Tortricidae Zararlı Böceklerinde Kütle Yetiştirme ve Moleküler Çalışmalar

Biyolojilerini incelemek için ciddi haşere Tortrix kütlelerini kullanarak kitle yetiştirme, gözlemler ve moleküler çalışmalar için temel, ancak yüksek talep gören kütleler sunuyoruz. Şimdiye kadar, böcek yumurtalarının yapısı daha fazla analizi engelledi. Özellikle, maternal sekresyonla kaplı ince, yumuşak ve kırılgan yumurtaların incelenmesini sağladık.

Tortriks üzerinde daha fazla araştırma, diğer böcekleri ve diğer taksonları denemek için uygulanması beklenen basit teknikler vardır. Bir Matra hattı oluşturmak için bir kadın ve iki erkeği 120 mililitrelik plastik bir kaba bir parça parafin kağıdı ile yerleştirerek başlayın. Kütle yetiştiriciliği için bir Grater kullanarak yaklaşık 60 gram yapay diyet dilimleyin.

Olgunlaşmış embriyolarla dolu yumurta kütlesini dilimlenmiş yapay diyete plastik bir kapta yerleştirin. Parafin kağıtlarını dilimlenmiş diyetlerle yumurta kütlesine yerleştirin. 25 santigrat derecede çiftleşmek için 15 erkek ve 10 dişi plastik bir kutuya yerleştirin.

Her beş ila yedi günde bir yumurta toplayın ve her nesil için toplu yetiştirme adımlarını tekrarlayın. Yumurtaları ayırmak için yumurta kütlesini 10 dakika boyunca 1000 mikrolitre% 1.2 sodyum hipoklorit sulu çözeltiye veya 30 dakika boyunca 1000 mikrolitre beş molar potasyum hidroksit sulu çözeltisine batırın. Ayrılmış yumurtaları 1000 mikrolitre PBSt içinde yıkayın.

Yumurtaları, 500 mikrolitre% 100 heptan ve% 4 Paraformaldehit PBSt çözeltisinin 500 mikrolitrelik hacimsel karışımına batırın. Bir vorteks karıştırıcı kullanarak dakikada 1500 dönüşte 10 dakika karıştırın. Yumurtaları 500 mikrolitre% 100 heptan ve 500 mikrolitre% 100 metanol karışımına batırın.

Dakikada 1500 rotasyonda 10 dakika karıştırın. Yumurtaları 1000 mikrolitre% 100 metanol ile iki kez yıkayın ve% 100 metanol içinde dört santigrat derecede saklayın. Hidrofilizasyon için yumurtaları sırasıyla% 99% 70 ve% 50 etanol ve PBSt’ye her biri beş dakika bekletin.

Yumurtaları mililitre DAPI çözeltisi başına bir mikrograma beş dakika batırın ve ardından yumurtaları PBS ile iki kez yıkayın. Çekirdekler parlak kırmızı bir renk gösterene kadar heterokromatini görselleştirmek için yumurtaları% 1.25 laktik, asetik veya CN çözeltisinden oluşan 20 mikrolitreye batırın.

Vitray yumurtaları bir pipet kullanarak bir cam slayta aktarın, ardından bir solma önleyici reaktif ve bir kapak camı ile kapatın. Ferrat, Amonamagnetama ve Adoxophyes honmai larvalarını forseps kullanarak yumurta kütlelerinden çıkarın. Cam slayttaki larvaları disseke edin.

Dokuları, beş dakika boyunca% 100 metanol içinde% üç ila% 99.7 münzevi asit karışımı ile sabitleyin. Çekirdekler lekelenene kadar ağırlıkça% 1.25 ağırlık laktik, münzevi veya CN çözeltisi olanları lekeleyin. Mikroskop altında kadınlar için heterokromatin varlığını veya erkekler için yokluğu gözlemleyerek her bir örneğin cinsiyetini belirleyin.

DNA ve RNA’yı cinsiyet tarafından belirlenen Ferrat larvalarından çıkarmak için, 12 cinsiyet tarafından belirlenen erkek veya dişi ferrat larvalarını bir araya getirin ve 1.5 mililitrelik bir tüpe hücre lizis tamponu veya RNA ekstraksiyon reaktifleri ekleyin. Fiksasyon, Permeabilizasyon ve boyama adımları, çekirdeklerin DAPI çözeltisi ile görselleştirilmesini sağlar. Disseke Ferrat larvalarını kullanan laktik, münzevi veya CN boyaması, dişilerin bir nokta olarak heterokromatin sergilediğini, ancak erkeklerde heterokromatinden yoksun olduğunu ortaya koymuştur.

Bir spin sütunu kullanan modifiye protokoller, 260 ila 200 oranında 1.9 ila 2.1 ve 260 ila 280 oranında 1.9 ila 2.3 oranında 900 ila 1500 nanogram ürün üreten RNA’nın kalitesini artırdı. Modifiye protokol için RNA konsantrasyon oranı 1.2’nin altındaydı ve yeni nesil dizileme için kalite gereksinimlerini karşılıyordu. Modifiye protokol kullanılarak cinsiyetten ekstrakte edilen RNA’nın sağlamlığı, mikroçip elektroforezi kullanılarak Ferrat larvalarını belirledi.

Hazırlanan kütüphanelerin yüksek Q 30 puanı okumaları sağladığı doğrulandı. Mesajımız temel böcek çalışmalarına ve haşere araçlarına katkıda bulunur. Ayrıca, protokollerimiz embriyogenez sırasında etkili kimyasal pestisitleri veya hücreler arası mikropları değerlendirmek için kullanılma potansiyeline sahiptir.