Name: Caenorhabditis elegans Genomik DNAsının Küçük Ölçekli Ekstraksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans genomik DNA'sını hızlı ve ekonomik bir şekilde izole etme yöntemini. Bu protokol, PCR uygulamaları için güvenilir şablonlar üretir ve sınıf ile araştırma ortamlarında kullanıma uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

N2 suşu ve E. coli OP50 bakterileri, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden (CGC) elde edildi. Blmp-1 (tm548) suşu Japonya Ulusal Biyokaynak Projesi'nden elde edildi. Yazarlar WormBase'e teşekkür ediyor. Bu çalışma NIH R01GM097591 tarafından T.L.G.'ye, Texas Woman's University tarafından T.L.G.'ye ve TWU'nun Öğrenci Araştırma Merkezi'nin M.F.L.'ye sağladığı iç finansman tarafından desteklenmiştir.

1. C. elegans bakımı
NOT: N2 (vahşi tip) ve blmp-1 (tm548) C. elegans suşları standart nematod büyüme ortamı (NGM) plakaları üzerinde 20 °C'de tutulmuştur.
<ol><li>23.005 g NGM tozunu 973 mL su içinde 2 L'lik bir şişede çözerek NGM plakalarını hazırlayın. Şişe açıklığını alüminyum folyo (veya havalandırmaya izin veren otoklavlanabilir kapak) ile örtün ve kaplamayı otoklav bantla sabitleyin. Tozu çözmek ve içeriği en az 30 dakikalık bir sterilizasyon döngüsü ile sterilize etmek için otoklav.</li>
	<li>Ortamı bir su banyosunda 60 ° C'ye soğutun.</li>
	<li>Soğutulmuş ortama 25 mL steril 1 M fosfat (KH2PO4) tamponu, pH 6.0 ekleyin; 1 mL 1 M kalsiyum klorür çözeltisi; ve 1 mL 1 M magnezyum sülfat çözeltisi.</li>
	<li>Homojen bir karışım elde etmek ve düzensiz soğutma ve katılaşma (~ 5 dakika) önlemek için ortamı manyetik bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın. Karıştırma çubuğunun bir vorteks oluşturacak kadar hızlı döndüğünden, ancak kabarcıkların ortaya çıkacağı kadar hızlı olmadığından emin olun (~ 250-300 rpm).</li>
	<li>Her 10 cm'lik Petri plakasına (toplamda ~ 40 plaka) ortamın ~25 mL'sini dökün. Plakaları gece boyunca oda sıcaklığında (tipik olarak 16-25 ° C) kurulayın.</li>
	<li>Bir Escherichia coli OP50 kolonisini 37 ° C'de gece boyunca 30-50 mL LB suyunda büyütün.</li>
	<li>Her plakayı 500 μL E. coli OP50 kültürü ile tohumlayın ve kullanmadan önce oda sıcaklığında kurumasını bekleyin (tipik olarak 16-25 ° C)8. Plakaları 4 ° C'de 3 haftaya kadar saklayın.</li>
	<li>C. elegans'ı bir tel toplama veya başka bir yöntem kullanarak tohumlanmış plakalara aktarın ve suş için gereken sıcaklıkta L4 veya yetişkin aşamasına büyümelerine izin verin (tipik olarak 16-25 ° C, hayvanlar dauer olarak aç bırakılmışsa 1-2 gün, hayvanlar embriyo olarak kaplanmışsa 3-4 gün)8.</li>
</ol>2. Tek solucanlı DNA ekstraksiyonu
NOT: Bu yöntem, DNA'yı tek bir solucandan (toplam hacmin 1,8 μL'sinde bir solucan) çıkarmak için kullanışlıdır. Aynı anda birden fazla solucan lize edilecekse bir ana karışım yapılabilir.
<ol><li>Bir termosikler, 10 dakika boyunca 55 ° C'de bir döngü için programlayın, ardından 3 dakika boyunca 95 ° C (lizis programı).</li>
	<li>Aliquot 0.8 μL ekstraksiyon çözeltisinin kitinden buz üzerindeki 0.2 mL'lik bir PCR tüpünün iç duvarına kadar. Kitten ekstraksiyon çözeltisinin damlacığına 0.2 μL doku hazırlama çözeltisi ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskobu altında bir L4 veya yetişkin hayvanı tanımlayın9. L4 hermafroditlerini tanımlamak için, hayvanın ortasında soluk bir yarım daire olarak görülebilen karakteristik bir vulva arayın. Yetişkin hermafroditleri, uteruslarında görülebilen oval embriyolara sahip olabilecek plakadaki en büyük hayvanları arayarak tanımlayın.</li>
	<li>Bir platin tel çekme kullanarak, seçilen hayvanı çözelti10'a aktarın.</li>
	<li>Borunun altındaki içeriği toplamak için tüpü oda sıcaklığında kısaca (2-3 sn, ≤6.000 rpm / 2.000 × g) santrifüj yapın.</li>
	<li>Tüpü termosikler içine yerleştirin ve Adım 2.1'de ayarlanmış lizis programını çalıştırın.</li>
	<li>Program tamamlandığında, tüpü kısaca santrifüj edin ve buzun üzerine yerleştirin. Kitten karışıma nötralizasyon çözeltisinin 0.8 μL'sini ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.</li>
	<li>Tüpü oda sıcaklığında kısa bir süre santrifüj yapın (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).</li>
	<li>Lisatı PCR için doğrudan kullanın veya ileride kullanmak üzere 4 °C veya -20 °C'de saklayın. NOT: Ekstrakte edilen DNA, en az 6 ay boyunca 4 °C veya -20 °C'de stabildir7.</li>
</ol>3. Birkaç kişinin DNA ekstraksiyonu
NOT: Bu yöntem, birkaç solucandan DNA çıkarmak için kullanışlıdır. Aynı anda birden fazla suş lize edilecekse bir ana karışım hazırlanabilir.
<ol><li>Termosikler'i 10 dakika boyunca 55 ° C'de bir döngü için programlayın, ardından 3 dakika boyunca 95 ° C (lizis programı).</li>
	<li>Aliquot 2.0 μL ekstraksiyon çözeltisinin kitinden buz üzerindeki 0.2 mL'lik bir PCR tüpünün iç duvarına kadar. Kitten ekstraksiyon çözeltisinin damlacığına 0.5 μL doku hazırlama çözeltisi ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.</li>
	<li>L4 veya yetişkin hayvanları diseksiyon mikroskobu altında tanımlayın9. L4 hermafroditleri, hayvanın ortasında soluk bir yarım daire olarak görülebilen karakteristik bir vulvaya sahiptir. Yetişkin hermafroditler plakadaki en büyük hayvanlardır ve uteruslarında görülebilen oval embriyolara sahip olabilirler.</li>
	<li>Bir platin tel toplama kullanarak, birkaç hayvanı çözeltiye aktarın: 9 hayvan, 0.5 μL lizat başına 1 hayvan eşdeğeri genomik DNA verir ve 16 hayvan, 0.25 μL'de (3.5 nematod / μL) 10'da ~ 1 hayvan eşdeğeri genomik DNA verir. NOT: Bu hacme 16'dan fazla hayvan aktarmak zordur.</li>
	<li>Tüpü oda sıcaklığında kısa bir süre santrifüj yapın (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).</li>
	<li>Tüpü termosikler içine yerleştirin ve Adım 3.1'de ayarlanmış lizis programını çalıştırın.</li>
	<li>Program tamamlandığında, tüpü kısaca santrifüj edin ve buzun üzerine yerleştirin. Kitten karışıma nötralizasyon çözeltisinden 2 μL ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.</li>
	<li>Tüpü oda sıcaklığında kısa bir süre santrifüj yapın (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).</li>
	<li>PCR için lizizi doğrudan kullanın veya ileride kullanmak üzere 4 °C veya -20 °C'de saklayın. NOT: Ekstrakte edilen DNA, en az 6 ay boyunca 4 °C veya -20 °C'de stabildir7.</li>
</ol>4. PCR reaksiyonu
NOT: Bu solucan lizis tekniğinin, hızlı bir polimeraz kullanarak bir delesyon mutasyonunu tespit eden bir aşağı akış uygulaması açıklanmaktadır. İki solucan lizis protokolünün, reaksiyon başına bir solucanın 1 /50'sine kadar seyreltmelerde başarılı PCR için genomik şablon DNA üretmedeki etkinliği de gösterilmiştir.
<ol><li>Yukarıda Adım 2 ve Adım 3'te açıklandığı gibi, vahşi tip N2 ve mutant suşlar kullanarak tek bir solucandan ve 16 solucandan DNA çıkarın.</li>
	<li>Vahşi tip N2 hayvanlarından tek solucanlı DNA'nın 2, 10, 20 ve 50 kat seyreltilmesini hazırlayın.</li>
	<li>İlgilenilen sıraya özgü primerler ve hot-start PCR ana karışımı kullanarak üreticinin protokolünü izleyerek PCR reaksiyonlarını ayarlayın (Tablo 1 ve Tablo 2). Her reaksiyonda şablon olarak 1 μL seyreltilmemiş DNA veya 2 μL seyreltilmiş DNA kullanın.</li>
	<li>PCR ürünlerini jel elektroforezi ve görüntüleme11 ile onaylayın.</li>
</ol>

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+window+into+biology%3A+A+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).</li>
<li>Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+mapping+system+in+Caenorhabditis+elegans+based+on+polymorphic+sequence-tagged+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites.</a> Genetics. 131, 609-624 (1992).</li>
<li>Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Caenorhabditis+elegans+genomic+DNA+and+detection+of+deletions+in+the+unc-93+gene+using+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).</li>
<li>Fay, D., Bender, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNPs%3A+introduction+and+two-point+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">SNPs: introduction and two-point mapping.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).</li>
<li>Biron, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiron%2C+D+%22C.+elegans%3A+Methods+and+Applications%22">C. elegans: Methods and Applications</a>. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).</li>
<li>Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf</a> (2013).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , ed. The C. Elegans Research Community, Wormbook (2006).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152(2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293(2011).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923(2012).</li>
<li>Gumienny, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+SMA-10%2FLRIG+is+a+conserved+transmembrane+protein+that+enhances+bone+morphogenetic+protein+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling.</a> PLoS Genetics. 6, 1000963(2010).</li>
<li>Nelson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bow-tie+genetic+architecture+for+morphogenesis+suggested+by+a+genome-wide+RNAi+screen+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, 1002010(2011).</li>
<li>Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLMP-1+contributes+to+collagen-related+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans.</a> Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).</li>
<li>Horn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRE-1%2FFBXO11-dependent+degradation+of+BLMP-1%2FBLIMP-1+governs+C.+elegans+developmental+timing+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation.</a> Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).</li>
<li>Huang, T. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLMP-1%2FBlimp-1+regulates+the+spatiotemporal+cell+migration+pattern+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10, 1004428(2014).</li>
<li>Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interactions+between+the+DBL-1%2FBMP-like+pathway+and+dpy+body+size-associated+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).</li>
<li>Madeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EMBL-EBI+search+and+sequence+analysis+tools+APIs+in+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019.</a> Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

C. elegans'ın genotiplerini belirlemek, yeni C. elegans suşları oluşturmak için genetik haçlar gerçekleştirirken önemli bir adımdır. Tek veya birkaç C. elegans kullanılarak genomik DNA ekstraksiyonu, C. elegans'ın genotiplendirilmesinde çok önemli bir adımdır. Bu protokol, ticari bir kit kullanarak C. elegans'tan genomik DNA ekstraksiyonunu tanımlar. Bu yöntem hızlıdır ve sağlam çalışır. Bu yöntem kullanılarak ekstrakte edilen genomik DNA, genotipleme, dizileme ve klonlama da...

Burada, DNA'yı PCR tabanlı uygulamalar için erişilebilir kılmak amacıyla Caenorhabditis elegans'ın lizisi için iki ilgili protokol sunulmuştur. PCR, diğerlerinin yanı sıra klonlama ve dizileme için DNA fragmanlarının genotiplenmesi ve çoğaltılması da dahil olmak üzere birçok uygulama için kullanılan yaygın olarak kullanılan bir moleküler tekniktir. Küçük (1 mm), serbest yaşayan yuvarlak kurt C. elegans, biyolojik araştırmalar için popüler bir hayvan sistemidir. Tek bir hayvandan veya birkaç hayvandan uygun genomik DNA elde etmek, diziyi PCR ile yükseltmek için yeterlidir. Geç L4 larvaları ve yetişkinleri, utero 1'de sadece ~ 1.000 somatik hücre (bazı çoklu nükleer, poliploid hücreler dahil), germ hücreleri ve (hayvan gravid bir hermafrodit ise) yavru içerir. Bununla birlikte, bu hayvanlar genomik DNA2'yi çıkarmak için bozulması gereken bir kütikül ile korunmaktadır. PCR için nematod genomik DNA şablonu hazırlamak için standart yöntemler birden fazla adım içerir ve birkaç saat sürer. Hayvanlar ilk önce proteinaz K (-70 ° C veya altı) içeren solucan lizis tamponunda en az 15-45 dakika (bazı protokoller tarafından daha uzun süre tavsiye edilir) 3,4,5,6 dondurulur. Bu adım hayvanları açar.
Dondurulduktan sonra, proteinleraz K'nın çalışması için hayvanlar 60-65 ° C'de 1 saat inkübe edilir, daha sonra enzim 95 ° C'de 15-30 dakika boyunca inaktive edilir. Proteinaz K, DNA'yı bozan nükleazları yok eder. PCR'den önce proteinaz K'nın inaktivasyonu, proteinaz K'nın DNA polimerazı bozmasını önlemek için önemlidir. Burada açıklanan iki kit tabanlı protokol, günlük araştırma ve öğretim laboratuar uygulamaları için tek bir hayvandan veya birkaç nematoddan genomik DNA'yı çıkarmak için hızlı, güvenilir ve uygun maliyetli yöntemlerdir. Kullanılan kit başlangıçta üretici tarafından hayvan dokusundan, tükürükten ve saçtan DNA çıkarmak için optimize edildi7. Hücreleri lize etmek ve genomik DNA'yı erişilebilir kılmak için tescilli bir doku hazırlama çözeltisi ve ekstraksiyon çözeltisi kullanır. Tescilli bir nötralizasyon çözeltisi daha sonra PCR'yi inhibe edebilecek bileşenleri nötralize eder (örneğin, tuzlar, iyonlar ve Mg2 + bağlayıcı moleküller).
Genotipleme yaparken, tek bir hayvan test edilebilir. Bir suşun homozigot olup olmadığını belirlerken, tek bir hayvandan altı veya daha fazla yavruyu test etmek, bir çizginin homozigot olup olmadığına dair yüksek güven verir (heterozigot bir ebeveynden altı homozigot mutant soyunun rastgele seçilme şansı% 0.02'dir [(1/4)6 ×% 100 =% 0.02]). Bu yöntem 1) proteinaz K yönteminden daha az adımla basittir ve 2) şablon hazırlama süresini 15 dakikaya düşürür. Bu çalışmadaki sonuçlar, geliştirilen protokolün, PCR de dahil olmak üzere yüksek oranda saflaştırılmış DNA gerektirmeyen aşağı akış uygulamaları için güvenilir bir şekilde kullanılabilen tek veya birkaç solucandan genomik DNA'nın çıkarılmasında sağlam bir şekilde çalıştığını göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>otoklav bandı</td><td>Defend</td><td>43237-2</td><td></td></tr><tr><td>alüminyum folyo, ağır hizmet tipi</td><td>Reynolds Wrap</td><td>2182934</td><td></td></tr><tr><td>kalsiyum klorür</td><td>Millipore Sigma</td><td>102382 (CAS 10035-04-8)</td><td></td></tr><tr><td>Extract-N-Amp kiti (Doku Hazırlama Solüsyonu, Ekstraksiyon Solüsyonu ve Nötralizasyon Solüsyonu içerir)</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>LLC XNAT2-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp ocak gözü/karıştırıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-495H</td><td></td></tr><tr><td>LB ortamı, Lennox, kapsüller</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>3002-131</td><td></td></tr><tr><td>magnezyum sülfat, %97 saf, susuz</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC413485000 (CAS 7487-88-9)</td><td></td></tr> <tr><td>mikrosantrifüj</td><td>Labnet International, Inc.</td><td>PrismR, C2500-R</td><td></td></tr><tr><td>NEB Q5U Sıcak Başlangıç Yüksek Kaliteli DNA polimeraz</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>Ek Şekil S1'de kullanılan M0515S</td> <td>"Pol E", yüksek hızlı, yüksek kaliteli bir polimeraz (20&ndash; 30 s/kb)</td></tr><tr><td>NGM medya tozu</td><td>ABD Biyolojik Yaşam Bilimleri</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>Phusion HF Tamponlu Yüksek Kaliteli PCR Master Karışımı</td><td>New England Biolabs, Inc.</td>Şekil 1B'deki <td>M0531S</td> <td>"Pol D", yüksek hızlı, yüksek kaliteli bir polimeraz (15&ndash; 30 s/kb)</td></tr><tr><td>primerler</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>özel DNA oligoları</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL polimeraz</td><td>Takara Bio Inc.</td>Şekil 1B'deki <td>R050B</td> <td>"Pol C", GC açısından zengin şablonlar ve 30 kb'ye kadar şablonlar için yüksek kaliteli bir polimeraz (1 dk/kb)</td></tr><tr><td>Hızlı Yüklemeli Mor 2 günlük DNA Merdiveni (0.1&ndash; 10.0 kb)</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>N0550S</td><td></td></tr><tr><td>SapphireAmp Hızlı PCR Master Karışımı</td><td>Takara Bio Inc.</td>Şekil 1B'de <td>RR350A</td> <td>"Pol A", Şekil 1A, C, D'de kullanılan polimeraz, 5 kb'ye kadar hedefler için yüksek hızlı bir polimeraz (10 s/kb)</td></tr><tr><td>Sigma ReadyMix Taq PCR reaksiyon karışımı</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td> Şekil 1B'de <td>P4600</td> <td>"Pol B", 7 kb'ye kadar olan hedefler için bir polimeraz (1 dk/kb)</td></tr><tr><td>SimpliAmp termal döngüleyici</td><td>Applied Biosystems</td><td>A24812</td><td></td></tr><tr><td>karıştırma çubuğu</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-126</td><td></td></tr><tr><td>girdap karıştırıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>solucan toplama</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>59-AWP</td><td></td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans genomik dna'sının küçük Ölçekli ekstraksiyonu

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Tek veya birkaç Caenorhabditis elegans'tan genomik DNA ekstraksiyonu, genotipleme hatları, klonlama ve dizileme için PCR dahil olmak üzere birçok aşağı akış uygulamasına sahiptir. C. elegans'tan genomik DNA ekstraksiyonu için geleneksel proteinaz K bazlı yöntemler birkaç saat sürer. C. elegans kütikülünü etkili bir şekilde açan ve genomik DNA'yı çıkaran ticari ekstraksiyon kitleri sınırlıdır. Sınıf ve araştırma uygulamaları için iyi çalışan C. elegans genomik DNA'sını çıkarmak için kolay, daha hızlı (~ 15 dakika) ve uygun maliyetli bir yöntem burada bildirilmiştir. Bu DNA ekstraksiyon yöntemi, PCR gerçekleştirmek için güvenilir bir şablon elde etmek için başlangıç materyali olarak tek veya birkaç geç larva (L4) veya yetişkin nematodları kullanmak üzere optimize edilmiştir. Sonuçlar, DNA kalitesinin, farklı boyutlardaki gen hedeflerini PCR ile yükseltmek için uygun olduğunu ve reaksiyon başına tek bir yetişkinden genomik DNA'nın ellide birine kadar seyreltmelerde bile tek veya birkaç hayvanın genotiplenmesine izin verdiğini göstermektedir. Bildirilen protokoller, PCR tabanlı uygulamalar için tek veya küçük bir C. elegans örneğinden DNA şablonunu hızlı bir şekilde üretmek için güvenilir bir şekilde kullanılabilir.

Tek veya birkaç vahşi tip yetişkinden genomik DNA, bu iki yöntemin etkinliğini karşılaştırmak için ticari kit veya geleneksel lizis protokolü kullanılarak ekstrakte edildi. Bu lizatlar daha sonra PCR'nin ~ 2.100 bp'lik daha büyük bir hedefi (blmp-1'i kodlama) veya ~ 500 bp'lik daha küçük bir hedefi (sma-10'un bir bölümünü kodlama) yükseltmesi için şablonlar olarak kullanıldı. Her iki yöntem de uygun PCR ürünlerini başarıyla vermiştir (Şekil 1A).
...

Burada, Caenorhabditis elegans genomik DNA'sının ticari olarak temin edilebilen bir doku kiti kullanılarak bir veya birkaç hayvandan basit ve nispeten hızlı bir şekilde izole edilmesinin bir açıklaması sunulmaktadır. Elde edilen gDNA preparatı PCR için uygun bir şablondur.

Caenorhabditis elegans Genomik DNA'sının Küçük Ölçekli Ekstraksiyonu

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

Sınıf ve araştırma uygulamaları için harika çalışan C.elegans genomik DNA'sını çıkarmak için kolay, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem geliştirdik. Bu protokoller, PCR tabanlı uygulamalar için tek veya küçük bir C.elegance örneğinden DNA şablonlarını hızlı bir şekilde üretmek için güvenilir bir şekilde kullanılabilir. Solucan toplama veya mikropipetleyici kullanma deneyimi olmayan kullanıcılar, bu becerileri gerektiren adımlarla mücadele edebilir.Yetenekli bir uygulayıcıyı izlemek ve pratik yapmak yardımcı olabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan son sınıf öğrencisi olan Farhan Lakdawala olacak. Tek bir Caenorhabditis elegans solucanından DNA çıkarmak için, önce bir döngüden oluşan lizis programını 10 dakika boyunca 55 santigrat derecede, ardından bir termosiklusta üç dakika boyunca 95 santigrat derecede ayarlayın.Lizis çözeltisini hazırlamak için, önce kitten buz üzerindeki 0.2 mililitrelik bir PCR tüpünün iç duvarına 0.8 mikrolitre ekstraksiyon çözeltisi ekleyin. Daha sonra kitten ekstraksiyon çözeltisinin damlacığına 0.2 mikrolitre doku hazırlama çözeltisi ekleyin ve sevişerek karıştırın. DNA ekstraksiyonu için bir solucan seçimi ile, ilk olarak, diseksiyon mikroskobu alt

small-scale-extraction-of-caenorhabditis-elegans-genomic-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mikroarray analizi genetik ekspresyon profillerini belirlemek için...

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Bu videoda, PCR taraması ile tek bir nematodun genetik bir belirteç için hızlı bir şekilde taranması için kullanılan bir teknik açıklanmaktadır. Örnek protokolde, CRISPR tabanlı genom düzenlemeyi tarıyoruz.

Tek Solucan PCR: Genomik DNA'yı Çıkarmak ve Çoğaltmak için Bir Yöntem

Burada, varyasyon azaltmak, tekrarlanabilirlik geliştirmek ve yorumların kolaylaştırmak amacıyla bir protokol RNA, DNA ve protein aynı örnekten izolasyonu için mevcut.

Kombine nükleotit ve Caenorhabditis elegans Protein çekimi

Bu yöntem, Caenorhabditis elegans örneklerinden ve daha sonra eş-immünoselipitasyondan yüksek verimli protein özü hazırlanması için bir protokol açıklar.

Caenorhabditis elegans'tan Protein Özü Hazırlama ve Eş-immün premobpriktiasyon

Burada, larva evresi 4 C. eleganlardan aktif nükleer özü izole etmek ve transkripsiyon aktivitesini bir in vitro sistemde görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Aktif Caenorhabditis elegans'ın in vitro transkripsiyon için Nükleer Ekstrakt ve Rekonsitasyonu İzolasyonu

Bu protokol, kendi kendine Caenorhabditis nematodlarının büyük ölçekli ekolojik araştırmalarını gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu yöntemin birincil avantajı, doğadan toplanan nematodlarla ilişkili ekolojik ve moleküler verilerin verimli bir şekilde düzenlenmesi ve analiz edilmesidir.

Kendinden Çıkan Caenorhabditis Nematodlarının Ekolojik Araştırmalarını Gerçekleştirmek için Yüksek Oranda Ölçeklenebilir Bir Yaklaşım

RNA dizilimi için bireysel nematod dokularını izole etmek için lazer mikrodiseksiyonu kullanan bir protokol tanımlanmıştır. Protokol, türe özgü genetik araç setleri gerektirmez ve gen ekspresyon profillerinin tek doku örnekleri düzeyinde farklı türler arasında karşılaştırılmasına izin verir.

Türlerden Agnostik Tek Doku Uygulamaları için Lazer Mikrodiseksiyonu

Mevcut protokol, genomik, proteomik, mikrobiyom veya diğer tahlillere giriş için bağırsakları yetişkin Caenorhabditis elegans nematod solucanlarından elle izole etmek için bir prosedürü açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarının El Diseksiyonu

Caenorhabditis elegans , biyolojideki ana model türlerden biridir, ancak neredeyse tüm araştırmalar doğal olarak ilişkili mikroplarının yokluğunda gerçekleştirilir. Burada açıklanan yöntemler, gelecekteki fonksiyonel C. elegans araştırmalarının temeli olarak ilişkili mikropların çeşitliliği hakkındaki anlayışımızı geliştirmeye yardımcı olacaktır.

Model Nematod Caenorhabditis elegans'ın Doğal Mikrobiyotasının İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Kompost mikrokozmosları, Caenorhabditis elegans'ta mikrobiyom araştırmalarını kolaylaştırmak için doğada bulunan mikrobiyal çeşitliliği laboratuvara getirir. Burada, çevresel mikrobiyal çeşitlilik ile solucan bağırsak mikrobiyom bileşimi arasındaki ilişkileri keşfetmek için çevresel mikrobiyal çeşitliliği modüle etme yeteneğini gösteren deneylerle mikrokozmos deneyleri kurmak için protokoller verilmiştir.

Caenorhabditis elegans'ta Mikrobiyom Araştırmaları için Mikrobiyal Çeşitliliğe Sahip, Doğal Benzeri Ortamlar Olarak Kompost Mikrokozmoslar

Burada, sadece 30 μL solucan pelleti kullanılarak L4-aşama Caenorhabditis elegans tüm solucanında uygulanacak hızlı ve basit bir ATAC-seq protokolünü sunuyoruz.

Bütün Caenorhabditis elegans L4 larvalarda kromatin erişilebilirlik profili

Öğrenin, Caenorhabditis elegans genomik DNA'sını hızlı ve ekonomik bir şekilde izole etme yöntemini. Bu protokol, PCR uygulamaları için güvenilir şablonlar üretir ve sınıf ile araştırma ortamlarında kullanıma uygundur.

Caenorhabditis elegans Genomik DNA'sının Küçük Ölçekli Ekstraksiyonu

Daha fazla video keşfet