Name: Hyaluronik Asit 35 kDanın Enteroid Kaynaklı Tek Katmanlı Erken İnce Bağırsak Hasarı ve İyileşmesinin In Vitro Modeline Etkisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Keşfedin enteroid kaynaklı tek katmanlı erken ince bağırsak hasarı ve iyileşmesinin in vitro modelinde hyaluronik asit 35 kDa'nın etkisini. Bu yöntem, preterm bağırsak rejenerasyonunu gerçek zamanlı görselleştirmeyle inceler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. HC, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden P20GM134973 hibesi ile desteklenmektedir. KB, Çocuk Hastanesi Vakfı (CHF) ve Presbiteryen Sağlık Vakfı (PHF) hibesi ile desteklenmektedir. Kanser Fonksiyonel Genomik çekirdeği tarafından sağlanan canlı hücre görüntüleme hizmetleri kısmen Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Stephenson Kanser Merkezi'ne verilen Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü Hibe P20GM103639 ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü Hibe P30CA225520 tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışmadaki tüm hayvan prosedürleri, Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Kurumsal onayı takiben, ayrı bir çalışma için ötenaziyi takiben, preterm insan dışı primattan (NHP,% 90 gebelik, zeytin babunu, Papio anubis) fetal ince bağırsak kolaylık örnekleri alındı (Protokol # 101523-16-039-I)20.
1. Preterm insan dışı primat 3D intestinal enteroidlerin kurulması
<ol><li>Medya hazırlama NOT: Medya, standart aseptik tekniği izleyerek kript izolasyonundan 1 hafta öncesine kadar hazırlanabilir. İstenirse primer hücreler için geniş spektrumlu antibiyotiklerin yerine penisilin/streptomisin (son konsantrasyon %1) kullanılabilir.<ol><li>50 mL organoid büyüme ortamı insan bazal ortamını 50 mL organoid takviyesi ile karıştırarak insan organoid büyüme ortamı + Y-27632 (HOGMY) hazırlayın (Malzeme Tablosu). Geniş spektrumlu antibiyotiklerin 200 μL'sini (son konsantrasyon 100 μg / mL) (Malzeme Tablosu) ve Y-27632'yi (10 μM'lik bir nihai konsantrasyona) ekleyin. Tezgahta oda sıcaklığına kadar ısıtın.</li>
		<li>50 mL organoid büyüme ortamı insan bazal ortamını 50 mL organoid takviyesi ile karıştırarak insan organoid büyüme ortamını (HOGM) hazırlayın. Geniş spektrumlu antibiyotiklerden 200 μL (100 μg / mL) ekleyin. Tezgahta oda sıcaklığına kadar ısıtın. NOT: HOGM, geçişten sonraki ilk 2-3 günden sonraki ortam değiştirilirken kullanılacaktır.</li>
		<li>100 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) buz gibi soğuyana kadar kalsiyum veya magnezyum olmadan soğutun.</li>
		<li>Kalsiyum veya magnezyum içermeyen 1x PBS'yi% 0.1 sığır serum albümini (BSA) ile birleştirerek 50 mL yıkama tamponu hazırlayın. Buz soğuyuncaya kadar soğutun.</li>
		<li>DMEM-F12 yıkama tamponunu, 500 mL DMEM / F12'ye (Dulbecco'nun Modifiye Kartalın Orta / Besin Ham Karışımı F12 + 15 mM HEPES tamponu) 1 mL geniş spektrumlu antibiyotik (100 μg / mL) ekleyerek hazırlayın. Buz gibi soğuk tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Kript izolasyonu ve kaplaması NOT: Hücre dışı matriks (ECM) bazlı hidrojel, tüm prosedür boyunca buz üzerinde kalmalıdır. Bu prosedür, altı ECM bazlı hidrojel kubbeyi doldurmak için yeterli doku varsayar. Farklı bir kript yoğunluğu toplanırsa, kubbe numarası buna göre değiştirilmelidir.<ol><li>150 μL büyüme faktörü azaltılmış (GFR) bazal membran ekstraktı (BME) (fenol kırmızısız) 2-8 ° C'de buz üzerinde gece boyunca çözülür.</li>
		<li>24 kuyulu, düz tabanlı, doku kültürü ile muamele edilmiş bir polistiren plakayı bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de kullanımdan önce en az 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>NHP ötenazi ve doku toplamayı takiben, tek kullanımlık bir Petri kabında buz gibi soğuk 1x PBS kullanarak enkazın ileum segmentini 1.000 μL pipet ucu ile yıkayın. NOT: Sağlıklı enteroidleri hasat etmek için taze doku hızlı bir şekilde toplanmalı ve buz gibi soğuk tutulmalıdır.</li>
		<li>İleomu tüm bağırsak boyunca uzunlamasına kesin ve buz gibi soğuk PBS 3x ile yıkayın. Dokuyu, ileal segmentin tüpe en yakın kısmından başlayarak, 15 mL buz gibi soğuk PBS içeren 50 mL konik bir tüp üzerinde steril makasla küçük parçalar halinde (yaklaşık 2 mm uzunluğunda) kesin.</li>
		<li>5-10x yukarı ve aşağı pipet yaparak kriptleri bozmak için 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanın. Doku segmentlerinin tüpün dibine yerleşmesine izin verin, ardından süpernatantı çıkarın ve taze, buz gibi soğuk PBS ile değiştirin. Süpernatant temizlenene ve döküntülerden arındırılana kadar bu işlemi en az 7x-10x tekrarlayın.</li>
		<li>Temizlendikten sonra, süpernatantı çıkarın ve kriptleri 25 mL hücre ayrışma reaktifinde yeniden askıya alın. Tüpü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 20 rpm'de sallanan bir platforma yerleştirin.</li>
		<li>Tüpü rocker'dan çıkarın, hücrelerin yaklaşık 30 s ila 1 dakika boyunca yerleşmesine izin verin ve süpernatanı çıkarın. 10 mL buz gibi soğuk yıkama tamponu ekleyin. Pipetleri p1000 pipetle yukarı ve aşağı indirerek tek kriptlerde daha fazla ayrışın.</li>
		<li>Dokuyu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden yeni bir 50 mL konik tüpe filtreleyin. Orijinal 50 mL konik tüpü 10 mL buz gibi soğuk yıkama tamponu ile durulayın ve tüm kriptlerin orijinal tüpten çıkarıldığından emin olmak için 70 μm süzgeçten süzün. Bu doku yıkamasını toplam 4x durulama için tekrarlayın.</li>
		<li>Filtratı 300 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. 600 μL HOGMY ekleyin ve 200 μL'lik bir pipetle yukarı ve aşağı pipetle pipetle peleti bozun. Çözelti buz gibi soğuyana kadar tüpü buz üzerine yerleştirin. NOT: Çözelti buz gibi soğuk değilse, kubbe kaplandığında uygun yapıyı korumaz. ECM bazlı hidrojel kubbeleri pipetlerken kabarcıklar sokmaktan kaçının, çünkü kabarcıklar plaka tabanına düzgün yapışmayı önleyecektir.</li>
		<li>Hücre peletini askıya almak için 600 μL buz gibi soğuk ECM bazlı hidrojel ekleyin ve 200 μL'lik bir pipetle iyice karıştırın.</li>
		<li>24 delikli plakayı inkübatörden çıkarın ve 37 ° C'lik bir plaka ısıtıcısına yerleştirin. Pipet, 24 kuyucuklu bir kültür plakasının 24 kuyucuğunun ortasına 50 μL buz gibi soğuk HOGMY / ECM bazlı hidrojel karışımı (kubbe başına 50 μL).</li>
		<li>Kaplandıktan sonra, plakanın dibine yapışmasını sağlamak için kubbelerin 37 ° C'lik bir plaka ısıtıcısına 1 dakika boyunca oturmasına izin verin. Plakayı dikkatlice ters çevirin, plakanın dibinde yoğuşma birikmediğinden emin olun ve ters çevrilmiş plakayı inkübatöre 37 ° C ve% 5 CO2'ye yerleştirin.</li>
		<li>15 dakika sonra plakayı sağdan yukarı doğru çevirin ve 750 μL oda sıcaklığında HOGMY pipetini her bir kuyucuğa yerleştirin. NOT: Pipet ortamını yavaşça kuyucukların yan duvarına yerleştirin ve yeni oluşan 3D ECM bazlı hidrojel kubbeyi bozmamaya dikkat edin.</li>
		<li>Tüm kuyucuklar medya ile doldurulduktan sonra, plakayı inkübatöre yerleştirin ve medyayı her 3 günde bir 750 μL HOGM ile değiştirin. Pasaj enteroidleri her 7-10 günde bir.</li>
	</ol></li>
	<li>Bağırsak enteroid pasajı NOT: Aşağıdaki protokol, NHP enteroidlerini 1: 2 bölünmüş hızda içeren bir 24 delikli kültür plakası içindir.<ol><li>Enteroid içeren ECM kubbesini bozmamaya dikkat ederek enteroid medyayı her bir kuyucuktan çıkarın, 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak her bir kuyucuğa 500 μL buz gibi soğuk hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve 1 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.</li>
		<li>8-12x yukarı ve aşağı pipet yaparak ECM'yi manuel olarak bozun. 12 kuyucuğun içeriğini 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.</li>
		<li>Tüm çözelti 24 delikli kültür plakasından toplandıktan sonra, tüm NHP enteroidlerinin her bir kuyucuktan çıkarıldığından emin olmak için her bir kuyucuğa 250 μL hücre bozma reaktifi ekleyin ve bu son durulamayı mevcut 15 mL konik tüplere ekleyin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında (20 ° C) 15 dakika boyunca 40 rpm'de sallanan bir platforma yerleştirin. Alternatif olarak, tüpleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca manuel olarak çalkalayın.</li>
		<li>15 dakika sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Süpernatantı 15 mL tüplerden sadece pelet kalana kadar çıkarın.</li>
		<li>Bir 15 mL konik tüpe 8 mL buz gibi soğuk DMEM + geniş spektrumlu antibiyotik ekleyerek peletin yeterince bozulduğundan emin olun. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
		<li>600 μL HOGMY ekleyin ve 1.000 μL'lik bir pipetle yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek peleti bozun. Çözelti buz gibi soğuyana kadar tüpü buz üzerine yerleştirin. Çözelti buz gibi soğuk olduğunda, hücre peletini askıya almak için 600 μL buz gibi soğuk ECM ekleyin ve 1.000 μL'lik bir pipetle iyice karıştırın. 1.3.2.-1.3.7 arasındaki adımları yineleyin. kalan 12 kuyu için.<ol><li>Kalan adımlar için 1.2.11.-1.2.16 numaralı adımlara bakın.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Enteroid tek katmanlı ve çizik yara tahlilinin kurulması
<ol><li>Medya ve tedavi hazırlığı<ol><li>5 mL PBS'yi buz gibi soğuğa kadar kalsiyum veya magnezyum olmadan soğutun.</li>
		<li>DMEM-F12 yıkama tamponunu, 500 mL DMEM / F12'ye (Dulbecco'nun Modifiye Kartalın Orta / Besin Ham Karışımı F12 + 15 mM HEPES tamponu) 1 mL geniş spektrumlu antibiyotik (100 μg / mL) ekleyerek hazırlayın. Buz gibi soğuk tutun.</li>
		<li>Adım 1.1.1.1.'de açıklandığı gibi 100 mL HOGMY hazırlayın ve tezgahın üzerinde oda sıcaklığına ısıtın.</li>
		<li>37 °C su banyosunda ılık 25 mL% 0.25 Tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA).</li>
		<li>Çözücü olarak kalsiyum veya magnezyum içermeyen steril PBS kullanarak hücre tedavisi için 50 μg / mL, 100 μg / mL ve 200 μg / mL HA35 konsantrasyonları hazırlayın. HA35'in son seyreltilmesinde çözücü olarak HOMGY kullanılacaktır. NOT: HA35 preparatı birkaç seyreltme gerektirebilir, çünkü HA35 genellikle çözeltiden 5 mg / mL'den daha yüksek bir konsantrasyonda ortaya çıkar.</li>
	</ol></li>
	<li>Enteroid tek katmanlı oluşum NOT: Aşağıdaki prosedür, 24 delikli enteroid tek katmanlı bir plakanın oluşturulması için yeterli hacimleri sağlar. İstediğiniz sayıda tek katman için ses seviyelerini ayarlayın.<ol><li>ECM bazlı hidrojel BME'nin (fenol kırmızısı içermeyen) 96 μL'sini 2-8 ° C'de buz üzerinde gece boyunca çözün. ECM bazlı hidrojeli buz gibi soğuk PBS'de kalsiyum veya magnezyum olmadan 1:50 oranında seyreltin. 24 kuyucuklu bir doku kültürü plakasının her bir kuyusunu 200 μL buz gibi soğuk seyreltilmiş ECM bazlı hidrojel ile kaplayın.</li>
		<li>ECM bazlı hidrojel kaplı plakayı 37 °C'de en az 1 saat ve %5 CO2'de inkübe edin. Tek katmanlara yönelik 3D enteroidleri içeren 24 delikli kültür plakasından ortamları aspire edin ve 500 μL hücre ayrışma reaktifi / kuyusu ile değiştirin.</li>
		<li>ECM bazlı hidrojel kubbeleri 8x-12x yukarı ve aşağı pipetleyerek manuel olarak bozun ve 12 kuyucuğun içeriğini 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.</li>
		<li>Tüm enteroidlerin çıkarıldığından emin olmak için 12 boş kuyucuğu 250 μL hücre ayrışma reaktifi ile yıkayın ve içeriği 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 2.2.5 adımını yineleyin. ve adım 2.2.6. ikinci bir 15 mL konik tüp kullanarak kalan 12 kuyu için.</li>
		<li>Konik tüpleri 300 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı atın. 15 mL konik tüplere 10 mL buz gibi soğuk DMEM-F12 yıkama tamponu ekleyin ve tüpleri ters çevirerek enteroid peletleri askıya alın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.</li>
		<li>Süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini 12 mL'lik 37 °C Tripsin-EDTA'da yeniden askıya alın. Tüpleri 10 dakika boyunca veya hücreler çözünür görünene kadar 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Tripsin-EDTA'yı seyreltmek için her tüpe 3 mL DMEM-F12 yıkama tamponu ekleyin, tüpleri ters çevirerek karıştırın ve buzun üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Ayrışmış enteroidleri 37 μM ağ hücre süzgecinden filtreleyin ve içeriği temiz 15 mL konik tüpler halinde toplayın. Tüpleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Hücreler santrifüjde peletlenirken, ECM bazlı hidrojel kaplı plakayı inkübatörden çıkarın ve kaplanmış yüzeyi çizmeden veya plakanın tamamen kurumasına izin vermeden fazla ECM bazlı hidrojel çözeltisini aspire edin.</li>
		<li>Süpernatantı konik tüplerden çıkarın ve hücre peletlerini 6 mL HOMGY ile yeniden askıya alın. ECM bazlı hidrojel ile kaplanmış 24 delikli plakanın her bir kuyucuğuna, kabaca 3 x 10 5 hücreli / kuyucuklu bir tohumlama yoğunluğunda kombine 12 mL HOMGY hücre süspansiyonunun500 μL'sini ekleyin. Kuyucuklar içindeki hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için plakayı bir kapakla döndürün.</li>
		<li>Plakayı 37 °C ve %5 CO 2'de inkübe edin, tek katmanlar %&gt;90 akıcılığa ulaşana kadar her2 günde bir HOMGY ortamını değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Tek katmanlı tedavi ve çizik yara tahlili<ol><li>Tek katmanlar% &gt;90 akıcılığa ulaştığında, yapışamayan hücreleri çıkarmak için ortamı aspire edin. Hücreleri 24 saat boyunca HOMGY'de çözünmüş 500 μL HA35 (50 μg / mL, 100 μg / mL, 200 μg / mL) veya PBS ile tedavi edin.</li>
		<li>24 saat sonra, tek katmanın yüzeyini bozmamaya dikkat ederek ortamı çıkarın. 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak, tek katmanların kurumasına izin vermemeye dikkat ederek her bir kuyucuktaki tek katmanın tam yüzey çapı boyunca doğrusal bir çizik yapın.</li>
		<li>Çizilmiş tek katmanlı 1x'i 500 μL 1x PBS ile yıkayın. HOMGY'de çözünmüş 500 μL HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) veya PBS ekleyin ve plakayı 37 °C ve %5 CO2 inkübatöründe canlı hücre analiz cihazına (Malzeme Tablosu) aktarın.</li>
		<li>Canlı hücre analiz yazılımındaki (Malzeme Tablosu) Program simgesinin altında, Yeni Gemi Ekleme Sihirbazını Başlat simgesine tıklayın ve tarama sıklığını bir programa göre tarama yapacak şekilde ayarlayın. Tarama Türü altında yeni bir Tam Kuyu kabı oluşturun, tarama ayarlarını belirtin (örneğin, Görüntü Kanalları için Faz ve Hedef için 4x) ve İleri'ye tıklayın. </li>
		<li>Sağlanan listeden plaka üreticisini ve katalog numarasını seçin. Zamanlama simgesinin altında, plakanın canlı hücre analiz aracına yerleştirileceği artı sembolünü seçin. İstediğiniz Tarama Desenini seçin ve ardından Plaka Düzeni sayfasında "+" işaretini seçerek bir plaka haritası oluşturun. Analizi Daha Sonra Ertele'yi seçin ve ardından 24 saat boyunca her 4 saatte bir Tarama Zamanlaması'nı ayarlayın ve Gemi Sihirbazı Özeti sayfası altında alma ayarlarını doğrulayın. Son olarak, Programa Ekle'yi seçin.</li>
		<li>24 tahlil tamamlandıktan sonra, Görünüm simgesinin altında, Gemi Adı'na çift tıklayın ve görüntüleri ve filmleri dışa aktarın. JPEG olarak görüntülemek ve dışa aktarmak için kuyucukları ve bir dizi görüntüyü seçin. Adım 2.4'e göre ImageJ21 için Yara İyileştirme Boyutu Eklentisi'ni kullanarak yüzde yara iyileşmesi için görüntüleri analiz edin. aşağıda.</li>
	</ol></li>
	<li>Çizik yara analizi<ol><li>ImageJ yazılımını açın. Çizik yara tahlili görüntülerini yükleyin (. TIFF veya .JPG).</li>
		<li>Görüntü &gt; Görüntüyü 24 bit RGB'den 8 bit'e değiştirmek için &gt; 8 bit yazın'ı seçin. Yara İyileştirme Boyutu Eklentisini , Eklentiler &gt; Makrolar'ı seçerek &gt; &gt; Yara İyileştirme Boyutu Eklentisi Yükle'yi yükleyin.</li>
		<li>Çizik dikey olacak şekilde görüntüyü döndürün ve Yara İyileştirme Boyutu Aracı eklentisini başlatın.</li>
		<li>Kazıma yarasına en iyi şekilde uyması için iletişim kutusundaki eklenti parametrelerini seçin. Yara iyileşmesi boyutu seçenekleri için parametrelerin değerini şu şekilde ayarlayın: Varyans Penceresi Yarıçapı 20'de, Eşik değeri 100'de ve Doymuş Piksellerin Yüzdesi 0,001'de ve Ölçeği Genel Ayarla için Evet'i seçin. Tamam düğmesine tıklayarak seçimi tamamlayın. Seçilen alanın yara bölgesi olup olmadığını doğrulayın. Yukarıdaki parametreler laboratuvardan laboratuvara standardizasyon gerektirebilir.</li>
		<li>2.4.2.-2.4.4 arasındaki adımları yineleyin. her çizik için kalan zaman noktaları için.</li>
		<li>24 saat boyunca göç eden veya çoğalan hücrelerin çizik alanı yara iyileşmesi yüzdesini aşağıdaki gibi hesaplayın: % Yara İyileşmesi = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63758/63758eq01.jpg" style="margin: auto;"> burada T 0 = % Alan 0 saat ve Tc = % Alan 0 saat, 4 saat, 12 saat veya 24 saatte.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lemons, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+low+birth+weight+outcomes+of+the+National+Institute+of+Child+Health+and+Human+Development+Neonatal+Research+Network%2C+January+1995+through+December+1996%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996.</a> Pediatrics. 107 (1), 1(2001).</li>
<li>Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+composition%2C+digestion%2C+and+absorption+differences+among+neonatal+feeding+strategies%3A+Potential+implications+for+intestinal+inflammation+in+preterm+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants.</a> Nutrients. 13 (2), 550(2021).</li>
<li>Duffy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+mediating+bacterial+translocation+in+the+immature+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine.</a> The Journal of Nutrition. 130, 2S Suppl 432-436 (2000).</li>
<li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis%3A+An+immature+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776(2011).</li>
<li>Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+the+developing+human+intestine%3A+A+possible+pathophysiologic+contribution+to+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).</li>
<li>He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+components+modulate+toll-like+receptor-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation.</a> Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).</li>
<li>Walker, W. A., Iyengar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+milk%2C+microbiota%2C+and+intestinal+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis.</a> Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).</li>
<li>Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+enteral+supplementation+of+a+prebiotic+mixture+of+non-human+milk+galacto-%2C+fructo-+and+acidic+oligosaccharides+on+intestinal+permeability+in+preterm+infants%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants.</a> British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).</li>
<li>vanden Berg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+glutamine-enriched+enteral+nutrition+on+intestinal+permeability+in+very-low-birth-weight+infants%3A+A+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parenteral+and+Enteral+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial.</a> Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).</li>
<li>Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+immunoglobulin+for+preventing+necrotizing+enterocolitis+in+preterm+and+low+birth+weight+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).</li>
<li>Maffei, D., Schanler, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+is+the+feeding+strategy+to+prevent+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).</li>
<li>Patel, A. L., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+and+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human milk and necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).</li>
<li>Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+immunomodulating+components+of+maternal+breast+milk+and+protection+against+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis.</a> Nutrients. 12 (1), 14(2019).</li>
<li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+hyaluronan+enhances+innate+defense+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).</li>
<li>Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glycosaminoglycans+in+protection+from+neonatal+necrotizing+enterocolitis%3A+A+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review.</a> Nutrients. 12 (2), 546(2020).</li>
<li>Chaaban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+small+intestine+development+and+remodeling+of+the+microbiome+following+hyaluronan+35+kDa+treatment+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice.</a> Nutrients. 13 (6), 2030(2021).</li>
<li>Gunasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+35+kDa+enhances+epithelial+barrier+function+and+protects+against+the+development+of+murine+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).</li>
<li>Montenegro-Miranda, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4%CE%B1+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li>
<li>Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+regeneration+ability+of+Crohn%27s+disease+assessed+using+patient-derived+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013(2021).</li>
<li>Gurung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Zika+virus+%28ZIKV%29+infection+following+vaginal+inoculation+with+ZIKV-infected+semen+in+timed-pregnant+olive+baboons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons.</a> Journal of Virology. 94 (11), 00058(2020).</li>
<li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).</li>
<li>Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cell+migration+monitoring+to+analyze+drug+synergism+in+the+scratch+assay+using+the+IncuCyte+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system.</a> Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).</li>
<li>de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+milk+nutrients+driving+intestinal+epithelial+layer+maturation+via+Wnt+and+Notch+signaling%3A+Implications+for+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229(2021).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+protects+epithelial+cells+from+excessive+autophagy+and+apoptosis+in+experimental+neonatal+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis.</a> PLoS One. 8 (7), 69620(2013).</li>
<li>Kessler, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+role+of+35+kilodalton+hyaluronan+in+promoting+defense+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).</li>
<li>Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan%3A+Its+nature%2C+distribution%2C+functions+and+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover.</a> Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+35kDa+treatment+protects+mice+from+Citrobacter+rodentium+infection+and+induces+epithelial+tight+junction+protein+ZO-1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo.</a> Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).</li>
<li>Prehm, P., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+hyaluronan+export+from+human+fibroblasts+by+inhibitors+of+multidrug+resistance+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters.</a> Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).</li>
<li>Stenson, W. F., Ciorba, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmicrobial+activation+of+TLRs+controls+intestinal+growth%2C+wound+repair%2C+and+radioprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection.</a> Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510(2021).</li>
<li>Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+regulates+normal+intestinal+and+colonic+growth+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).</li>
<li>Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+and+TLR4+mediate+hyaluronic+acid+regulation+of+Lgr5%2B+stem+cell+proliferation%2C+crypt+fission%2C+and+intestinal+growth+in+postnatal+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).</li>
<li>Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific-sized+hyaluronan+fragments+promote+expression+of+human+beta-defensin+2+in+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).</li>
<li>Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+intestinal+epithelial+wound+healing+through+protease-activated+receptor-2+activation+in+Caco2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).</li>
<li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering+Communications%22%5BJournal%5D)">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li>
<li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272(2020).</li>
<li>Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+organoids%3A+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri ve çıkar çatışmaları yoktur.

Preterm bir bebeğin gastrointestinal sistemi, dysbiosis, inflamatuar bakteriyel metabolitler ve toksinler ve aralıklı hipoksi23,24 ile ilişkili çevresel hakaretlere tekrar tekrar maruz kalmaktan kaynaklanan sürekli rejeneratif baskı altındadır. Ne yazık ki, preterm bebeğin bağırsak epiteli, fonksiyonel bütünlüğü hızlı bir şekilde oluşturamamaktadır23, bariyer disfonksiyonu, artmış bağırsak geçirgenliği ve ciddi vakalarda yaygın bağırsak il...

Nekrotizan enterokolit (NEC) preterm bebeklerde en sık görülen gastrointestinal acillerden biridir1. Hastalık, bağırsak nekrozu, sepsis ve potansiyel olarak ölüme hızla bozulabilen şiddetli bağırsak iltihabı ile karakterizedir. Etiyolojisi belirsiz olmasına rağmen, kanıtlar NEC'nin multifaktöriyel olduğunu ve beslenmenin karmaşık bir etkileşiminin, anormal bakteriyel kolonizasyonun ve olgunlaşmamış bir bağırsak epitelinin sonucu olduğunu düşündürmektedir 2,3. Preterm bebeklerde bağırsak geçirgenliği, anormal bakteriyel kolonizasyon ve düşük enterosit rejeneratif kapasitesi4,5 artmış, intestinal bariyer disfonksiyonu, bakteriyel translokasyon ve NEC gelişimi riskini arttırmıştır. Bu nedenle, bağırsak epitel olgunlaşmasını hızlandırmak ve bağırsak epitelinin yenilenmesini veya iyileşmesini teşvik etmek için stratejilerin veya müdahalelerin belirlenmesi, bu ölümcül hastalığın önlenmesinde kritik öneme sahiptir.
Çalışmalar, insan sütünün (HM) preterm bebeklerde NEC'ye karşı koruyucu olduğunu göstermiştir 6,7,8,9,10,11. Hem insan hem de hayvan çalışmaları, sığır bazlı formülün bağırsak geçirgenliğini arttırdığını ve bağırsak epitel hücreleri için doğrudan toksik olduğunu göstermiştir 2,12. Tam olarak aydınlatılamamasına rağmen, kanıtlar HM'nin koruyucu etkilerinin laktoferrin, immünoglobulin A (IgA) ve HM oligosakkaritler13 gibi biyoaktif bileşenler aracılığıyla aracılık ettiğini göstermektedir. HM ayrıca, tekrarlayan D-glukuronik asit ve N-asetil-D-glukozamin disakkaritleri14,15 ile benzersiz bir sülfatlanmamış glikozaminoglikan olan hyaluronan (HA) bakımından da zengindir. Önemli olarak, bir HM HA taklidi olan oral 35 kDa HA'nın (HA35), bağırsak hasarının şiddetini azalttığını, bakteriyel translokasyonu önlediğini ve murin NEC benzeri bir bağırsak hasarı modelinde mortaliteyi azalttığını gösterdik16,17.
Burada, HA35'in bağırsak iyileşmesi ve in vitro rejenerasyonu üzerindeki etkileri daha ayrıntılı olarak araştırılmıştır. Günümüzde bağırsak yaralanması ve onarımı için en yaygın kullanılan in vitro tahlil, kolorektal kanser (KRK) hücre tek katmanlarında yapılan bir çizik yara testidir. Böyle bir modelin preterm bebek bağırsağı ile fizyolojik ilgisi sınırlıdır, çünkü CRC hücrelerinin yara onarımı, kök hücre güdümlü onarım süreçlerinden ziyade kanser hücrelerinin yüksek derecede proliferatif doğasına dayanır18. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, birincil kök hücre kaynaklı ince bağırsak enteroidlerinin preterm insan olmayan primatlardan (NHP) izole edilmesi ve sürdürülmesi prosedürü de dahil olmak üzere bir 2D enteroid çizik yara modelinin kurulması burada açıklanmaktadır. Preterm NEC'nin en sık distal ince bağırsakta bildirildiği göz önüne alındığında, primer epitel hücreli organoidlerin bağırsak hasarı ve onarımı modelinde kullanılması, geleneksel kolorektal monokatmanları kullanan mevcut modellere kıyasla daha fizyolojik olarak çevrilebilir bir in vitro model sağlar18,19.

<table><tbody><tr><td>10 mL Serolojik Pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-49</td><td></td></tr><tr><td>100x21mm Çanak, Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konik tüp</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu, TC ile işlenmiş, düz tabanlı plaka</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>37 & mikro; M Tersinir Hücre Süzgeci</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konik tüp</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>70 & m Steril Hücre Süzgeçleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Albümin, Sığır (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Hücre Canlılık Testi</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium/Nutrient Jambon Karışımı F-12 (DMEM-F12) 15 mM HEPES tamponu ile</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>Nazik Hücre Dissosiyasyon Reaktifi</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>100-0485</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Incucyte S3 Canlı Hücre Analiz Cihazı</td><td>Sartorius</td><td>4647</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte Çizik Yara Analiz Yazılım Modülü</td><td>Sartorius</td><td>9600-0012</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid Büyüme Ortamı (İnsan)</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>06010</td><td>Bu HOGMY, ancak Y-27632 veya antibiyotikler olmadan. Ayrıca HOGM için baz olarak kullanılır, ancak daha sonra sadece antibiyotikler eksiktir.</td></tr><tr><td>Escherichia coli O111:B4'ten elde edilen lipopolisakkaritler, jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırılmıştır</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bazal Membran Matrisi, Fenol Kırmızısı İçermeyen</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta İşlemli, Düz Tabanlı Mikroplaka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Fosfat Tamponlu Salin), 1X [-] Kalsiyum, Magnezyum, pH 7.4</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Bu geniş spektrumlu antibiyotiklerdir</td></tr><tr><td>Sodyum Hyaluronat, Araştırma Sınıfı, HA20K</td><td>Lifecore Biyomedikal</td><td>HA20K-1</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Şirket: Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA 1X,% 0.25 Tripsin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

hyaluronik asit 35 kda'nın enteroid kaynaklı tek katmanlı erken İnce bağırsak hasarı ve İyileşmesinin in vitro modeline etkisi

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

In vitro çizik yara testleri, çeşitli doku tiplerinde epitel iyileşmesinin mekanizmalarını ve özelliklerini araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, terminal ileumun bağırsak kriptlerinden türetilen üç boyutlu (3B) insan dışı primat enteroidlerinden iki boyutlu (2B) bir tek katman oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz. Bu enteroid türevi monokatmanlar daha sonra, bir insan sütü HA taklidi olan hyaluronan 35 kDa'nın (HA35) epitel yara kenarı boyunca hücre göçünü ve proliferasyonunu teşvik etme yeteneğini test etmek için in vitro çizik yara testinde kullanıldı. Tek katmanlar akıcılığa yükseltildikten sonra, manuel olarak çizildi ve HA35 (50 μg / mL, 100 μg / mL, 200 μg / mL) veya kontrol (PBS) ile muamele edildi. Hücre göçü ve boşluğa proliferasyon, canlı hücre görüntüleme için donatılmış bir iletilmiş ışık mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Yara kapanması, ImageJ'deki Yara İyileştirme Boyutu Eklentisi kullanılarak yara iyileşmesinin yüzdesi olarak ölçüldü. HA35 in vitro , ince bağırsak enteroid tek katmanlarında, muhtemelen yara kenarındaki hücre proliferasyonu ve yara bölgesine göçün bir kombinasyonu yoluyla, yara iyileşmesini hızlandırır. Bu yöntemler potansiyel olarak erken insan ince bağırsağında bağırsak yenilenmesini keşfetmek için bir model olarak kullanılabilir.

HA'nın çeşitli doku ve organlarda doku onarımı ve yara iyileşmesi üzerindeki etkileri iyi belgelenmiştir; Bununla birlikte, moleküler ağırlığı 35 kDa'lık olan HA'nın fetal veya yenidoğan ince bağırsak iyileşmesi ve rejenerasyonu üzerindeki spesifik etkileri şu anda bilinmemektedir. HA35'in fetal veya yenidoğan ince bağırsağının bir modelinde yara iyileşmesini destekleme yeteneğini test etmek için, NHP ileal dokusundan 3D bağırsak enteroidleri ürettik ve 2D enteroid türevi tek katmanlar oluşturmak için bu dokuyu tek hücre...

Bu protokol, insan dışı primat ileumundan izole edilen üç boyutlu (3B) enteroidlerden türetilen iki boyutlu (2B) tek katmanlı tabakalar üzerinde bir çizik yara testi oluşturmak ve gerçekleştirmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Hyaluronik Asit 35 kDa'nın Enteroid Kaynaklı Tek Katmanlı Erken İnce Bağırsak Hasarı ve İyileşmesinin In Vitro Modeline Etkisi

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Bu protokol, ince bağırsağın tüm ana hücre tiplerini temsil eden enteroid türevi tek katmanlı rejenerasyon çalışmaları için kullanılan çok yaygın çizik yara testini genişletir. Bu teknik, bağırsak rejenerasyonunun erken dönem 2D enteroid tek katmanlı modelinde yara kapanmasının gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlar. Tekniğimiz, dönüştürülmüş kolorektal kanser hücre hatları kullanılarak tipik olarak kötü modellenen preterm memeli bağırsağının çalışmasına uygulanabilir.96 mikrolitre hücre dışı matrisi veya ECM bazlı hidrojel BME'yi, iki ila sekiz santigrat derecede buz üzerinde gece boyunca çözerek başlayın. ECM bazlı hidrojeli ve buz gibi soğuk PBS'yi kalsiyum veya magnezyum olmadan bir ila 50 oranında seyreltin. 24 delikli bir doku kültürü plakasının her bir kuyucuğunu, 200 mikrolitre buz gibi soğuk seyreltilmiş ECM bazlı hidrojel ile kaplayın ve kaplanmış plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte en az bir saat inkübe edin.Daha sonra, medyayı tek katmanlara yönelik 3D enteroidleri içeren 24 delikli kültür plakasından aspire edin ve kuyucuk başına 500 mikrolitre hücre ayrışma reaktifi ile değiştirin. ECM bazlı hidrojel kubbeleri, sekiz ila 12 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek ve 12 kuyucuğun içeriğini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktararak manuel olarak bozun. Tüm enteroidlerin çıkarıldığından emin olmak için 12 boş kuyuyu 250 mikrolitre hücre ayrışma reaktifi ile yıkayın ve içeriği 15 mililitrelik konik tüplere aktarın.Konik tüpleri 300g'da dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Konik tüplere 10 mililitre buz gibi soğuk DMEM/F-12 yıkama tamponu ekleyin ve tüpleri ters çevirerek enteroid peletleri askıya alın. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300g'da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.Hücre peletlerini 12 mililitre 37 santigrat derece Tripsin-EDTA'da yeniden askıya alın ve tüpleri 10 dakika boyunca veya hücreler çözünür görünene kadar 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. Tripsin-EDTA'yı seyreltmek için her tüpe üç mililitre DMEM / F-12 yıkama tamponu ekleyin. Tüpleri ters çevirerek karıştırın ve buzun üzerine yerleştirin.Ayrışmış enteroidleri 37 mikrometrelik bir ağ hücre süzgecinden süzün. İçeriği temiz 15 mililitrelik konik tüplere toplayın ve tüpleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300g'da santrifüj edin. Süpernatantı konik tüplerden çıkarın ve hücre peletlerini altı mililitre HOMGY ile yeniden askıya alın.Daha sonra, ECM bazlı hidrojel kaplı plakayı inkübatörden çıkarın ve kaplanmış yüzeyi çizmeden veya plakayı tamamen kurutmadan fazla ECM bazlı hidrojel çözeltisini aspire edin. ECM bazlı hidrojel ile kaplanmış 24 delikli plakanın her bir kuyucuğuna kombine 12 mililitre HOMGY hücre süspansiyonunun 500 mikrolitresini ekleyin. Kuyucuklar içindeki hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için plakayı kapakla döndürün.Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin, tek katmanlar% 90'dan fazla akıcılığa ulaşana kadar her iki günde bir HOMGY ortamını değiştirin. Tek katmanlar% 90'dan fazla akıcılığa ulaştığında, yapışamayan hücreleri çıkarmak için ortamı aspire edin. Hücreleri, 24 saat boyunca HOMGY'de çözünmüş 500 mikrolitre HA35 veya PBS ile tedavi edin.Bundan sonra, tek katmanın yüzeyini bozmadan ortamı çıkarın. 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak, tek katmanların kurumasına izin vermemeye dikkat ederek, her bir kuyucuktaki tek katmanın tam yüzey çapı boyunca doğrusal bir çizik yapın. Çizilmiş tek katmanları 500 mikrolitre 1X PBS ile bir kez yıkayın ve HOMGY'de çözünmüş 500 mikrolitre HA35 veya PBS ekleyin.Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörü içinde canlı hücre analiz cihazına aktarın. Canlı hücre analiz yazılımındaki Program simgesinin altında, Yeni Gemi Ekleme Sihirbazını Başlat simgesine tıklayın. Programa göre Tara'yı seçin, ardından İleri'ye tıklayın.Gemi Oluştur altında Yeni'yi seçin ve İleri'ye tıklayın, ardından Tarama Türü altında Tam Kuyu'yu seçin ve İleri'ye tıklayın. Görüntü kanalları için Aşama'yı ve reklam verme amacı için 4x'i seçin. Sağlanan listeden plaka üreticisini ve katalog numarasını seçin ve İleri'yi tıklatın.Boş bir gemi konumu ve ardından istenen tarama desenini seçin. Ad alanına plaka adını girin, ardından bir plaka düzeni oluşturmak için artı simgesini seçin. Bir tedavi adı oluşturmak için küçük artı'yı seçin.Kısa adı ve ardından Tamam'ı girin. Bu işleme karşılık gelen plaka kuyularını vurgulayın ve bu işlemle kuyuları belirlemek için büyük artıya vurun. Bileşik konsantrasyonunu girin ve Tamam'ı tıklatın. Plaka tamamlandığında Tamam, İleri'yi seçin. Analizi daha sonraya ertele'yi ve ardından Dört saatlik aralıklarla taramalarla yeni zamanlama oluştur'u seçin.Taramayı bir günde, sıfır saatte durdurun. Özetin doğru olduğundan emin olun ve ardından zamanlamaya ekleyin. Canlı hücre analizi yazılımında, ekranın üst kısmındaki Görüntüle'yi seçin.Gemi Adı menüsünden, tamamlanan 24 saatlik taramanıza gidin ve gemi adına çift tıklayın. Soldaki Görüntüleri ve filmleri dışa aktar simgesini ve ardından Görüntülendiği Gibi seçeneğini seçin. İlgilendiğiniz kuyuları vurgulayın ve ardından İlgi çekici zaman noktalarını ve Görüntü Serisini Görüntüleniyor olarak seçin.Sıra türünün ve taramaların doğru olduğundan emin olun. İstediğiniz hedef klasör konumunu seçin. Açılır menüden JPEG'i ve ardından Dışa Aktar'ı seçin.ImageJ yazılımını açın ve çizik yara tahlili görüntüsünü yükleyin. Görüntü'yü seçin, sonra görüntüyü 24 bit RGB'den değiştirmek için 8 bit yazın. Yara İyileştirme Boyutu Eklentisini yüklemek için Eklentiler, Makrolar, Yükle Wound_healing_size eklentisini seçin.Bundan sonra, varyans penceresi yarıçapını 20'ye, eşik değerini 100'e, doymuş piksellerin yüzdesini 0.001'e ayarlayın. Set Scale global için Evet ve ardından Tamam'a tıklayın. Belirtilen alanın yara alanı olduğunu doğrulayın ve ek çizikler için tekrarlayın. Son olarak, ekranda gösterilen denklemi kullanarak 24 saat boyunca göç eden veya çoğalan hücrelerin çizik alanı yara iyileşmesinin yüzdesini hesaplayın.Burada, T0 sıfır saat zamanındaki alandır ve TC sıfır saat, dört saat, 12 saat veya 24 saatlik alandır. Bu görüntülerde enteroid jenerasyon ve enteroid kaynaklı tek katmanlı yara iyileşmesi testi prosedürü gösterilmiştir. Üç boyutlu, insan olmayan primat bağırsak enteroidlerinin kültürü, iki boyutlu tek katmanlara ayrışmak için kullanılır.Tek katmanlar, 24 delikli bir plakada% 90'dan fazla birleşime kadar büyütüldü ve daha sonra 24 saat boyunca HA35 veya PBS ile muamele edildi. Tek katmanlar daha sonra bir P200 pipet ucu ile çizildi. Burada, insan dışı primat enteroid monokatmanlarının kontrol tedavilerinde HA35'in temsili görüntüleri gösterilmektedir.Görüntüler, P200 pipet ucuyla çizik yapıldıktan sonra sıfır saat, dört saat, 12 saat ve 24 saatte elde edildi. HA35'in yara iyileşmesi ve oid monokatmanlar üzerindeki etkisi burada gösterilmiştir. Enteroid tek katmanlı çocuklarda zamanla yara iyileşmesindeki değişim, HA35 tedavi konsantrasyonuna bağlıdır.HA35, kontrole kıyasla mililitre başına 100 mikrogram ve mililitre başına 200 mikrogramda dört saat ve 12 saat sonra yara iyileşmesini önemli ölçüde arttırdı, ancak iyileşme oranları tedaviler arasında 24 saat yakınsadı. Bu prosedürle hatırlanması gereken en önemli şeylerden biri, bağırsak enteroid monokatmanlarının kısa ömürlü olmasıdır. Bu nedenle,% 90 konakışkan olduklarında, araştırmacılar bunları hızlı bir şekilde kullanmaya çalışmalıdır.Bu teknik, özellikle enflamatuar yaralanmadan ziyade daha mekanik olarak ilgileniyorsak, in vitro erken bağırsak rejenerasyonu için başvurduğumuz model haline gelmiştir.

effect-hyaluronic-acid-35-kda-on-an-vitro-model-preterm-small

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video, lipopolisakkarit tedavisinin neden olduğu insan kaynaklı bir neonatal enteroid modelinde nekrotizan enterokolit hastalığının gelişimini göstermektedir. Bu model bağırsak patofizyolojisini incelemeye yardımcı olur.

İnsan Epitelyal Enteroid Modelinde Nekrotizan Enterokolit İndüksiyonu

Bu iletişim kuralı insan bağırsak organoids floresan mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı aşağıdaki farmakolojik tedavide epitel bariyer geçirgenliği ölçümü açıklar ve cep mikroskobu canlı.

Gerçek zamanlı insan bağırsak Organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü

Enteroids insan hastalık insan yeni bir model olarak ortaya çıkıyor. Protokol insan nekrotizan enterokolit yenidoğan dokusundan üretilen enteroids tedavisinde lipopolysaccharide (LPS) kullanarak bir enteroid modeli benzetimi açıklar. Toplanan enteroids benzer-e doğru o insan nekrotizan enterokolit görülen iltihabi yapılan değişiklikleri göstermektedir.

Bir roman insan epitel Enteroid nekrotizan enterokolit modeli

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücresi (hiPSC)-türev intestinal organoidler enterik hastalıkları model almak için heyecan verici fırsatlar sunar. Biz bağırsak organoidler (ıhos), bu iHOs sitokinler ile stimülasyon ve Salmonella typhimurium IFO lümen içine Mikroenjeksiyonu, bu tarafından bir epitelyal invazyonu çalışma sağlayan hipeplerin farklılaşma göstermek Patojen.

Insan kaynaklı pluripotent kök hücresini kullanma- Salmonella ve diğer patojenlere karşı epitelyal hücre korumasını Incelemek ve değiştirmek Için bağırsak organoidleri türetilmiştir

Burada, bağırsak bariyer fonksiyonunu, geçirgenliğini ve taşınmasını incelemek için insan organoid türevi bağırsak epitel monokatmanlarının hazırlanmasını açıklıyoruz. Organoidler dış uyaranlara karşı orijinal epitel dokusu yanıtını temsil ettiğinden, bu modeller hücre hatlarının genişletilebilirliğinin avantajlarını ve birincil dokunun alaka düzeyini ve karmaşıklığını birleştirir.

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

Bu protokol, apikal yüzeye erişime izin veren, ters polariteye sahip ince bağırsak enteroidlerini kullanan apikal-dışarı nekrotizan enterokolit (NEC) bir çanak içi modelini tanımlar. NEC ile ilişkili epitel bozulmasını tespit etmek için bir immünofloresan boyama protokolü ve NEC-in-a-dish protokolüne tabi tutulan apikal-out enteroidlerin yaşayabilirliğini belirlemek için bir yöntem sunuyoruz.

İn Vitro Nekrotizan Enterokolitin Apikal-Out Enteroid Modeli

Bu protokol, fetal bağırsak dokusundan üç boyutlu bir bağırsak modeli olan enteroidlerin kurulmasını detaylandırır. Model karakterizasyonunda epitel biyobelirteçlerinin immünofloresan görüntülemesi kullanıldı. Bakteriyel bir endotoksin olan lipopolisakkaritlerin apikal maruziyeti, mikroenjeksiyon tekniği kullanılarak, floresan dekstranın sızıntısı ile ölçülen doza bağımlı bir şekilde epitel geçirgenliğine neden olmuştur.

Fetal Doku Kaynaklı Enteroidlerde Epitel Geçirgenliğinin Test Edilmesi

Burada, sabit bağırsak eşdeğerlerinin ışık mikroskobik değerlendirmesi için temel bir üç boyutlu (3D) bağırsak hücre hattı model sistemi ve bir parafin gömme protokolü oluşturmayı açıklıyoruz. Seçilen proteinlerin boyanması, klinik öncesi ilaç tarama çalışmalarında potansiyel kullanım için tek bir deneyden birden fazla görsel parametrenin analizine izin verir.

Bağışıklık Bileşenli Temel Üç Boyutlu (3D) Bağırsak Model Sistemi

Bu protokol, hastalık patogenezine yönelik mekanik çalışmalar için kullanılabilen bir in vitro nekrotizan enterokolit (NEC) modelini açıklar. İnsan yenidoğan bağırsağından, endotel hücrelerinden ve şiddetli NEC'li bir yenidoğanın bağırsak mikrobiyomundan türetilen bağırsak enteroidleri ile tohumlanmış bir mikroakışkan çipe sahiptir.

İnsan Yenidoğan Bağırsak Enteroidlerini ve Disbiyotik Mikrobiyomu İçeren Nekrotizan Enterokolitin Mikroakışkan Modeli

Bu protokol, immün boyama ile hücre adezyonu, organoid morfolojisi ve gen ekspresyonu için biyofonksiyonel kendi kendine birleşen peptitleri değerlendirmeyi amaçlar. Yoğun testler için organoidleri elde etmenin uygun maliyetli bir yolunu sağlamak için bir kolorektal kanser hücre hattı kullanacağız.

Ultra Kısa Kendi Kendine Birleşen Peptit Matrisinde SW1222 Hücre Hattından Kolorektal Kanser Organoidlerinin İmalatı ve Karakterizasyonu

Bu çalışma, organoidlerden sığır bağırsağı 2D tek tabakaları oluşturmak için bir protokol sunar ve konak-patojen etkileşimlerini incelemek için gelişmiş erişim sunar. Sığırların gastrointestinal fizyolojisini taklit eden in vitro modelleri geliştirerek membran bütünlüğünü ve işlevselliğini değerlendirmek için yöntemler içerir. Bu yaklaşım, gelişmiş tedavi stratejileri de dahil olmak üzere önemli biyomedikal ve tarımsal faydalar vaat etmektedir.

İnce ve Kalın Bağırsak Tek Katmanlı Arayüzleri Kullanılarak Sığır Organoid Teknolojisindeki Gelişmeler

Keşfedin enteroid kaynaklı tek katmanlı erken ince bağırsak hasarı ve iyileşmesinin in vitro modelinde hyaluronik asit 35 kDa'nın etkisini. Bu yöntem, preterm bağırsak rejenerasyonunu gerçek zamanlı görselleştirmeyle inceler.

Hyaluronik Asit 35 kDa'nın Enteroid Kaynaklı Tek Katmanlı Erken İnce Bağırsak Hasarı ve İyileşmesinin In Vitro Modeline Etkisi

Daha fazla video keşfet