Name: Drosophila Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Keşfedin Drosophila oogenezi sırasında bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu konfokal ve süper rezolüsyonlu görüntüleme yöntemleriyle. Bu protokol yüksek çözünürlüklü hücresel süreç analizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Julie Merkle'ye el yazması hakkındaki yararlı yorumları için minnettardır. Bu çalışma, O.D.'ye NIH hibe R15GM137236 tarafından desteklenmiştir. Konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüler, NSF MRI hibe 2018748 ile satın alınan Airyscan 2'li bir Zeiss LSM 900 kullanılarak elde edildi.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

BM, embriyonik ve organ morfogenezi ve yetişkin fizyolojik fonksiyonları için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, BM, epitel polaritesinin kurulması ve sürdürülmesi için bir sinyal platformu görevi görür ve dokulara destek2 sağlar. Bununla birlikte, BM proteinlerinin uygun şekilde yerleştirilmesini düzenleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığına ve polarize sekresyonuna adanmış biyolojik yolakların daha iyi anlaşılması, bu yolakların bileşenlerinin ve BM i...

Bodrum membranı (BM), epitel yapısı ve morfogenez1 için kritik olan katmanlı hücre yapışık hücre dışı matriksin (ECM) ince bir tabakasıdır. ~ 50 proteinden oluşur ve epitel ve endotel hücrelerinin altında her yerde bulunur ve iskelet, pürüzsüz ve kalp kası hücrelerini ve adipositleri 1,2,3 ile örter. BM'nin epitel hücrelerinin bazal tarafındaki üç ana bileşeni Kollajen IV, Perlekan ve Lamininlerdir. BM, epitel hücrelerinin temelini oluşturur ve doku ayrılması ve bariyeri, büyüme ve destek ve hücre polarizasyonu 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 dahil olmak üzere birçok fonksiyondan sorumludur. . Bir sinyal platformu olarak rolü, gelişim sırasında epitel hücrelerinin ve dokularının morfolojisini ve farklılaşmasını düzenler 3,13,14. Ayrıca, BM'nin yanlış düzenlenmesi ve / veya bütünlüğünün ihlali, tümör metastazı2,15,16 dahil olmak üzere birçok patolojik durumun birincil nedenleridir. BM tarafından doku ve organ morfogenezi sırasında gerçekleştirilen temel fonksiyonlara rağmen, BM proteinlerinin polarize hücre içi kaçakçılığına ve sekresyonuna adanmış biyolojik yolakların bileşenleri belirsiz olarak bilinmektedir.
BM içeren veziküllerin hücre içi kaçakçılığını ve BM proteinlerinin epitel hücreleri tarafından salgılanmasını incelemek için, Drosophila yumurtalıklarının foliküler epiteli (FE) güçlü bir model sistemdir (Şekil 1). Bir Drosophila yumurtalık, ovaroller adı verilen 16-20 uzun, tüp benzeri yapıdan oluşur (Şekil 1A, B)17,18,19. Her ovarol, ön uçta başlayan ve olgun yumurta kanalından çıkana kadar arkadan hareket eden yumurta odalarının (her biri bir yumurtaya yol açan) yaş ilerlemesiyle bir yumurta montaj hattı olarak düşünülebilir. Her yumurta odası, merkezi germline hücrelerini (GC'ler) çevreleyen somatik folikül hücrelerinin (FC'ler) tek katmanlı bir tabakası olan FE tarafından kapsüllenir. FE, apikal alanın germ hattına baktığı ve BM proteinlerinin bazal olarak18,19 salgılandığı belirgin bir apikal-bazal polarite ile oldukça polarize edilir. FC'ler, Kollajen IV, Perlecan ve Lamininler20,21 dahil olmak üzere BM'nin tüm ana bileşenlerini aktif olarak salgılar. FC'ler gibi epitel hücrelerinde, BM bileşenleri üretilir ve hücre dışı birikimleri için özel bir polarize sekresyon yolu gerektirir. Örneğin, BM'nin en bol bileşeni olan Kollajen IV (Coll IV) söz konusu olduğunda, polarize hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu çevreleyen detaylar, üretimi ve birikimi birçok çalışmanın odak noktası olmasına rağmen belirsizdir. Coll IV, endoplazmik retikulumda (ER) çevrilir, bu da her fibrilin - üç polipeptitten (iki α1 zinciri ve bir α2 zinciri) oluşan - üçlü bir sarmal22'ye monte edildiği yerdir. Uygun Coll IV katlama ve fonksiyonu, Plod ve PH4αEFB 20,22,23,24,25,26 gibi lizil ve prolil-hidroksilazlar dahil olmak üzere ER şaperonları ve enzimleri gerektirir. Bu posttranslasyonel enzimler, Coll IV'ün ER sıralamasını düzenler, çünkü her birinin kaybı, Coll IV'ün bazal ER20,23,24,25,26'da sıkışmasına neden olur. Daha sonra, yeni sentezlenen Coll IV, COPII kaplı veziküllerde Golgi için ER'den çıkar. Kargo reseptörü Tango1, kollajenlerin büyük multimerik proteinleri barındırabilen büyük Golgi'ye bağlı veziküllere paketlenmesine yardımcı olur20,27. Coll IV, hücre içi ekzositik veziküllere paketlendikten sonra, özellikle epitel hücrelerinden bazal olarak salgılanır. BM birikimini bazal tarafa yönlendirmek için, epitel hücreleri özellikle polarize BM sekresyonuna adanmış başka bir dizi faktöre ihtiyaç duyar. Drosophila yumurtalıklarının FE'sini kullanarak, nükleotid değişim faktörleri (GEF'ler) Crag ve Stratum, GTPazlar Rab8 ve Rab10'un yanı sıra fosfoinositid PI (4,5) P2 seviyeleri ve Kinesin 1 ve 3 motor proteinleri 20,28,29,30,31 dahil olmak üzere bu yeni hücresel sürecin birkaç bileşeni karakterize edilmiştir. . Bu bileşenler, BM proteinlerinin polarize dağılımını sağlamada kritik öneme sahiptir.
FE'deki BM proteinlerinin hücre içi lokalizasyonunu izlemek için, Viking-GFP (Vkg-GFP veya α2 Coll IV-GFP) ve Perlecan-GFP (Pcan-GFP) gibi endojen olarak etiketlenmiş bazal membran proteinleri (protein tuzakları)32,33 kullanılabilir. Bu protein tuzak hatlarının BM proteinlerinin endojen dağılımını doğru bir şekilde yansıttığı ve veziküler kaçakçılığın daha hassas bir şekilde tespit edilmesini sağladığı gösterilmiştir 28,30. FE'de BM'nin polarize birikiminde rol oynayan bileşenler ilk olarak Vkg-GFP ve Pcan-GFP20,28,29,30 için protein tuzak hatları kullanılarak karakterize edildi. Protein tuzakları, mutantlar ve Gal4 hatları34 dahil olmak üzere farklı genetik arka planlarda kullanılabilir. Ayrıca, protein tuzakları floresan boyalar ve / veya floresan immünoboyama ile kombinasyon halinde kullanılabilir, bu da vahşi tip ve mutant koşulları karşılaştırırken BM proteinlerinin lokalizasyonunun kesin karakterizasyonuna izin verir35.
BM proteini içeren veziküllerin dağılımını ve lokalizasyonunu doğru ve verimli bir şekilde değerlendirmek için, konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ve süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri diğer görüntüleme yaklaşımlarına önemli bir avantaj sağlamaktadır. Bu yaklaşımlar, yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi göreceli kullanım kolaylığı ile birleştirir. CLSM, galvanometreler kullanarak numuneyi bir lazerle raster tarama tarzında tarayarak gelişmiş bir optik çözünürlüğe izin veren bir mikroskopi tekniğidir. İğne deliği açıklığı, konfokal mikroskopun temel bir bileşenidir. İğne deliği diyafram açıklığı, odak düzleminin üstünden veya altından gelen odak dışı sinyalleri engelleyerek, z ekseni36'da oldukça üstün bir çözünürlük sağlar. Bu aynı zamanda z-düzleminde, bir dizi optik bölüme karşılık gelen z-yığını adı verilen bir dizi görüntü elde etmeyi mümkün kılar. z-yığınları daha sonra görüntüleme yazılımı yardımıyla 3D rekonstrüksiyon yoluyla numunenin 3D görüntüsünü oluşturur. Geleneksel epifloresan (geniş alan) mikroskoplar, konfokal mikroskopların aksine, odak dışı ışığın görüntü kalitesine katkıda bulunmasına izin vererek görüntü çözünürlüğünü ve kontrastıazaltır 36,37. Bu, epifloresan mikroskopisini protein lokalizasyonu veya kolokalizasyonu üzerinde çalışırken daha az çekici bir aday haline getirir.
CLSM, BM proteinlerinin hücre içi trafiğinin görüntülenmesi ve karakterizasyonu da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için uygun bir yaklaşım olmasına rağmen, Abbe'nin ışık kırınım sınırının (200-250 nm) altındaki örnekleri görüntülerken hala bir sorun teşkil etmektedir. Bu tür örnekleri görüntülerken, konfokal mikroskopi, özellikle bir yağ hedefi kullanırken, yüksek çözünürlükle sonuçlanabilir. Bununla birlikte, süper çözünürlük teknikleri konfokal mikroskopinin sınırını aşmaktadır. Süper çözünürlüklü mikroskopi elde etmek için, her biri belirli çözünürlük sınırlarına sahip ve her biri farklı analizler için uygun olan çeşitli yaklaşımlar vardır. Bu yaklaşımlar arasında fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) veya stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM), uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu (STED), yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) ve Airyscan (süper çözünürlük) mikroskobu 38,39,40,41,42,43,44,45,46 bulunmaktadır. . Airyscan, PALM / STORM, STED ve SIM'den daha kaba bir çözünürlüğe sahip olmasına rağmen, yine de ~ 120 nm'ye kadar bir çözünürlüğe ulaşabilir (CLSM'nin çözünürlüğünün yaklaşık iki katı). Ayrıca, bu süper çözünürlüklü mikroskopi yaklaşımının, kalın numuneleri ve düşük sinyal-gürültü oranına sahip numuneleri görüntülerken SIM ve diğer süper çözünürlüklü tekniklere göre bir avantajı olduğu gösterilmiştir47,48.
Airyscan nispeten yeni bir süper çözünürlüklü konfokal mikroskopi teknolojisidir46. Odak dışı ışığı reddetmek için iğne deliği ve tek nokta dedektörlerini kullanan geleneksel CLSM'lerin aksine, bu süper çözünürlüklü yaklaşım, her tarama konumunda tüm ışığı toplayan 32 kanallı galyum arsenit fosfit (GaAsP) fotoçarpan tüp alanı dedektörü kullanır45. 32 dedektörün her biri küçük bir iğne deliği olarak çalışarak iğne deliği boyutunu geleneksel 1,0 Havadar Üniteden (A.U.) gelişmiş 0,2 A.U.'ya düşürerek 1,25 A.U. çapı45'in verimliliğini korurken daha da yüksek bir çözünürlük ve sinyal-gürültü oranı sağlar. Ayrıca, Airyscan tarafından kullanılan doğrusal dekonvolüsyon,45 çözünürlüğünde 2 kata kadar artışa neden olur. Bunu göz önünde bulundurarak, CLSM ve özellikle süper çözünürlüklü mikroskopi, BM proteinlerinin bazal birikimini düzenleyen BM proteinlerini ve proteinlerini incelemek için çok uygundur, çünkü lokalizasyon ve kolokalizasyon çalışmaları için çok yüksek çözünürlüklü görüntüler üretebilirler, böylece bu süreçleri kontrol eden mekansal, zamansal ve moleküler olaylarda yeni bilgiler sağlayabilirler.
Lokalizasyon deneyleri yapmak için kullanılabilecek konfokal mikroskopiye alternatif bir yaklaşım, görüntü dekonvolüsyonudur. Geniş alan mikroskobu, odak dışı ışığın dedektörlere ulaşmasına izin verdiğinden, geniş alan mikroskobu ile elde edilen görüntülerden odak dışı ışığı çıkarmak veya yeniden atamak için matematiksel ve hesaplamalı dekonvolüsyon algoritmaları uygulanabilir, böylece görüntünün çözünürlüğünü ve kontrastını artırabilir49. Dekonvolüsyon algoritmaları, çözünürlüğü ve kontrastı daha da artırmak için konfokal görüntülere de uygulanabilir ve neredeyse süper çözünürlüklü mikroskopi50 ile karşılaştırılabilir nihai görüntüler üretir. Airyscan, Sheppard'ın piksel yeniden atamasıyla birlikte Weiner filtre tabanlı dekonvolüsyondan yararlanır ve bu da oldukça gelişmiş bir uzamsal çözünürlük ve sinyal-gürültü oranı sağlar. Konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında, bu süper çözünürlüklü mikroskopi tekniği 45,51 kullanıldığında, her üç uzamsal boyutta (x ve y'de 120 nm ve z'de350 nm) çözünürlükte 2 kat artış gözlenmiştir.
Bu makale, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi ile birleştirilmiş bir model sistem olarak Drosophila yumurtalık FE'sini kullanarak BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve birikimini boyamak, elde etmek ve görselleştirmek için ayrıntılı ve optimize edilmiş protokoller sunmaktadır. Vkg-GFP ve Pcan-GFP gibi endojen olarak etiketlenmiş bazal membran proteinlerini ifade eden Drosophila çizgileri, BM protein kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek için etkili ve doğru araçlardır. Ek olarak, mutant ve Gal4 / UAS hatları34 dahil olmak üzere farklı genetik arka planlarda kolayca kullanılabilirler. Endojen olarak etiketlenmiş bazal membran proteinleri önerilmekle birlikte, spesifik BM proteinlerine karşı antikorların kullanımı da tarif edilen protokollerle uyumludur. Bu protokoller, konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüleme kullanarak hücre içi kaçakçılığı ve bozulmamış epitel dokusunda BM proteinlerinin salgılanmasını incelemek isteyen bilim adamları için özellikle yararlıdır. Dahası, epitel doku analizini Drosophila genetiğinin geniş araçlarıyla birleştirme yeteneği, bu yaklaşımı özellikle güçlü kılmaktadır. Son olarak, bu protokoller veziküler kaçakçılığı ve ilgilenilen diğer proteinlerin sıralanmasını incelemek için kolayca uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>F-Aktin Boyası (66 & mikronun 1/500'ü; M)</td></tr> <tr><td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td><td>invitrojen</td><td>A22287</td><td>F-aktin lekesi (1/100 / 66 & mikro; M))</td></tr><tr><td>Anti-GM130 Antikoru</td><td>abcam</td><td>ab30637</td><td>Golgi Lekesi İçin (kolokalizasyon); 7 & mikro konsantrasyon olarak kullanın; g/uL</td></tr><tr><td>Aqua-Polymount Polysciences</td><td>, Inc.</td><td>1860620</td><td>Montaj Ortamı</td></tr><tr><td>Ekmek Mayası (Aktif Kuru Maya)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>Diseksiyon için fazlalıkları yağlandırmak için</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (% 30 çözelti)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7284</td><td>Çözeltiyi bloke etmek için</td></tr><tr><td>Depresyon kuyuları</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>7156101</td><td>Diseksiyon için (bunun yerine cam içbükey slayt kullanılabilir)</td></tr><tr><td>Diseksiyon iğnesi</td><td>Fisher scientifc</td><td>13-820-024</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Kuluçka</td><td>Makinesi Genesee Scientific/Invictus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)</td><td></td><td></td><td>Morin ve diğerleri, 2001</td></tr><tr><td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi hattı (TRIP hattı HMS00241)</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>33594</td><td>RNAi, Crag'a karşı</td></tr><tr><td>Sinek Stoku: Viking-GFP Drosophila hattı (CC00791)</td><td></td><td></td><td>Buszczak ve diğerleri, 2007</td></tr><tr><td>Sinek Stoku: Vkg-GFP, tj-Gal4</td><td></td><td></td><td>Devergne ve diğerleri, 2017. FE Forseps'te Crag RNAi ekspresyonunu sürün</td></tr><tr><td>(Dumont 5)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-30</td><td>Diseksiyon için</td></tr><tr><td>Cam İçbükeylik Slayt Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>7187804</td><td>Diseksiyon için (bunun yerine depresyon kuyuları kullanılabilir)</td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG, Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11036</td><td>İkincil antikor (GM130 antikoru) (5 & mikro; g/mL)</td></tr><tr><td>Hoechst (Hoechst 33342)</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>DNA Lekesi (1 ug/mL)</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>Fisher Scientific: 06-666</td><td>Hassas görev silecekleri</td></tr><tr><td>Leica Floresan Stereo Mikroskop&nbsp; Yumurtalık görüntüleme için M165 FC</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları</td><td>Corning</td><td>294875X25</td><td>Mikroskop Slaytları</td></tr><tr><td>Nutating platformu rocker</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>6720</td><td>Yumurtalık fiksasyonu ve boyama için</td></tr><tr><td>Nutri-Fly BF</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-121</td><td>Fly Food</td></tr><tr><td>Paraformaldehit% 20 Çözelti</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>Fisher Bilimsel: 15713</td><td>PFA% 4</td></tr> <tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Tabletler</td> için <td>PBS çözeltisi için</td><td>Fisher bilimsel</td><td>BP2944100</td></tr><tr><td>ProLong Cam Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36980</td><td>Montaj Ortamı</td></tr><tr><td>Kare Kapaklı Cam</td> Mikroskop slaytları için <td>Corning</td><td>285022</td><td>Kapak camı</td></tr><tr><td>PBST için</td> <td>Triton x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-19-5</td></tr><tr><td>Airyscan 2 ile Zeiss LSM 900</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Konfokal ve süper çözünürlüklü Mikroskop</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 305 Stereo Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Diseksiyon mikroskobu</td></tr><tr><td>Zeiss Zen Yazılımı sürüm 3.3 (Blue Edition)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Görüntü alma ve işleme</td></tr></tbody></table>

drosophila oogenezi sırasında polarize hücre İçi kaçakçılığın ve bazalton membran proteinlerinin sekresyonunun konfokal ve süper rezolüsyonlu görüntülenmesi

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Epitel hücrelerinin bazal tarafında bulunan özel bir hücre dışı matriks tabakası olan bazal membran (BM), epitel dokusu morfolojisinin ve organ morfogenezinin kurulması ve sürdürülmesi için kritik öneme sahiptir. Dahası, BM doku modellemesi için gereklidir, bir sinyal platformu görevi görür ve dokuları ve organları şekillendirmek için dış kuvvetler sağlar. BM'nin normal gelişim ve patolojik durumlar sırasında oynadığı birçok önemli role rağmen, BM içeren veziküllerin hücre içi kaçakçılığını kontrol eden biyolojik yollar ve bazal sekresyonun BM proteinlerinin polarize birikimine nasıl yol açtığı tam olarak anlaşılamamıştır. Drosophila yumurtalıklarının foliküler epiteli, BM membran proteinlerinin bazal birikimini incelemek için mükemmel bir model sistemidir, çünkü BM'nin tüm ana bileşenlerini üretir ve salgılar. sabit dokularda görüntü işleme ile birleştirilen konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüleme, özellikle BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığı ve birikiminde rol oynayan hücresel faktörlerin tanımlanmasına ve karakterizasyonuna izin verir. Bu makalede, Drosophila yumurtalıklarının foliküler epitelindeki endojen olarak etiketlenmiş proteinler kullanılarak BM içeren veziküllerin ve biriken BM'nin boyanması ve görüntülenmesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol hem kalitatif hem de nicel soruları ele almak için uygulanabilir ve epitel dokusu gelişimi sırasında polarize hücre içi kaçakçılık ve veziküllerin salgılanmasında rol oynayan faktörlerin hızlı ve verimli bir şekilde tanımlanmasına olanak tanıyan yüksek verimli taramaya uyum sağlamak için geliştirilmiştir.

Burada açıklanan yöntemler, Drosophila yumurtalıklarının FE'si gibi polarize epitel hücrelerinde BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu verimli ve doğru bir şekilde görüntülemek ve karakterize etmek için kullanılabilir. Daha sonra, açıklanan yöntemler kullanılarak elde edilen beklenen sonuçların yanı sıra yararlı tavsiyeler ve potansiyel tuzaklar sunuyoruz. Bunu yapmak için, endojen olarak etiketlenmiş bir Vkg (Drosophila Col IV) olan Vkg-GFP kullanılır. Bununla birlikte, aynı sonuçla...

Bodrum zarı, gelişim sırasında doku ve organ morfogenezi için gereklidir. Bu yapının uygun şekilde yerleştirilmesine yol açan mekanizmaları daha iyi anlamak için, sunulan protokol, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak epitel hücrelerinde bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek ve karakterize etmek için yöntemleri açıklamaktadır.

Drosophila Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Bu protokol, Drosophila dizisini model bir sistem olarak kullanarak hücre içi kaçakçılığın ve bazal membran proteinlerinin salgılanmasının karakterizasyonuna izin verir. Tekniğimizin temel avantajı, endojen olarak etiketlenmiş proteinler ve Airyscan süper çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak bazal membran proteinlerinin hücre içi trafiğinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin vermesidir. Bu protokol, bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını görüntülemek için geliştirilmiş olsa da, diğer proteinlerin ve hücre kültürü ve organoidler de dahil olmak üzere diğer biyolojik sistemlerin kaçakçılığını incelemek için genişletilebilir.Başlamak için, PBS'deki Drosophila yumurtalıklarını diseksiyon kapsamı altında diseke ettikten sonra, bir mililitre fiksasyon çözeltisi ekleyin ve yumurtalıkları 15 dakika boyunca bir somun platformunda sabitleyin. Fiksasyon çözeltisini çıkarın ve her biri bir mililitre PBST içeren iki hızlı yıkama gerçekleştirin. Mikrosantrifüj tüplerini beş ila altı kez hafifçe ters çevirerek, daha sonra bir somun platformu rocker üzerinde bir mililitre PBST ile her biri 10 dakikalık dört uzun yıkama gerçekleştirin.Fiksasyon ve yıkama yaptıktan sonra, PBST'yi

confocal-super-resolution-imaging-polarized-intracellular-trafficking

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Kaynak: Wagner, K.  et al., eGFP Etiketli Proteinler Kullanılarak Drosophila fotoreseptör hücrelerinde membran protein kaçakçılığının incelenmesi. J. Vis. Uzm. (2022). Bu video, eGFP etiketli TRPL proteinleri kullanılarak Drosophila fotoreseptör hücrelerinde membran protein trafiğinin görselleştirilmesini göstermektedir. Görüntüleme için transgenik sineklerin hazırlanmasını, fotoreseptör hücrelerinin floresan görüntülerinin yakalanmasını ve rabdomerelerde nispi eGFP floresansının ölçülmesiyle...

Drosophila fotoreseptör hücrelerinde membran protein kaçakçılığının incelenmesi

Bu kağıdı doğrudan puparium aracılığıyla görüntü hücre davranışı hızlı bir tarama konfokal mikroskop kullanımını gösterir. Sağlam pupa davayı bırakarak, bu yöntem doğrudan çalışma zordur Drosophila bir gelişme aşamasında gözlem ve dinamik hücre süreçlerinin ölçülmesini sağlar.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Bu protokolde açıklanan dik görüntüleme yöntemi, gelişmekte olan bir Drosophila melanogaster yumurtasının kutuplarının ayrıntılı olarak görüntülenmesine olanak sağlar.  Bu uçtan bakış, foliküler epitelde çoklu hücre tiplerinin düzenlemelerine ve morfolojilerine yeni bir bakış açısı sağlar.

Dik Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Odaları

Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Burada, bozulmamış dokuda süper çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme için bir protokol sunulmaktadır. Son derece hassas bir erişkin kök hücre popülasyonunu doğal doku ortamında görüntüleme koşullarını standartlaştırdık. Bu teknik, biyolojik olayların canlı dokuda doğrudan gözlemlenmesine izin vermek için zamansal ve mekansal çözünürlüğü dengelemeyi içerir.

Hücre Altı Yapıların Süper Çözünürlüklü Canlı Hücre Görüntülemesi

Erken Drosophila embriyosunda, birçok organel hareketlidir. Prensip olarak, belirli floresan problar aracılığıyla canlı olarak görüntülenebilirler, ancak yumurta kabuğu embriyoya doğrudan uygulamayı önler. Bu protokol, bu tür probların mikroenjeksiyon yoluyla nasıl tanıtılacağını ve daha sonra parçacık  görüntü velosimetrisi yoluyla toplu organel hareketinin nasıl analiz edileceğini açıklar.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Burada, fotoreseptör membran proteinlerinin lokalizasyonu ve eGFP floresan kullanılarak Drosophila bileşik gözünde retinal dejenerasyonun değerlendirilmesi için non-invaziv yöntemler tanımlanmıştır.

eGFP Etiketli Proteinler Kullanarak Drosophila Fotoreseptör Hücrelerinde Membran Protein Kaçakçılığının İncelenmesi

Burada, konvansiyonel lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılarak süper çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için erken Drosophila embriyolarında genişleme mikroskobunun uygulanması için bir protokol sunulmaktadır.

Süper Çözünürlüklü Görüntüleme için Tam Montajlı Drosophila Embriyolarını Fiziksel Olarak Büyütmek için Genişleme Mikroskobunun Kullanılması

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Bu protokoller, kontrol ve mutant Drosophila embriyonik epitelisindeki pileli septat bağlantılarının organizasyonu ve kapatma fonksiyonunun nasıl karakterize edileceğini açıklar.

Drosophila embriyonik epitelinde çekirdek pileli septat bağlantı proteinlerini tanımlamak için immünboyama ve boya penetrasyonu deneyleri

Keşfedin Drosophila oogenezi sırasında bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu konfokal ve süper rezolüsyonlu görüntüleme yöntemleriyle. Bu protokol yüksek çözünürlüklü hücresel süreç analizi sağlar.

Drosophila Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal

Drosophila Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet