimi 14 Mikromolar alkin konsantrasyonunda en yüksektir. Kontrole kıyasla azidonorlösin etiketli numunede net bir zenginleştirme ile kütle spektrometresi sonucunun bir örneği burada gösterilmiştir. Bu fark toplam protein lekesinde zaten görülebiliyordu.

Peptit yoğunluğundaki değişikliklerin yanı sıra, her iki örnekte de bulunan benzersiz proteinler vardır. Bu teknik olarak karmaşık bir protokoldür ve uygun negatif kontroller alkilasyon, uygun (belirsiz) ve tıklama dışı arşivin yeterli temizliği kullanılarak dikkatle izlenmesi gereken bir adımdır. Bu protokoldeki temel adımlarımız, saflaştırılmış proteinler, araştırmacıların ilgisini çeken proteinleri incelemek veya batı lekesi ile ilgilenilen proteinleri incelemek için bir jele yüklemek ise, kütle spektrometresi ile tanımlanabilir.

Bu yöntemin proteinleri belirli bir hücresel kökenden etiketleme yeteneği, proteinlerin gerginliği veya in vitro veya in vivo protein sentezinin incelenmesi gibi birçok uygulamaya sahiptir.