Name: İç Mitokondriyal Membranın Na+ ya Duyarlılığı Kısmen Segmente Edilmiş Fonksiyonel CoQ Havuzlarını Ortaya Çıkarır (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Keşfedin mitokondriyal membranlarda sodyum iyonlarının ubikinol havuzları üzerindeki etkisini basit bir spektrofotometrik yöntemle. Bu teknik elektron transfer mekanizmalarını ve kısmen segmente edilmiş fonksiyonel CoQ havuzlarını araştırmak için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik yardım için Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr. C. Jimenez ve E. R. Martínez-Jimenez'e teşekkür ederiz. Bu çalışma MICIN: RTI2018-099357-B-I00 ve HFSP (RGP0016/2018) tarafından desteklenmiştir. CNIC, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) ve Pro CNIC Vakfı tarafından desteklenmektedir ve bir Severo Ochoa Mükemmeliyet Merkezidir (SEV-2015-0505). Şekil 2, BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Tüm hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiş ve 22 Eylül 2010 tarihli Avrupa Birliği Direktifi (2010/63/UE) ve 1 Şubat 2013 tarihli İspanya Kraliyet Kararnamesi (53/2013) uyarınca İspanya'nın Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) kurumsal etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Kullanılan hayvan sayısını ve acılarını en aza indirmek için tüm çabalar gösterildi.
NOT: Mitokondriyal CoQ havuzlarının segmentasyonunu incelemek için yapılan bu karşılaştırmalı test aşağıdaki gibi açıklanmaktadır:
1. Protein niceliği
<ol><li>Organelleri reaksiyon substratlarına geçirgen hale getirmek için deneyden önce izole edilmiş mitokondri26'yı vahşi tip bir fare karaciğerinden üç kez (yani mitokondriyal membranlar) dondurun ve çözün.</li>
	<li>İzole edilmiş mitokondri örneğinin protein miktarını Bradford veya Bicinchoninic acid (BCA) yöntemleriyle sayısallaştırın. Bradford durumunda, 1 mL 1x Bradford reaktifine 2 μL numune ekleyin.</li>
	<li>Numuneyi her biri 20 μg'lık dört alt örneğe bölün (yani: A, B, C, D; Şekil 2A).</li>
</ol>2. CI+CIII aktivitesinin ölçülmesi
NOT: Protokolün bu bölümü, CI+CIII aktivitesini ölçmek için A ve B örneklerini kullanır (Şekil 2B).
<ol><li>A ve B örneklerini her biri 10 μg'lik iki alt örneğe bölün (yani A1, A2, B1 ve B2). Alt numunelerin her birini 1 mL'lik bir küvette 30 μL cyt c (10 mg / mL), 10 μL 100 mM malonat ile karıştırın ve 37 °C'de 980 μL'ye (A2 ve B2 küvetleri için 979 μL) kadar önceden ısıtılmış C1 / C2 tamponu (Tablo 1) ekleyin. DİKKAT: Bu adım, toksik reaktiflerin malonat ve potasyum siyanürün kullanımını içerir. NOT: cyt c (10 mg/mL), 10 mM K 2 HPO4 çözeltisinin 1 mL'sinde 10 mg cyt c karıştırılarak taze hazırlanmalı, pH7.2'yeayarlanmalı ve deney boyunca buzda tutulmalıdır.</li>
	<li>A1 ve A2 küvetlerine 10 μL 1 M KCl ekleyin ve B1 ve B2 küvetlerine 10 μL 1 M NaCl ekleyin.</li>
	<li>A2 ve B2 alt örneklerini içeren küvete 1 μL 1 mM rotenon ekleyin. DİKKAT: Bu adım toksik reaktif rotenonun kullanımını içerir.</li>
	<li>Ölçümden hemen önce, tüm küvetlere 10 μL NADH (10 mM) ekleyin. NOT: 10 μL tercihen küvetin basamağına eklenir, bu nedenle reaksiyon karıştırma üzerine başlar.</li>
	<li>Küveti dikkatlice üç kez çevirerek karıştırın. Emici küvet okuyucusuna (UV/VISJASCO spektrofotometre) yerleştirin.</li>
	<li>Genel > Parametreleri Ölç>e tıklayın ve ölçüm parametrelerini Dalga Boyu: 550 nm ve Zaman: 4 dakikalık okuma olarak ayarlayın; denemeyi başlatmak için Kabul Et ve Başlat düğmelerine basın.</li>
	<li>Ölçümün sonunda, Dosya ve Farklı Kaydet'e tıklayarak emilimin doğrusal artışını içeren eğimi kaydedin. Eğim manuel olarak da toplanabilir.</li>
</ol>3. CII + CIII aktivitesinin ölçülmesi
NOT: Protokolün bu bölümü, CII + CIII aktivitesini ölçmek için C ve D örneklerini kullanır (Şekil 2C).
<ol><li>C ve D örneklerini her biri 10 μg'lik iki alt örneğe bölün (yani C1, C2, D1 ve D2). Alt numunelerin her birini 1 mL'lik bir küvette 30 μL cyt c (10 mg / mL), 1 μL 1 mM rotenon ile karıştırın ve 37 ° C'de 980 μL'ye (C2 ve D2 küvetleri için 970 μL) önceden ısıtılmış C1 / C2 tamponu ekleyin. DİKKAT: Bu adım, toksik reaktifler potasyum siyanür ve rotenonun kullanımını içerir. NOT: cyt c (10 mg/mL), 10 mM K 2 HPO4 çözeltisinin 1 mL'sinde 10 mg cyt c karıştırılarak taze hazırlanmalı, pH7.2'yeayarlanmalı ve deney boyunca buzda tutulmalıdır.</li>
	<li>C1 ve C2 küvetlerine 10 μL 1 M KCl ekleyin ve D1 ve D2 küvetlerine 10 μL 1 M NaCl ekleyin.</li>
	<li>C2 ve D2 alt örneklerini içeren küvete 1 μL 1 mM antimisin A ekleyin. DİKKAT: Bu adım, toksik reaktif antimisin A'nın kullanımını içerir.</li>
	<li>Ölçümden hemen önce, tüm küvetlere 10 μL süksinat (1 M) ekleyin. NOT: 10 μL tercihen küvetin basamağına eklenir, bu nedenle reaksiyon karıştırma üzerine başlar.</li>
	<li>Küveti dikkatlice karıştırın, üç kez çevirin. Emici küvet okuyucusuna (UV/VIS spektrofotometre) yerleştirin.</li>
	<li>Genel > Parametreleri Ölç>e tıklayın ve ölçüm parametrelerini Dalga Boyu: 550 nm ve Zaman: 4 dakikalık okuma olarak ayarlayın; denemeyi başlatmak için Kabul Et ve Başlat düğmelerine basın.</li>
	<li>Ölçümün sonunda, Dosya ve Farklı Kaydet'e tıklayarak emilimin doğrusal artışını içeren eğimi kaydedin. Eğim manuel olarak da toplanabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Calvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mice%3A+SCAF1+relevance+and+segmentation+of+the+Qpool%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool.</a> Science Advances. 6 (26), (2020).</li>
<li>Garcia-Poyatos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaf1+promotes+respiratory+supercomplexes+and+metabolic+efficiency+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish.</a> EMBO Reports. 21 (7), 50287(2020).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+respiratory+Supercomplex+I%2BIII2+reveal+functional+and+conformational+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).</li>
<li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Jeon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+substrate+pool+revealed+by+cryo-EM+of+a+lipid-preserved+respiratory+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex.</a> Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+the+mammalian+respirasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The architecture of the mammalian respirasome.</a> Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).</li>
<li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The architecture of respiratory supercomplexes.</a> Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).</li>
<li>Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+asymmetry+and+electron+flow+in+the+bovine+respirasome%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome.</a> Elife. 5, 21290(2016).</li>
<li>Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+orchestrate+proteostatic+and+metabolic+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses.</a> EMBO Reports. 20 (10), 47865(2019).</li>
<li>Berndtsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+supercomplexes+enhance+electron+transport+by+decreasing+cytochrome+c+diffusion+distance%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51015(2020).</li>
<li>Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+partially+organized+in+a+supercomplex+assembly%3A+kinetic+evidence+using+flux+control+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).</li>
<li>Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+respiratory+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of respiratory complexes.</a> Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+the+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria.</a> Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).</li>
<li>Letts, J. A., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+the+supercomplex%3A+the+higher-order+organization+of+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).</li>
<li>Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigma+of+the+respiratory+chain+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The enigma of the respiratory chain supercomplex.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).</li>
<li>Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+and+kinetics+reveal+electron+transfer+by+2D+diffusion+of+cytochrome+c+in+the+yeast+III-IV+respiratory+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118(2021).</li>
<li>Szibor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+consequences+from+xenotopic+expression+of+a+tunicate+AOX+in+mouse+mitochondria%3A+Switch+from+RET+and+ROS+to+FET%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137(2020).</li>
<li>Guaras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CoQH2%2FCoQ+ratio+serves+as+a+sensor+of+respiratory+chain+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency.</a> Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).</li>
<li>Hernansanz-Agustin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28%2B%29+controls+hypoxic+signalling+by+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Enriquez, J. A., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+q+and+the+respiratory+chain%3A+coenzyme+q+pool+and+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Syndromology%22%5BJournal%5D)">Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).</li>
<li>Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+segmentation+of+CoQ+and+cyt+c+pools+by+respiratory+complex+superassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly.</a> Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>den Brave, F., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+formation+boosts+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Supercomplex formation boosts respiration.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51830(2020).</li>
<li>Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c%3A+Surfing+off+of+the+mitochondrial+membrane+on+the+tops+of+Complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).</li>
<li>Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+monovalent+cations+on+the+kinetics+of+hypoxic+conformational+change+of+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).</li>
<li>Acin-Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+measure+mitochondrial+respiration+in+frozen+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples.</a> The EMBO Journal. 39 (13), 104073(2020).</li>
<li>Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sodium+chloride+on+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of sodium chloride on a lipid bilayer.</a> Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).</li>
<li>Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ions+on+a+dipalmitoyl+phosphatidylcholine+bilayer.+a+molecular+dynamics+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu protokol, kısmen bölümlere ayrılmış CoQ havuzlarının varlığını tanımlamak için çok basit bir prosedürü temsil etse de, dikkate alınması gereken birkaç kritik adım vardır. Substratlar (yani, NADH veya süksinat), bu bileşiklerin otooksidasyonu meydana gelebileceğinden, tercihen en son eklenir. Cuvette'in çevirmesi, okumaya müdahale edebilecek kabarcıkların oluşumunu önlemek için dikkatli olmalıdır.
Ek olarak, mevcut teknik, bahsetmeye değer birkaç sınırlama sunmaktadır. Ölçümler sağlam mitoko...

Mitokondriyal oksidatif fosforilasyon sistemi (OXPHOS), adenozin trifosfat (ATP) sentezini, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini ve nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) veya süksinat gibi indirgeyici eşdeğerlerin mitokondri ile tüketimini yönlendiren ana yoldur. OXPHOS sistemi beş protein kompleksinden oluşur: Kompleks I (CI) NADH'yi oksitler ve CoQ'yu ubikinol (CoQH2) içine indirir. Kompleks II (CII), süksinatı fumarata oksitler ve CoQ'yu CoQH2'ye düşürür. Kompleks III (CIII), CoQH 2'yi tekrar CoQ'ya oksitleyerek sitokromc'yi (cyt c) azaltır. Son olarak, kompleks IV (CIV) cyt c'yi oksitler ve suya giden oksijeni azaltır. Elektron taşıma zinciri (mETC) olarak adlandırılan bu oksidoredüksiyon zinciri, adenozin difosfatı (ADP) ATP'ye fosforile etmek için kompleks V (CV) tarafından kullanılan bir elektrokimyasal gradyan oluşturan İBB boyunca H + 'nın pompalanmasıyla birleştirilir.
mETC kompleksleri İBB'de tek başına olabilir veya süperkompleksler adı verilen kuaterner yapılara toplanabilir. CIV CIV ile birleşerek III2+IV veya Q-solunum solunumu oluşturabilir (CoQH 2 varlığında yeniden canlanabildiği için)1,2,3 veya homodimerler veya homooligomerleroluşturabilir 4. CIII CI ile etkileşime girerek süperkompleks I+III2 5'i oluşturabilir. Son olarak, CI ayrıca Q-solunum ile etkileşime girebilir, I + III2 + IV veya N-solunum solunumu (NADH'yi tüketerek nefes alabildiği için) 1,6,7,8,9,10'u inşa edebilir.
CoQ ve cyt c, sırasıyla CI / CII'den CIII'ye ve CIII'den CIV'ye elektron aktarmaktan sorumlu mobil elektron taşıyıcılarıdır. Süper komplekslerin bu taşıyıcılar için işlevsel bir yerel kısıtlama getirip getirmediği, son yirmi yılda 2,7,11,12,13,14,15,16,17 tarihinde yoğun bir tartışma konusu olmuştur. Bununla birlikte, birkaç bağımsız grup, CoQ ve cyt c'nin İBB'deki havuzlara işlevsel olarak bölünebileceğini göstermiştir. CoQ ile ilgili olarak, işlevsel olarak CI için belirli bir CoQ havuzuna (CoQNAD) ve FAD'ye bağımlı enzimlere (CoQFAD) adanmış başka bir havuza ayrılabilir 1,7,12,18,19. Bununla birlikte, kısmen segmente edilmiş fonksiyonel CoQ havuzlarının varlığını ayırt etmek için, alternatif oksidazın (AOX) aşırı ekspresyonu ve CIII'nin yokluğunda CI'yi bir araya getirebilen spesifik mtDNA mutantlarının üretilmesi gerekiyordu 1,19,20.
Hipoksi sırasında reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretim mekanizması yakın zamana kadar bilinmiyordu. Akut hipoksi üzerine, CI, H + pompalama NADH-CoQ oksidoredüktaz aktivitesindeki azalmayı içeren aktif / deaktif (A / D) geçişine uğrar. H + pompalamadaki böyle bir azalma, mitokondriyal matrisi asitleştirir ve mitokondriyal matristeki kalsiyum-fosfat çökeltilerini kısmen çözer ve çözünür Ca2 + 'yı serbest bırakır. Çözünür Ca 2+'daki bu artış, Na+ karşılığında Ca 2+'yı ekstrüzyon yapan Na+/Ca 2+ eşanjörünü (NCLX) aktive eder. Mitokondriyal Na + artışı, İBB'nin iç tarafındaki fosfolipitlerle etkileşime girerek akışkanlığını ve CII ile CIII arasındaki CoQ transferini azaltır ve sonunda bir redoks sinyali21 olan süperoksit anyonu üretir. İlginç bir şekilde, CoQ transferi sadece CII ve CIII arasında azaldı, ancak CI ve CIII arasında değil, 1) Na + 'nın mitokondrideki mevcut CoQ havuzlarından sadece birini modüle edebildiğini; 2) İBB'de işlevsel olarak farklılaştırılmış CoQ havuzları var. Bu nedenle, mitokondriyal enzim aktivitelerinin incelenmesi için yaygın olarak kullanılan bir protokol, söz konusu CoQ havuzlarının varlığını değerlendirmek için kullanılabilir.
Mevcut protokol, CIII'in substratı olan oksitlenmiş cyt c'nin, süksinat (yani CII substratı) veya NADH (yani CI substratı) varlığında absorbans yoluyla indirgenmesinin ölçülmesine dayanmaktadır. Aynı numune, biri KCl ile, diğeri aynı NaCl konsantrasyonuna sahip olacak şekilde ikiye ayrılır. Bu şekilde, Na+'nın İBB akışkanlığını azalttığı göz önüne alındığında, CoQ İBB'de benzersiz bir havuzda var olsaydı, hem CI+CIII hem de CII+CIII Na+'nın varlığında azalırdı. Bununla birlikte, CoQ kısmen segmentlere ayrılmış fonksiyonel CoQ havuzlarında mevcut olsaydı, Na + 'nın etkisi çoğunlukla (veya sadece) CII + CIII aktivitesi üzerinde belirgin olurdu, ancak CI + CIII üzerinde belirgin olmazdı. Yakın zamanda yayınlanan21 gibi, Na+ sadece CII ve CIII arasındaki CoQ transferini etkiler (Şekil 1C,D), ancak CI ve CIII arasında etkilemez (Şekil 1A,B).
Bu protokol, bir dizi teknikle birlikte, İBB'de kısmen parçalanmış fonksiyonel CoQ havuzlarının varlığını doğrulamak için kullanılmıştır, biri CI'ye (yani, CoQNAD) ve diğeri FAD'ye bağlı enzimlere (yani, CoQFAD) adanmıştır 1,3,7; 22 tartışılmaya devam etmesine rağmen, birkaç grup tarafından bağımsız olarak doğrulanan bir gözlem 7,19. Bu nedenle, CI'nin süperkomplekslere üst montajı, CoQ'nun yerel hareketliliğini etkiler ve CIII tarafından 1,7,13,14,23,24,25 süperkompleksi içinde kullanımını kolaylaştırır.

<table><tbody><tr><td>Antimisin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Bradford protein tahlili</td><td>Bio-Rad</td><td>5000001</td><td></td></tr><tr><td>At kalbinden sitokrom c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Malonik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum siyanür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207810</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Manager yazılımı</td><td>JASCO</td><td>sürüm 2</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>UV/VISJASCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Succinate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398055</td><td></td></tr></tbody></table>

İç mitokondriyal membranın na+' ya duyarlılığı kısmen segmente edilmiş fonksiyonel coq havuzlarını ortaya Çıkarır

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

İç mitokondriyal membrandaki (IMM) ubikinon (CoQ) havuzları kısmen kompleks I veya FAD'ye bağımlı enzimlere bölünmüştür. Bu tür bir alt bölüm, sitokrom c (cyt c) indirgemesinin ölçüldüğü dondurulmuş çözülmüş mitokondride elektron donörü olarak NADH veya süksinat kullanılarak karşılaştırmalı bir tahlil ile kolayca değerlendirilebilir. Tahlil, Na+'nın İBB üzerindeki etkisine dayanıyor ve akışkanlığını azaltıyor. Burada, NaCl veya KCl varlığında NADH-cyt c oksidoredüktaz aktivitesini ve süksinat-cyt c oksidoredüktaz aktivitelerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bir küvetteki reaktiflerin karışımına kademeli olarak dayanan reaksiyonlar, Na + veya K + varlığında 4 dakika boyunca spektrofotometrik olarak ölçülür. Aynı karışım, absorbanstaki spesifik olmayan değişikliği çıkarmak için spesifik enzim inhibitörlerinin varlığında paralel olarak gerçekleştirilir. NADH-cyt c oksidoredüktaz aktivitesi bu katyonların hiçbirinin varlığında azalmaz. Bununla birlikte, süksinat-sit-c oksidoredüktaz aktivitesi NaCl varlığında azalır. Bu basit deney şunları vurgulamaktadır: 1) Na+'nın İBB akışkanlığını ve CoQ transferini azaltmadaki etkisi; 2) süperkompleks I+III2'nin ubikinon (CoQ) transferini İBB akışkanlığını düşürerek etkilenmekten koruduğunu; 3) CI ve CIII arasındaki CoQ transferinin işlevsel olarak CII ve CIII arasındaki CoQ transferinden farklı olması. Bu gerçekler, İBB'de işlevsel olarak farklılaşmış CoQ havuzlarının varlığını desteklemekte ve mitokondrinin değişen Na + ortamı tarafından düzenlenebileceğini göstermektedir.

Bu protokolden elde edilen tipik sonuçlar aşağıda gösterilmiştir (Şekil 3). Azalmış cyt c absorbansı 550 nm'de bulunduğundan, tüm inhibe edilmemiş alt numuneler 550 nm'de absorbansta bir artış göstermelidir. İnhibe edilmiş alt örnekler ideal olarak düz bir çizgi veya biraz artan bir eğim gösterir (Şekil 3). İnhibe edilmiş alt örneklerden eğimler, inhibe edilmemiş alt numunelerden çıkarılmalıdır.
Her ikisi de karşılık gelen inhibisyonl...

Bu protokol, kısmen segmente edilmiş fonksiyonel CoQ havuzlarının varlığını incelemek için Na + 'nın varlığında veya yokluğunda mitokondriyal karmaşık aktiviteler CI + CIII ve CII + CIII kullanan karşılaştırmalı bir tahlili tanımlar.

İç Mitokondriyal Membranın Na+' ya Duyarlılığı Kısmen Segmente Edilmiş Fonksiyonel CoQ Havuzlarını Ortaya Çıkarır

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

Bu protokol, sodyumun ikinci bir haberci olarak rolünü vurgular ve ayrıca kısmen farklılaşmış ubikinol havuzlarının varlığını gösterir. Bu teknik, aksi takdirde çok spesifik hücre modelleri gerektiren ubikinol havuzlarının incelenmesi için son derece basit bir yaklaşım göstermektedir. Bu yaklaşım, diğer membranlarda, özellikle lipit damlaları içindeki enzimlerde elektron transferinin incelenmesi için kullanılabilir.Numuneleri her biri 20 mikrogramlık dört alt örneğe bölün ve bunları A ila D.Split numuneleri A ve B'yi her biri 10 mikrogramlık iki alt örneğe bölün ve A1, A2, B1 ve B2 olarak etiketleyin. C1/C2 arabelleğini metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın ve 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Bir mililitrelik küvette, alt örneklerin her birini 30 mikrolitre sitokrom c ve 10 mikrolitre malonata ekleyin. A1 ve B1 küvetlerinde hacmi 980 mikrolitreye ve A2 ve B2'de 979 mikrolitreye çıkarmak için C1 / C2 tamponu ekleyin. A1 ve A2 küvetlerine 10 mikrolitre tek molar potasyum klorür ve B1 ve B2'ye 10 mikrolitre tek molar sodyum klorür ekleyin. A2 ve B2 küvetlerine bir mikrolitre bir milimolar rotenon ekleyin. Ölçümden hemen önce, tüm küvetlere 10 mikrolitre 10 milimola

inner-mitochondrial-membrane-sensitivity-to-na-reveals-partially

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Mitokondri izole fare kalbinde mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek açılması ölçümü için bir spektrofluorometrik protokolü sunulmuştur. Tahlil mitokondri Ca eşzamanlı ölçüm...

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

Bu protokol, fonksiyonel mitokondriyal elektron transport zincir komplekslerinin (Cx) IV ve bunların süper komplekslerinin yerli elektroforezi kullanarak, bunların montajı ve yapısı hakkında bilgi vermek üzere ayrılmasını açıklamaktadır. Nativ jel immünoblotlama, in-jel deneylerine tabi tutulabilir ve bireysel kompleksleri daha da karakterize etmek için elektroliz ile saflaştırılabilir.

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

Burada, iki protokol mitokondrial Ca2 + akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri ölçümü için mevcut. İzole mitokondri için biz bir plaka okuyucu tabanlı Ca2 + alma detaylı tahlil Ca2 + hassas kullanarak boya kalsiyum yeşil-5N. Kültürlü hücreler için Ca2 + boya Rhod-2/AM kullanarak bir confocal mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır.

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Burada, deterjanlara ve Coomassie Blue 'ya maruz kalmayı en aza indiren mitokondrial süperkompleksleri ayıklamak, çözmek ve tanımlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, çözünürlük ve enzim faaliyetlerinin korunması arasında optimum bir denge sunarken, labil protein-protein etkileşimlerini kaybetme riskini en aza indirir.

Mitokondriyal solunum zinciri Süperkompleksleri ayrımı ve analizi için hibrid Clear/mavi yerli Elektroforez

Son gelişmelere rağmen, birçok maya mitokondriyal protein hala işlevleri tamamen bilinmemektedir. Bu protokol, moleküler işlevlerinin aydınlatılması için temel olan proteinlerin boyunkondriyal lokalizasyonunu belirlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Bu yöntem, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin düşük iletkenlikli proton sızıntısına katkısından, vahşi tip kontrolüne kıyasla artmış kardiyomiyosit mitokondriyal koenzim Q içeriğine sahip yenidoğan kırılgan X sendromlu farelerde gözenek açılması için voltaj eşiğini belirlemek için kullanır.

Mitokondriyal Geçirgenlik Geçiş Gözünün Koenzim Q Fazlalığı Ortamında Açık Olasılığının Değerlendirilmesi

Bu protokol, bireysel iyon kanallarını izlemek ve desteklenen lipit membranlarındaki aktivitelerini belirlemek için TIRF mikroskopisinin nasıl kullanılacağını açıklar, böylece yanal membran hareketi ile kanal fonksiyonu arasındaki etkileşimi tanımlar. Membranların nasıl hazırlanacağını, verilerin nasıl kaydedileceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Mitokondriyal temas bölgeleri, mitokondriyal iç ve dış zar proteinleri ile etkileşime giren protein kompleksleridir. Bu bölgeler, mitokondriyal membranlar arasındaki ve dolayısıyla sitozol ile mitokondriyal matris arasındaki iletişim için gereklidir. Burada, bu spesifik protein sınıfına uygun adayları belirlemek için bir yöntem açıklıyoruz.

Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Bu protokol, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu kullanılarak mitokondriyal üst yapı görselleştirme ve analizi için kültürlenmiş SH-SY5Y hücrelerinin ve birincil sıçan hipokampal nöronlarının yayılması, farklılaşması ve boyanması için bir iş akışı sunar.

Nöronal Hücre Modellerinde Mitokondriyal İç Membran Üst Yapısını Görselleştirmek için Canlı Hücre STED Görüntülemenin Kullanılması

Hücre içi protein katlanması için doğal bir kalite kontrol mekanizmasına sahip olan Escherichia coli ikiz-arginin translokasyon yolunu kullanarak, bağlanma afinitesi ve sitoplazmik çözünürlük için bir antikor fragmanları kitaplığını aynı anda taramak için bir yöntem sunuyoruz, antikor fragmanlarını iç zarda görüntülemek için.

Antikor parçalarının bir kütüphanenin taranması için bakteriyel iç zar görüntü

Keşfedin mitokondriyal membranlarda sodyum iyonlarının ubikinol havuzları üzerindeki etkisini basit bir spektrofotometrik yöntemle. Bu teknik elektron transfer mekanizmalarını ve kısmen segmente edilmiş fonksiyonel CoQ havuzlarını araştırmak için değerli bir araç sunar.

İç Mitokondriyal Membranın Na^+' ya Duyarlılığı Kısmen Segmente Edilmiş Fonksiyonel CoQ Havuzlarını Ortaya Çıkarır

Daha fazla video keşfet