Name: Vakumla Stabilize Edilmiş Bir Görüntüleme Sistemi Kullanılarak Deneysel Akut Akciğer Hasarında Pulmoner Mikrosirkülasyonun İntravital Geniş Alan Floresan Mikroskopisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Keşfedin vakumla stabilize edilmiş intravital floresan mikroskopi yöntemiyle akut akciğer hasarında pulmoner mikrosirkülasyonu ve lökosit-endotel etkileşimlerini canlı olarak görüntülemeyi. Bu teknik yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu makalenin düzenlenmesi ve gözden geçirilmesinde önemli uzmanlık sağlayan Dr. Pina Colarusso'ya teşekkür eder.

Burada açıklanan tüm prosedürler, Dalhousie Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Komitesi (UCLA) tarafından önceden onaylanarak gerçekleştirilmiştir.
1. Hazırlık
<ol><li>Akciğer görüntüleme sistemi: Pencereyi hazırlamak için, vakum kanalının kirlenmesini önlerken dış halkanın üstüne ince bir vakum gresi tabakası uygulayın. Pencereye temiz bir 8 mm'lik cam kapak kayması yerleştirin ve bir conta oluşturmak için yavaşça aşağı bastırın.</li>
	<li>Geniş Alan Floresan Mikroskobu: 20x/0,40 uzun çalışma mesafesi hedefi ve 25 FPS kare hızına sahip siyah beyaz şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamera ile donatılmış geleneksel bir geniş alan floresan mikroskobu ile görüntüleme gerçekleştirin. Rhodamine-6G'yi uyarmak için 530-550 nm bandpass uyarma filtresi ve Floresein İzotiyosiyanat'ı (FITC) uyarmak için 460-490 nm bandpass filtresi uygulayın.</li>
	<li>Vakum sistemi: Görüntüleme penceresini, Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi 50-60 mmHg sabit emiş sağlayabilen dijital bir basınç göstergesi ile donatılmış bir vakum pompasına bağlayın. Kısacası, görüntüleme penceresini pompaya 1,0 mm I.D. polietilen boru, 1,0 cm I.D. polietilen boru, bir vakum şişesi ve bir sıralı 0,2 μm filtre ile bağlayın.</li>
	<li>Vantilatör: Farenin ağırlığına göre hesaplanan bir hızda ve hacimde basınç kontrollü ventilasyon sağlamak için küçük bir kemirgen vantilatör ayarlayın. Deney süresince 5 cmH2O'da pozitif bir ekspiratuar basınç (PEEP) sağlayın ve hedef basıncı 20 cmH2 O'yaayarlayın.</li>
	<li>Anestezik: Düşük akışlı bir anestezi dağıtım sistemi kullanarak,% 99.9 izofluran ile 5.0 mL'lik bir şırıngayı astarlayın. Cerrah tarafından solunma riskini en aza indirmek için bir atık gaz süpürme sistemi kullanın.</li>
</ol>2. Anestezi
<ol><li>20-25 g 12 haftalık erkek C57Bl/6 fareyi anestezi indüksiyon odasına yerleştirin. Oda güvenli bir şekilde kapalıyken,% 3'lük bir konsantrasyonda ve 500 mL / dak'lık bir akış hızında izofluran gazı ile indüksiyona başlayın.</li>
	<li>Fare anestezi altına alındıktan sonra (yavaşlamış solunum hızı ile görselleştirilir), entübasyon standına aktarın ve üst kesici dişleri asılı dikişe sabitleyin.</li>
	<li>Burnun burun konisinin içine sabitlenmesi için dikişi sıkın. Burun konisinden gaz akışına% 2.5'lik bir konsantrasyonda başlayın.</li>
	<li>Bir sonraki adıma geçmeden önce ayak parmağı sıkışması yoluyla yeterli anestezi derinliğini onaylayın.</li>
</ol>3. Entübasyon
<ol><li>Standı, standın arkası ve farenin sırt tarafı cerraha doğru bakacak şekilde döndürün.</li>
	<li>20 cm uzunluğundaki fiber optik kablonun ucunu 20 G endotrakeal kanülden geçirin ve kablonun larinksten geçişini kolaylaştırmak için ucu Lidokain HCl'ye (% 1) batırın.</li>
	<li>Künt forseps kullanarak, alt çeneyi kaldırın ve solunum sistemine net bir geçiş sağlamak için dili yerinden çıkarın.</li>
	<li>Üst kesici dişler spekulumdaki boşluğa sığacak şekilde modifiye edilmiş bir otoskop (~ 60 ° spekulum çevresi çıkarılmış) yerleştirin. Epiglottis ve ses telleri açıkça görülebilene kadar kapsamı ve dil pozisyonunu ayarlayın.</li>
	<li>Endotrakeal kanül yüklü fiber optik kabloyu spekulumdaki boşluktan ve gırtlak içine yerleştirin. Küçük dairesel hareketler kullanarak, kabloyu ses tellerinden ve trakeaya geçirin.</li>
	<li>Kanülü fiber optik kablo boyunca itin, ses telleri arasından ve trakeaya geçin.</li>
</ol>4. Havalandırma
<ol><li>Fareyi entübasyon standından alın ve sağ yanal dekübit pozisyonunda bir ısıtma yastığına yerleştirin.</li>
	<li>Kanülü ventilatör borusuna bağlayın ve ventilatörü başlatın. Anestezik konsantrasyonu% 1,5'e düşürün ve pedal refleksini test ederek derinliği izleyin. Refleks devam ederse, konsantrasyonu kademeli olarak% 2'ye kadar yükseltin.</li>
	<li>Kurumasını önlemek için farenin gözlerine gözyaşı jeli yerleştirin.</li>
	<li>Tıbbi bant kullanarak, kanülü burnuna sabitleyin. Etiketleme bandını kullanarak, sağ ön pençeyi yaklaşık olarak saat 9 konumunda ısıtma yastığına sabitleyin. Sol arka pençeyi kaudal olarak uzatın ve yaklaşık olarak saat 6 pozisyonunda sabitleyin.</li>
	<li>Bir bez bant kullanarak, sol ön pençeyi hafifçe saat 12 pozisyonuna kadar gerin ve bandın diğer ucunu Şekil 2A'da gösterildiği gibi IVM platformunun tepesine sabitleyin (burada hafif gerginliğin korunması müteakip torakotomiyi kolaylaştırır).</li>
	<li>Bir rektal sıcaklık probu takın ve probu ısıtma yastığına bantlayarak sabitleyin. Sağ arka pençeye bir nabız oksimetresi yerleştirin ve dolaşımı bozmamaya dikkat ederek ısıtma yastığına sabitleyin.</li>
	<li>Sıcaklık 37.0 ° C'de ± 0.1 ° C'de sabit kaldıktan sonra, torakotomi yapmaya devam edin.</li>
</ol>5. Torakotomi
<ol><li>Toraks ve karnını% 70 alkollü mendil ile sterilize edin. Farenin sol tarafındaki saçları nemlendirmek için hafif bir kat mineral yağ uygulayın - sternumdan vertebral kolona ve omuzdan göğüs kafesinin dibine kadar.</li>
	<li>Künt forseps ve düz makas ile, altta yatan kas tabakasını ortaya çıkarmak için göğüs kafesinin dibine yakın küçük bir uzunlamasına kesi yapın.</li>
	<li>Ventral hareket ederek, epitel ve yağ dokusunu kas tabakasından ayırmak için künt diseksiyon kullanın. Maruz kalan kan damarlarını koterize edin. Kan kaybı riski hafifletildikten sonra, orijinal insizyonu ksifoid sürece kadar ventralal olarak uzatın.</li>
	<li>Bu işlemi vertebral kolona ~ 5 mm lateral olana kadar dorsal olarak tekrarlayın.</li>
	<li>Kraniyal olarak hareket ederek, göğüs kafesini açığa çıkarmak için künt diseksiyon kullanın. Hemodinamik stabiliteyi korumak için maruz kalan kan damarlarını koterize edin.</li>
	<li>Kan kaybı riski hafifletildikten sonra, insizyonu ksifoid süreçten aksillaya kadar uzatın.</li>
	<li>Bu işlemi insizyonun dorsal tarafında, sol kulağa ~ 1 cm daha düşük olana kadar tekrarlayın.</li>
	<li>Hemostatik forseps kullanarak disseke edilmiş epitel ve yağ dokusunu kavrayın ve cerrahi alandan uzak tutun (Şekil 2B).</li>
	<li>Lökositlerin görselleştirilmesi için bir Rhodamine-6G (0.5 mg / mL; 1.5 mL / kg) ve kuyruk damarı yoluyla kılcal perfüzyonun görüntülenmesi için Sığır FITC-albümini (50 mg / mL; 1 mL / kg) enjekte edin.</li>
	<li>Dişli forseps kullanarak, kaburgayı son inspirasyonda akciğer tabanının konumundan hemen daha düşük bir seviyede tutun ve kaburgayı akciğerden uzaklaştırmak için hafifçe geri çekin. Bir pnömotoraksı indüklemek için kaburgayı kesin.</li>
	<li>İnsizyonu interkostal kas boyunca her iki yönde de yanal olarak uzatın, maruz kalan akciğer yüzeyine dokunmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Künt forseps kullanarak, bir sonraki en yüksek kaburgayı tutun ve akciğerin göğüs duvarından düşmesine izin vermek için hafifçe geri çekin. Akciğer ayrılmazsa, akciğerin altta yatan plevraya yapışmasına ve böylece daha kolay düşmesine neden olmak için göğüs duvarını akciğere hafifçe bastırın.</li>
	<li>Orijinal insizyona sternuma kadar ventral, akciğerin tepesi açığa çıkana kadar kraniyal olarak devam edin. Ortaya çıkan kanamayı hafifletmek için pamuklu aplikatörler ve gazlı bez kullanın.</li>
	<li>Göğüs boşluğunun dorsal kısmındaki interkostal kan damarlarını ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kaldırın. Akciğere zarar vermemeye dikkat ederek, omurgaya yakın en inferior interkostal damarı koterize edin ve ardından kaburgayı kesin. Kraniyal ve ventralal olarak hareket ederek, göğüs kafesinin yaklaşık 1 cm x 1,5 cm'lik bir kısmı eksize edilene kadar tekrarlayın (Şekil 2C).</li>
	<li>Küçük gazlı bez şeritleri kullanarak kılcal etki yoluyla göğüs boşluğundaki fazla sıvı birikimini giderin.</li>
	<li>Mikroskopiye devam ederken, akciğer ve görüntüleme penceresi arasında daha güvenli bir arayüz için intraplevral sıvının dağılması için ~ 5 dakika bekleyin.</li>
</ol>6. Mikroskopi
<ol><li>Vakum pompasını açın ve basıncı ~ 50–60 mmHg'ye ayarlayın.</li>
	<li>IVM platformunu mikroskop aşamasına aktarın. Metal direği ve mikromanipülatörü, görüntüleme penceresi doğrudan maruz kalan akciğerin üzerinde olacak ve pencere kolu akciğere yaklaşık olarak saat 3 konumundan yaklaşacak şekilde konumlandırın.</li>
	<li>Mikromanipülatörü kullanarak, görüntüleme penceresini akciğer yüzeyine yapışana ve stabilize edene kadar dikkatlice indirin (Şekil 3A).</li>
	<li>20x hedefini ve 460-490 nm bandpass uyarma filtresini kullanarak, kan akışının yakınsak modeline dayanan bir pulmoner venül tanımlayın. Gemiyi görüş alanında ortalayın ve 30 sn video kaydedin.<ol>
<li>530-550 nm bandpass uyarma filtresine geçin ve aynı görüş alanına 30 sn video kaydedin.</li>
		<li>Beş pulmoner venül görüntülenene kadar önceki adımı tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>460-490 nm bandpass uyarma filtresini kullanarak, farklı kan akışı modeline dayanan bir pulmoner arteriol tanımlayın. Gemiyi görüş alanında ortalayın ve 30 sn video kaydedin.<ol>
<li>530-550 nm bandpass uyarma filtresine geçin ve aynı görüş alanına 30 sn video kaydedin.</li>
		<li>Beş pulmoner arteriol görüntülenene kadar önceki adımı tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>460-490 nm bandpass uyarma filtresini kullanarak, daha büyük damarlarla kesişmeyen bir alveol ve kılcal damar bölgesi bulun ve 30 s video kaydedin.<ol>
<li>530-550 nm bandpass uyarma filtresine geçin ve aynı görüş alanına 30 sn video kaydedin.</li>
		<li>Beş kılcal bölge görüntülenene kadar önceki adımı tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Ötenazi ve temizlik protokolü
<ol><li>IVM platformunu mikroskop aşamasından çıkarın ve fareyi ötenazi yapmak için izofluran dağıtımını 5 dakika boyunca% 5'e ayarlayın.</li>
	<li>Beklerken kapak camını atın ve görüntüleme penceresini platformdan çıkarın. Görüntüleme penceresini küçük bir fırçayla temizleyin ve birkaç kez damıtılmış suyla yıkamak için kanala yerleştirilmiş 30 G'lık bir şırınga kullanın. Ardından, vakum pompasını kullanarak% 95 etanol ile yıkayın.</li>
	<li>5 dakika geçtikten sonra, ventilatörü durdurun ve servikal çıkık yoluyla tam ötenazi sağlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+pulmonary+immune+response+in+inflammation+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471(2021).</li>
<li>Gaertner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+interpretation+of+intravital+microscopy+images+in+studies+of+lung+tissue+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009(2015).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Looney, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).</li>
<li>Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+intravital+two-photon+excitation+microscopy+reveals+absence+of+pulmonary+vasoocclusion+in+unchallenged+sickle+cell+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice.</a> IntraVital. 3 (2), 29748(2014).</li>
<li>Blueschke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+measurement+of+microcirculatory+blood+flow+velocity+in+pulmonary+metastases+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630(2014).</li>
<li>Tabuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precapillary+oxygenation+contributes+relevantly+to+gas+exchange+in+the+intact+lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).</li>
<li>Rodriguez-Tirado, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+high-resolution+intravital+microscopy+in+the+lung+with+a+vacuum+stabilized+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603(2016).</li>
<li>Fiole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+intravital+imaging+of+lungs+during+anthrax+infection+reveals+long-lasting+macrophage-dendritic+cell+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts.</a> Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).</li>
<li>Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iNKT+cell+emigration+out+of+the+lung+vasculature+requires+neutrophils+and+monocyte-derived+dendritic+cells+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation.</a> Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).</li>
<li>Neupane, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patrolling+alveolar+macrophages+conceal+bacteria+from+the+immune+system+to+maintain+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis.</a> Cell. 183 (1), 110-125 (2020).</li>
<li>Tschernig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualisation+of+microparticles+in+the+living+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Direct visualisation of microparticles in the living lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).</li>
<li>Mertens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+dynamics+in+acute+lung+injury%3A+Heterogeneous+distension+rather+than+cyclic+opening+and+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse.</a> Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).</li>
<li>Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilation+and+perfusion+at+the+alveolar+level%3A+Insights+from+lung+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy.</a> Frontiers in Physiology. 11, 291(2020).</li>
<li>Margraf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6%25+Hydroxyethyl+starch+%28HES+130%2F0.4%29+diminishes+glycocalyx+degradation+and+decreases+vascular+permeability+during+systemic+and+pulmonary+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice.</a> Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).</li>
<li>Roller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo+observations+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1-mediated+leukocyte-endothelial+cell+interactions+in+the+pulmonary+microvasculature+in+abdominal+sepsis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice.</a> Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).</li>
<li>Marques, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+increases+endothelial+CXCL16-leukocyte+CXCR6+adhesion+in+vitro+and+in+vivo.+Potential+consequences+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1766(2017).</li>
<li>Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+an+erythrocyte+population+with+decreased+deformability+and+hemoglobin+content+following+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).</li>
<li>Trzeciak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+microcirculatory+perfusion+derangements+in+patients+with+severe+sepsis+and+septic+shock%3A+Relationship+to+hemodynamics%2C+oxygen+transport%2C+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Emergency+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival.</a> Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).</li>
<li>Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+intravital+imaging+of+leukocyte+migration+during+inflammation+in+the+respiratory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acute+and+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system.</a> Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li>
<li>Orthgiess, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+exhibit+Lyz2+promoter+activity+in+vivo%3A+Implications+for+using+LysM-Cre+mice+in+myeloid+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research.</a> European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).</li>
<li>Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+lung+injury%3A+A+clinical+and+molecular+review%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute lung injury: A clinical and molecular review.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).</li>
<li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786(2019).</li>
<li>Kim, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+tracheal+epithelial+cells+in+mice+during+airway+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).</li>
<li>Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopic+optical+coherence+tomography+imaging+to+assess+mucus-mobilizing+interventions+for+muco-obstructive+lung+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).</li>
<li>Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopic+observations+of+15-%C2%B5m+microspheres+lodging+in+the+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li>
<li>Amato, M. B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+protective-ventilation+strategy+on+mortality+in+the+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).</li>
<li>Looney, M. R., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the lung.</a> Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).</li>
</ol>

Dr. Kamala D. Patel, bu deneyde kullanılan görüntüleme penceresinin satın alındığı Luxidea'nın başkanı ve kurucu ortağıdır.

Burada sunulan protokol, birkaç kritik adıma pratik ve dikkat gerektirir. İlk olarak, entübasyon ve cerrahiye başlamadan önce görüntüleme penceresini hazırlamak önemlidir. Görüntüleme penceresinin dış halkasını kaplamak, kapak camını uygulamak ve bir damla damıtılmış su ile emiş testi yapmak için minimum miktarda vakum gresi kullanın. Bunu önceden hazırlamak, aksi takdirde kurulum sırasında maruz kalan akciğerin kurumasını önleyecektir. Sıcak salin ile yıkamak mümkün olsa da, bunu yapmak kırılgan akciğer dokusuna zarar v...

İntravital mikroskopi (IVM), çeşitli biyofiziksel süreçleri in vivo olarak görselleştirmek ve incelemek için yararlı bir görüntüleme aracıdır. Akciğer, kapalı konumu, dokusunun kırılgan doğası ve solunum ve kalp atışı 1,2 tarafından indüklenen hareket artefaktları nedeniyle in vivo olarak görüntülenmesi oldukça zordur. Bu zorlukların üstesinden gelmek için pulmoner mikrosirkülasyonda lökosit-endotel etkileşimlerinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için çeşitli intravital mikroskopi (IVM) kurulumları geliştirilmiştir. Bu tür yaklaşımlar, görüntüleme için akciğerin cerrahi olarak açığa çıkarılmasına ve stabilize edilmesine dayanır.
Hayvanlar tipik olarak cerrahi prosedürlerle akciğer IVM'si için hazırlanır. İlk olarak, hayvanlar entübe edilir ve havalandırılır, bu da torasik bir pencerenin cerrahi eksizyonuna ve daha sonra görüntüleme için akciğeri stabilize etmek için müdahalelere izin verir. Bir teknik, parankimin bir cam kapak kayması3'e yapıştırılmasını içerir; bu, görüntülenen dokuya önemli fiziksel travma riski taşıyan bir prosedürdür. Daha gelişmiş olanı, akciğeri cam bir pencere altında stabilize etmek için bir vakum sisteminin kullanılmasıdır4. Bu kurulum, geniş bir lokal alana yayılmış geri dönüşümlü bir vakum yoluyla akciğer yüzeyinin kapak kaymasına gevşek yapışmasını kolaylaştırır ve x, y ve z boyutlarında hareketi sınırlandırırken akciğeri genişletir4. Vakum, kurulumun görüntüleme alanını çevreleyen bir kanaldan eşit olarak uygulanır ve dokuyu görüntüleme sınıfı kapak kayması4'e bakan sığ bir konik bölgeye çeker. Bu görüntüleme penceresinden, akciğer mikrosirkülasyonu çeşitli optik görüntüleme yöntemleri kullanılarak incelenebilir.
Akciğer IVM, çok sayıda mikrodolaşım parametresinin kantitatif görüntülenmesini sağlar. Bunlar arasında lökosit iz hızı ve uzunluğu5, kırmızı kan hücresi akış hızı6 ve oksijenasyon7, tümör metastazları8, immün hücre alt popülasyonlarının ayrımı 9,10,11, mikropartiküllerin görselleştirilmesi 12, alveolar dinamikler 13,14, vasküler geçirgenlik 15 ve kılcal fonksiyon 16 gibi ölçümler bulunmaktadır. . Buradaki odak noktası lökosit alımı ve kılcal fonksiyondur. Pulmoner mikrosirkülasyonda lökosit alımının başlatılması, her ikisi de enflamatuar koşullar altında artmış olan lökositler ve endotel hücreleri arasındaki geçici yuvarlanma etkileşimlerini ve sıkı yapışkan etkileşimleri içerir16,17. Tipik olarak, haddeleme, operatör tarafından tanımlanan bir referans çizgisini geçen lökositlerin sayısı ile ölçülürken, adezyon endotel16 üzerinde hareketsiz olan lökositlerin sayısı ile ölçülür. Kılcal fonksiyon da enflamatuar durumlarda etkilenebilir ve sıklıkla perfüzyonun azalmasına neden olur. Bu, kırmızı kan hücresi deforme edilebilirliğinin azaltılması18 ve endotel hücreleri tarafından indüklenebilir NO sentazın alacalı ekspresyonu da dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlanabilir ve patolojik şant19 ile sonuçlanır. Tipik olarak, perfüze edilmiş kılcal damarların alan başına toplam uzunluğu ölçülür ve fonksiyonel kılcal yoğunluk (FCD) olarak rapor edilir.
Akciğerlerde lökosit alımını gerçek zamanlı olarak incelemek, biyolojik hedeflerin floresan boyalar veya floresan etiketli antikorlarla etiketlenmesini gerektirir20. Alternatif olarak, lizozim M-yeşil floresan protein (LysM-GFP) fareleri gibi çeşitli transgenik fare suşları, nötrofiller21,22 gibi spesifik bağışıklık hücresi alt kümelerini görüntülemek için kullanılabilir. Floresan etiketli lökositler daha sonra geniş alan floresan mikroskopisi, konfokal mikroskopi veya multifoton mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir. Bu teknikler, belirli uyarma dalga boylarını kullanarak ve yayılan floresanı tespit ederken, aynı zamanda uyarma dalga boyunun algılanmasını bloke ederek kontrast elde eder ve böylece etiketli nesneyi vurgular.
Murin akciğerinde lökosit haddeleme, adezyon ve fonksiyonel kılcal yoğunluğun miktarının belirlenmesi ile ilgili mevcut araştırmalar öncelikle manuel video analizine dayanmaktadır. Bu, Fiji 6,23 gibi açık kaynaklı yazılımlar, CapImage12 gibi özel mülk yazılımlar veya ısmarlama görüntü işleme sistemleri 24 aracılığıyla mümkün olmaktadır. Tersine, çeşitli özel mülk yazılım platformları (örneğin, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph), burada daha önce bahsedilenlerin birçoğu da dahil olmak üzere çok çeşitli diğer fizyolojik parametrelerin otomatik olarak ölçülmesini sağlar 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Akciğer IVM kullanılarak akut akciğer hasarı (ALI) ve akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) patolojisi ile ilgili önemli gözlemler yapılmıştır. ARDS, endotel ve epitel bariyerinin işlev bozukluğunun neden olduğu pulmoner ödem ve alveoler hasar dahil olmak üzere akciğerde bir dizi patofizyolojik süreç ile karakterizedir25. Bir murin modeli kullanılarak, sepsis kaynaklı ALI'nın akciğer ortamında immün hücre kaçakçılığında önemli zararlı değişikliklerle ilişkili olduğu bulunmuştur26. Sepsis kaynaklı ALI ile farelerin kılcal damarlarına alınan nötrofillerin mikrosirkülasyonu engellediği ve böylece ALI26'da hipoksiyi arttırdığı bulunmuştur. Ek olarak, IVM, ARDS27'nin başlangıcını takiben altta yatan onarım mekanizması hakkında fikir edinmek için kullanılmıştır. Akciğer IVM, çeşitli obstrüktif akciğer hastalıklarındaki patofizyolojik değişiklikleri anlamada da değerli bir araç olmuştur. Örneğin, kistik fibroz (KF) ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) gibi hastalıklarda mukus transportunun görselleştirilmesi, mukoza klerensi için yeni ve mevcut tedavilerin incelenmesini kolaylaştırmıştır28. Bu koşullar altında lökosit kaçakçılığı daanaliz edilmiştir 17.
Bu protokol, geleneksel floresan mikroskobu kullanarak lökosit-endotel etkileşimlerini incelemek için başlangıçta Lamm ve ark.29 tarafından tanımlanan yaklaşımı genişletmektedir. Tarif edilen prosedürler, 16.5 cm x 12.7 cm metal taban, mikromanipülatör ve vakum görüntüleme penceresi içeren bir in vivo akciğer görüntüleme sistemi kullanmaktadır (Şekil 1). Sistem, vantilatör borusu ve ısıtma yastığı için güvenli bağlantı sağlamak üzere 20 cm x 23,5 cm 3D baskılı bir platforma (Ek Dosya 1) monte edilmiştir. Bu yöntem, murin pulmoner mikrosirkülasyonun in vivo olarak tekrarlanabilir ve ölçülebilir görüntülenmesini sağlar. Cerrahi preparatın önemli yönleri ve vakumla stabilize edilmiş akciğer görüntüleme sisteminin doğru kullanımı ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Son olarak, değiştirilmiş lökosit haddeleme, lökosit yapışması ve inflamasyonla ilişkili kılcal perfüzyonun temsili görüntülemesini ve analizini sağlamak için deneysel bir ALI modeli kullanılmıştır. Bu protokolün kullanımı, akut hastalık durumları sırasında pulmoner mikrosirkülasyondaki patofizyolojik değişiklikler üzerine daha önemli araştırmaları kolaylaştırmalıdır.

<table><tbody><tr><td>1 mL BD Luer Slip Tip Şırınga steril, tek kullanımlık</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td>1 mL şırınga</td></tr><tr><td>ADSON Pansuman Forseps, Uç genişliği 0,6 mm, diş uzunluğu 11,5 mm, 12 cm</td><td>RWD Life Science Co.</td><td>F12002-12</td><td>Künt forseps</td></tr><tr><td>Albümin-Floresein İzotiyosiyanat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9771-1G</td><td>FITC-albümin</td></tr><tr><td>Alkol Çubuğu İzopropil Alkol %70 v/v</td><td>Kanada Özel Paketleme Şirketi</td><td>80002455</td><td>Alkollü mendil</td></tr><tr><td>AVDC110 Gelişmiş Dijital Video Dönüştürücü</td><td>Canopus</td><td>00631069602029</td><td>Dijital video dönüştürücü</td></tr><tr><td>S/B - CCD - Kamera</td><td>Kornası Görüntüleme</td><td>BC-71</td><td>Kamera</td></tr><tr><td>Bovie Deluxe Yüksek Sıcaklık Koter</td><td>Kiti Güzel Bilim Araçları</td><td>18010-00</td><td>Koterizatör</td></tr><tr><td>C57BL / 6 Fareler</td><td>Charles River Laboratories International</td><td>C57BL / 6NCrl</td><td>C57BL / 6</td></tr><tr><td>Fareler Pamuk Uçlu Aplikatörler</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td>Pamuk aplikatörü</td></tr><tr><td>CS-8R 8mm Yuvarlak Cam Lamel</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0701</td><td>Cam lamel</td></tr><tr><td>Dijital Basınç Göstergesi</td><td>ITM Instruments Inc.</td><td>DG2551L0NAM02L0IM& V</td><td>Dijital Basınç Göstergesi</td></tr><tr><td>Dr Mom Slimline Paslanmaz LED Otoskop</td><td>Dr. Anne Otoskopları</td><td>1001</td><td>Otoskop</td></tr><tr><td>Etil Alchohol %95 Hacim</td><td>Ticari Alkoller</td><td>P016EA95</td><td>%95 etanol</td></tr><tr><td>İnce Makas - Martensitik Paslanmaz Çelik</td><td>İnce Bilim Araçları</td><td>14094-11</td><td>Makas</td></tr><tr><td>Fisherbrand Renkli Etiketleme Bandı</td><td>Fisher Scientific</td><td>1590110</td><td>Etiketleme bandı</td></tr><tr><td>Gast DOA-P704-AA Yüksek Kapasiteli Vakum Pompası</td><td>Cole-Parmer Kanada Şirketi</td><td>ZA-07061-40</td><td>Vakum pompası</td></tr><tr><td>Hartman Kanama Durdurucular</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>13003-10</td><td>Hemostatik forseps</td></tr><tr><td>Yüksek Vakumlu Gres</td><td>Dow Corning</td><td>DC976VF</td><td>Vakumlu gres</td></tr><tr><td>İzofluran USP</td><td>Fresenius Kabi</td><td>CP0406V2</td><td>İzofluran</td></tr><tr><td>LIDOkain HCl Enjeksiyonu% 1 50 mg / 5 mL</td><td>Teligent Kanada</td><td>0121AD01</td><td>Lidokain HCl% 1</td></tr> <tr><td>Akciğer CerrahisiBoard</td><td>Luxidea, Inc.</td><td>IMCH-0001</td><td>Akciğerin intravital mikroskobu için tasarlanmıştır</td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Teva Kanada</td><td>00485802</td><td>Mineral yağ</td></tr><tr><td>Fare Endotrakeal Entübasyon Kiti</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>ETI-MSE</td><td>Entübasyon standı, anestezi maskesi, 20 G endotrakeal kanül, fiber optik kablo</td></tr><tr><td>MST49 Floresan Mikroskobu</td><td>Leica Microsystems</td><td>10 450 022</td><td>Floresan Mikroskobu</td></tr><tr><td>N Plan L 20x/0.40 Uzun Çalışma Mesafesi Mikroskobu Objektif</td><td>Leica Microsystems</td><td>566035</td><td>20x objektif</td></tr><tr><td>Dokumasız Süngerler 2" x 2"</td> <td>AMD-Ritmed</td><td>A2101-CH</td><td>Gazlı Bez</td></tr><tr><td>Optixcare Göz Yağı Plus</td><td>Aventix</td><td>5914322</td><td>Gözyaşı jeli</td></tr><tr><td>Orijinal Prusa i3 MK3S+ 3D Yazıcı</td><td>Prusa Research</td><td>PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI</td><td>3D yazıcı</td></tr><tr><td>Oksijen, Sıkıştırılmış</td><td>Linde Kanada A.Ş.</td><td></td><td>Oksijen</td></tr><tr><td>PrecisionGlide İğnesi 30 G x 1/2 (0,3 mm x 13 mm)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305106</td><td>30 G iğne</td></tr><tr><td>Pyrex 5340-2L 5340 Filtreleme Şişeleri, 2000 mL</td><td>Cole-Parmer Kanada Şirketi</td><td>5340-2L</td><td>Vakum şişesi</td></tr><tr><td>Rhodamine 6 G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252433</td><td>Rhodamine 6G</td></tr><tr><td>Güvenli Yumuşak Kumaş Tıbbi Bant - 3 "</td><td>Primed</td><td>PM5-630709</td><td>Bez bant</td></tr><tr><td>Silastik Tıbbi Sınıf Boru .040 inç. Kimlik x .085 inç. OD</td><td>Dow Corning</td><td>602-205</td><td>1.0 mm ID polietilen boru</td></tr><tr><td>Somnosuite Düşük Akışlı Anestezi Sistemi</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SS-01, SS-04 modülü</td><td>Küçük kemirgen ventilatörü, Düşük akışlı anestezi sistemi, Isıtma yastığı, Rektal sıcaklık probu, Nabız oksimetresi</td></tr><tr><td>Doku Forsepsleri, 12,5 cm uzunluğunda, Kavisli, 1 x 2 Diş</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>501216</td><td>Dişli forseps</td></tr><tr><td>Transpore Tıbbi Bant, 1527-1, 1 inç x 10 yd (2,5 cm x 9,1 m)</td><td>3M</td><td>7000002795</td><td>Tıbbi bant</td></tr><tr><td>Boru, Şeffaf, 3/8 inç İç Çap.</td><td>Grainger Canada</td><td>USSZUSA-HT3314</td><td>1.0 cm ID polietilen boru</td></tr><tr><td>Whatman 6720-5002 50 mm Sıralı Filtreler, PTFE, 0.2 ve mikro; m</td><td>Cole-Parmer Kanada Şirketi</td><td>6720-5002</td><td>Satır İçi 0.2 ve mikro; M filtresi</td></tr></tbody></table>

vakumla stabilize edilmiş bir görüntüleme sistemi kullanılarak deneysel akut akciğer hasarında pulmoner mikrosirkülasyonun İntravital geniş alan floresan mikroskopisi

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

Lökosit-endotel etkileşimlerinin intravital görüntülemesi, canlı hayvanlarda immün aracılı hastalık hakkında değerli bilgiler sunmaktadır. Akut akciğer hasarı (ALI)/akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) ve diğer solunum patolojilerinin in vivo olarak incelenmesi, akciğerlerin sınırlı erişilebilirliği ve doğal hareket artefaktları nedeniyle zordur. Bununla birlikte, bu zorlukların üstesinden gelmek için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bu protokol, deneysel bir ALI modelinde pulmoner mikrosirkülasyondaki gerçek zamanlı lökosit-endotel etkileşimlerini incelemek için intravital floresan mikroskopi için bir yöntemi açıklamaktadır. İn vivo akciğer görüntüleme sistemi ve 3 boyutlu baskılı intravital mikroskopi platformu, anestezi uygulanan fareyi sabitlemek ve akciğeri stabilize etmek ve kafa karıştırıcı akciğer hasarını en aza indirmek için kullanılır. Hazırlığı takiben, lökosit yapışması, lökosit haddeleme ve kılcal fonksiyonu incelemek için geniş alan floresan mikroskobu kullanılır. Burada sunulan protokol, enflamatuar akciğer hastalığının akut bir modelinde görüntülemeye odaklanırken, akciğerdeki diğer patolojik ve fizyolojik süreçleri incelemek için de uyarlanabilir.

Bu protokolle elde edilebilecek sonuçları göstermek için, akut akciğer hasarı (ALI), intranazal bakteriyel lipopolisakkarit (LPS) damlatma modeli kullanılarak görüntülemeden 6 saat önce indüklendi. Kısaca, fareler (n = 3) izofluran ile uyuşturuldu ve steril salin (10 mg / mL) içindeki Pseudomonas aeruginosa'dan küçük LPS damlacıkları sol narise 5 mg / kg'lık bir dozajda pipetlendi. Bu, naif farelerle karşılaştırıldı (n = 3; burun içi uygulama yok).
Görüntüleme üzerine, başarılı bir ce...

İntravital floresan mikroskopi, lökosit-endotel etkileşimlerini ve kılcal perfüzyonu gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılabilir. Bu protokol, vakumla stabilize edilmiş bir akciğer görüntüleme sistemi kullanarak pulmoner mikrosirkülasyondaki bu parametreleri görüntüleme ve ölçme yöntemlerini açıklar.

Vakumla Stabilize Edilmiş Bir Görüntüleme Sistemi Kullanılarak Deneysel Akut Akciğer Hasarında Pulmoner Mikrosirkülasyonun İntravital Geniş Alan Floresan Mikroskopisi

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

Bu protokol, pulmoner lökosit adezyonu ve kılcal perfüzyonu in vivo olarak görüntülemek için vakumla stabilize edilmiş bir sistemin cerrahi olarak hazırlanmasını ve kullanımını ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu tekniğin temel avantajı, minimal fiziksel travma ile sağlam aynalı akciğerin stabil yüksek çözünürlüklü intravital görüntülemesine izin vermesidir. Başlamak için, vakum kanalının kirlenmesini önlerken dış halkanın üstüne ince bir vakum gresi tabakası uygulayarak görüntüleme penceresini hazırlayın.Pencereye temiz bir 8 milimetrelik cam kapak kayması yerleştirin ve bir conta oluşturmak için yavaşça aşağı bastırın. Görüntüleme penceresini dijital basınç göstergesi ile donatılmış ve 50 ila 60 milimetre cıva sabit emme sağlayabilen bir vakum pompasına bağlayın. Bir uzunlukta fiber optik kabloyu 20 gauge endotrakeal kanülden geçirin ve ucu lidokain HCL'ye batırın.Anesteziden sonra, üst kesici dişler spekulumdaki boşluğa sığacak şekilde modifiye edilmiş bir otoskop yerleştirin. Epiglottis ve ses telleri açıkça görülebilene kadar kapsamı ve dil pozisyonunu ayarlayın. Fiber optik kabloyu spekulumdaki boşluktan yerleştirin ve kabloyu ses telleri arasında geçirmek için küçük dairesel hareketler kullanın, ardından fiber optik kabloyu bir kılavuz olarak kullanarak, fareyi entübe etmek için kanülü yavaşça trakeaya kaydırın.Ventilasyona% 1.5 izofluran ile başladıktan sonra, pedal refleksini test ederek anestezi derinliğini onaylayın. Kanülü tıbbi bantla burnuna sabitleyin. Sağ ön pençeyi saat dokuz konumundaki ısıtma yastığına sabitlemek için etiketleme bandı kullanın ve sol arka pençeyi kaudal olarak uzatın ve saat altı konumunda sabitleyin.Bir bez bant kullanarak, sol ön pençeyi hafifçe saat 12 pozisyonuna kadar gerin ve bandın diğer ucunu intravital mikroskopi platformunun tepesine sabitleyin, ardından deney boyunca hayati belirtileri izlemek için bir rektal sıcaklık probu ve pençe nabız oksimetresi uygulayın. Fareyi ameliyata hazırlamak için,% 70 alkollü mendille göğüs kafesini ve karnı sterilize edin ve farenin sol tarafındaki saçları nemlendirmek için hafif bir mineral yağ tabakası uygulayın. Altta yatan kas tabakasını açığa çıkarmak için göğüs kafesinin dibine yakın küçük bir kesi yapın, ardından ilk insizyonu uzatın ve göğüs kafesini açığa çıkarmak için künt diseksiyon kullanın.Hemostatik forseps kullanarak, disseke edilmiş epitel ve yağ dokusunu kavrayın ve cerrahi alandan temizleyin. Lökositleri ve kan akışını floresan olarak etiketlemek için, kuyruk damarı yoluyla kilogram bolus başına 2.5 mililitrelik bir Rhodamine 6G ve FITC-albümin uygulayın. Dişli forseps kullanarak, kaburgayı son ilhamda akciğer tabanının konumundan hemen daha düşük bir seviyede kavrayın.Kaburgayı akciğerden uzaklaştırmak için forsepsleri hafifçe geri çekin ve ardından bir pnömotoraksı indüklemek için kaburgayı kesin. Akciğere dokunmamaya dikkat ederek insizyonu her iki yönde de yanal olarak uzatın. Bir sonraki en yüksek kaburgayı künt forseps ile kavrayın ve akciğerin göğüs duvarından düşmesine izin vermek için hafifçe geri çekin.Akciğer ayrılmazsa, akciğerin altta yatan plevraya yapışmasına ve böylece daha kolay düşmesine neden olmak için göğüs duvarını akciğere hafifçe bastırın. Orijinal insizyona sonunda sternuma kadar ve akciğerin tepesi açığa çıkana kadar kraniyal olarak devam edin. Ortaya çıkan kanamayı hafifletmek için pamuklu aplikatörler ve gazlı bez kullanın.Göğüs boşluğunun dorsal kısmındaki interkostal kan damarlarını açığa çıkarmak için göğüs kafesini kaldırın, akciğere zarar vermemeye dikkat edin, omurganın yakınındaki en düşük interkostal damarı koterize edin, ardından bitişik kaburgayı kesin. Kraniyal olarak hareket etmek ve sonunda, göğüs kafesinin yaklaşık bir ila iki santimetrelik bir kısmını çıkarmak için tekrarlanan bir koterizasyon ve kesme paterni kullanın. Görüntülemeye hazırlanmak için, intravital mikroskopi platformunu mikroskop aşamasına aktarın ve görüntüleme penceresini doğrudan maruz kalan akciğerin üzerine yerleştirin.Akciğer yüzeyine yapışıp stabilize olana kadar görüntüleme penceresini dikkatlice indirmek için mikro manipülatörü kullanın. Pulmoner mikrosirkülasyonu görselleştirmek için, 20x objektif ve standart FITC ve Rhodamine filtre setleri ile donatılmış geniş bir alan floresan mikroskobu kullanın. Videoları optimum kontrastla kaydetmek için siyah beyaz bir CCD kamera kullanın.FITC filtre setini kullanarak, kan akışının yakınsak modeline dayalı bir pulmoner mekan tanımlayın ve mekanın odaklandığı 30 saniyelik bir video kaydedin, ardından lökositleri görselleştirmek için Rhodamine filtre setini kullanarak kaydı aynı görüş alanında tekrarlayın. Bir pulmoner arteri bulmak için, farklı bir kan akışı modeline sahip bir damarı tanımlamak ve 30 saniyelik bir video kaydetmek için FITC filtre setini kullanın. Lökositleri görselleştirmek için Rhodamine filtre setini kullanarak kaydı aynı görüş alanında tekrarlayın.İlgilenilen kılcal bölgeleri bulmak için, daha büyük damarlarla kesişmeyen bir alveol ve kılcal damar alanını tanımlamak ve 30 saniyelik bir video kaydetmek için FITC filtre setini kullanın. Lökositleri görselleştirmek için Rhodamine filtre setini kullanarak kaydı aynı görüş alanında tekrarlayın. Bu video, yeşil okla gösterildiği gibi bir pulmoner mekan içindeki kan akışının FITC görüntülemesini göstermektedir.Rhodamine görüntüleme, lökositlerin kırmızı oklarla gösterilen iki yapışkan lökosit ile aynı mekanda görselleştirilmesine izin verir. Bu yöntemler aynı fenomeni ve pulmoner arterleri ve ilgilenilen kılcal bölgeleri görselleştirmek için de uygulandı. Mikrodolaşım parametrelerinin miktarını göstermek için, fareler pulmoner inflamasyonu indüklemek için intranazal LPS ile tedavi edildi.Pulmoner lokallerde lökosit kaçakçılığı, naif ve LPS ile tedavi edilen farelerde analiz edilen endotel bölgelerini temsil eden ana hatlarıyla gösterilmiştir. LPS ile tedavi edilen farelerde lökosit yapışması ve yuvarlanması artmıştır. Pulmoner arteriyallerde lökosit kaçakçılığı, naif ve LPS ile tedavi edilen farelerde analiz edilen endotel bölgelerini temsil eden ana hatlarıyla gösterilmiştir.LPS ile tedavi edilen farelerde lökosit yapışması daha yüksekti. Bu şekil, naif ve LPS ile tedavi edilen farelerde pulmoner kılcal damarlar içinde lökosit yapışmasını göstermektedir. Lökosit yapışmasının LPS ile tedavi edilen farelerde naiflere göre daha yüksek olduğu gösterilmiştir.Bu şekil, naif ve LPS ile tedavi edilen farelerde pulmoner kılcal damarların perfüzyonunu göstermektedir. LPS ile tedavi edilen farelerde fonksiyonel kılcal yoğunluğun naiflere göre daha düşük olduğu gösterilmiştir. Bu protokolün birçok zorlu yönü var.Farenin platformdaki konumunu optimize etmek, cerrahi ve görüntüleme adımlarını çok daha tekrarlanabilir hale getirebilecek basit bir adımdır. Bu prosedür çok çeşitli çalışma parametrelerine ve mikroskopi yaklaşımlarına uyarlanabilir. Bu nedenle, hem sağlıklı hem de hastalıklı durumlarda pulmoner mikrosirkülasyonun daha fazla araştırılmasını kolaylaştırmalıdır.

intravital-widefield-fluorescence-microscopy-pulmonary

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, bir fare modelinde trombüs oluşumunu incelemek için intravital floresan mikroskobu tekniğini göstermektedir. Fareye, kan dolaşımını izlemek için florofor etiketli bir polisakkarit enjekte edilir. Yüksek yoğunluklu bir ışıkla aydınlatıldıktan sonra, kulağın mikro damar sistemindeki bir yaralanmanın fototoksik indüksiyonu, kan akışındaki tıkanıklığın görselleştirilmesiyle doğrulanan bir trombüs oluşumuna yol açar.

Mikrovasküler Trombüs oluşumunu incelemek için intravital floresan mikroskobu

İzole edilmiş perfüze akciğer kan hazırlama akciğer yüzeyindeki mikro damar ağları görselleştirmek için bu mümkün kılar. Burada, gerçek zamanlı flüoresan görüntüleme kullanılarak izole edilmiş akciğerlerde bir mikro damarların geçirgenliğini ölçmek için bir yaklaşımı tarif eder.

İzole Kan-perfüze Sıçan Akciğer Hazırlık Tek Mikrodamar Geçirgenliği miktarının

Sıçanlarda plevral yüzeyin akciğer kanseri metastazlarında mikrodolaşım kan akış hızını otomatik bir şekilde, kapalı göğüs pulmoner intravital mikroskopi kullanarak ölçmek için bir yöntem sunulmuştur. Bu model, kemirgenlerde pulmoner metastazlar üzerinde fizyolojik araştırmalar yapmak için yaygın bir araç olarak kullanılma potansiyeline sahiptir.

Sıçan Pulmoner METASTAZLARINDA Mikrosirkülasyonda Kan Akışı Hızının Otomatik Ölçüm

Farelerde floresan haberci kullanılarak, akciğer metastazı olan tümör hücre stromanın etkileşimleri ex vivo canlı görüntüleme için nispeten basit bir yöntem tarif eder. iplik disk konfokal mikroskopi kullanılarak, bu teknik, en az 4 saat boyunca canlı hücre görüntülenmesini sağlayarak ve diğer enflamatuar akciğer koşulları incelemek için adapte edilebilir.

Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo

Bu protokol, vakumla stabilize edilmiş bir görüntüleme penceresi kullanarak sağlam akciğerin gerçek zamanlı olarak uzun süreli yüksek çözünürlüklü, tek hücreli görüntülemesini gerçekleştirmek için çoklu foton mikroskobunun kullanımını açıklar.

Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi

Bu çalışmada, biz iki fotonlu intravital görüntüleme ve hücre etkileşim fare trakeal mukoza grip virüsü ile enfeksiyon sonra çözümlemesi için bir protokol mevcut. Bu iletişim kuralı bağışıklık hücre dynamics sırasında solunum yolu enfeksiyonları eğitim araştırmacılar için ilgili olacaktır.

İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi

Burada tanıtılan Protokolü içinde vivo inflamatuar koşullar altında birincil insan lenfosit akciğer izleme kapasitesini karakterizasyonu sağlar. Alerjik iltihap bir fare modeli adoptively transfer edilen insan bağışıklık hücrelerinin pulmoner infiltrasyon görüntüsü ve kimyasal olarak temizlenen Akciğer doku ışık sayfalık Floresans mikroskobu tarafından sayılabilir.

Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş

Lökosit ve trombositlerin işe alınması, arteriyogenez sırasında kollateral arterlerin etkili büyümesi için gerekli olan önemli bir bileşeni oluşturur. Multifoton mikroskopisi, arteriyogenez sırasında lökosit alımını ve ekstravazasyonunu incelemek için in vivo yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe ve daha az foto-toksisiteye sahip hücre dinamiklerini izlemek için etkili bir araçtır.

Bir Murin Arka Bacak Modelinde Arteriyogenez Sırasında Lökosit Alımını İzlemek için Multifoton İntravital Görüntüleme

Burada, nakledilen farenin sol akciğerini iki foton mikroskobu kullanarak intravitalal olarak görüntülemek için bir protokol sunuyoruz. Bu, murin akciğer naklini takiben hücresel dinamikleri ve etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek için değerli bir araçtır.

Nakledilen Fare Akciğerinin İntravital İki Foton Mikroskobu

Burada, zayıflatılmış BSL-2 onaylı Mycobacterium tuberculosis'un intravital görüntüleme protokolünü sunuyoruz. sürün akciğerinde kalıcı akciğer penceresi kullanarak. Bu yaklaşım, aynı akciğer mikro ortamında bakteriler lokalizasyonu, damar dinamikleri ve makrofaj alımı dahil olmak üzere erken konakçı-patojen etkileşimlerinin uzunlamasına, tek hücre çözünürlüklü analizini mümkün kılar.

Erken Intravasküler Enfeksiyonda Sönmüş Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Sönük Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Erken Intravasküler Enfeksiyonda

Keşfedin vakumla stabilize edilmiş intravital floresan mikroskopi yöntemiyle akut akciğer hasarında pulmoner mikrosirkülasyonu ve lökosit-endotel etkileşimlerini canlı olarak görüntülemeyi. Bu teknik yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

Vakumla Stabilize Edilmiş Bir Görüntüleme Sistemi Kullanılarak Deneysel Akut Akciğer Hasarında Pulmoner Mikrosirkülasyonun İntravital Geniş Alan Floresan Mikroskopisi (Video) | JoVE Journal

Vakumla Stabilize Edilmiş Bir Görüntüleme Sistemi Kullanılarak Deneysel Akut Akciğer Hasarında Pulmoner Mikrosirkülasyonun İntravital Geniş Alan Floresan Mikroskopisi

Daha fazla video keşfet