Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometrisi Analizi için Siyanobakterilerden Protein Dışı Amino Asitlerin Ekstraksiyonu

Bu protokol, kullanıcılara yardımcı olacak ve öğrencilere BMA, AEG ve 2, 4-DAB'ın çıkarılmasında doğru adımları öğretecektir. Böylece hata olasılığını en aza indirir ve tutarlı sonuçlar üretir. Bu yöntem, BMA ve izomerlerinin, AEG ve 2, 4-DAB'ın sauna bakteri matrisinde ekstraksiyonu için yaygın olarak kullanılan ve doğrulanmış bir yöntemdir.

Bu yöntem, BMA'ların toksisitesi ile ilgili daha fazla araştırma yapmak ve BMA ve ilişkili sağlık etkileri hakkında daha fazla bilgi sağlamak için kullanılabilir. Siyanobakteri örneğini 25 santigrat derecede 10 dakika boyunca 3.500 G'de merkezleyerek başlayın. Ve süpernatantı biyolojik atıklara atmak.

Pelet içeren santrifüj tüpünü bir sızdırmazlık filmi ile örtün ve keskin bir uzun burun cımbızı kullanarak filmdeki birkaç deliği delin. Ardından tüpü eksi 80 santigrat derecede dik olarak saklayın. 30 dakika sonra, tüpü dik bir şekilde dondurarak kurutucu cam bir kaba yerleştirin ve kabı soğutma için beş dakika boyunca eksi 80 santigrat derece dondurucunun içine yerleştirin.

Cam kabı dondurucudan çıkarın ve lastik kapağı takın. Dondurarak kurutucunun kauçuk valf çıkışındaki tutamağın yukarı baktığından ve atmosfere havalandırıldığından emin olun. Cam kabı sıkıca takın.

Kavanozu vakuma maruz bırakmak için lastik valf çıkışının kolunu yavaşça aşağı doğru çevirin. Ve tüm sıvıyı süblimleştirmek için 24 saate kadar dondurarak kurumaya bırakın. İşiniz bittiğinde, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 15 ila 50 miligram dondurulmuş numune peletini tartın.

Analitik terazi kullanma. Numuneye, 300 ila 600 mikrolitre% 10 sulu Trikloroasetik asit veya TCA ekleyin. Numune tüplerini ezilmiş buzla dolu bir kaba yerleştirin.

Sonik probu, probun ucunu numuneye tamamen batırmadan ve başlat düğmesine basmadan önce% 70 etanol püskürtülen tüy bırakmayan bir kağıt mendille silin. İşiniz bittiğinde, santrifüj tüpünü içeren numuneyi bir dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ve hücre lizisini sağlamak için sonikasyon işlemini tekrarlayın.

Numuneyi 24 saat boyunca dört santigrat derecede soğuttuktan sonra. Sekiz santigrat derecede 15 dakika boyunca 3.500 G'de santrifüj. Daha sonra bir mikro pipet kullanarak, süpernatantı serbest fraksiyon etiketli iki mililitrelik bir tüpe aktarın.

Numune peletine 400 mikrolitre %10 sulu TCA ekleyin ve peleti vorteks ajitasyonu veya mikro pipet ucu ile parçalayın. Santrifüj yapın ve süpernatantı aynı iki mililitrelik serbest fraksiyon tüpüne aktarın. %10 TCA asetonunu kullanarak bu adımı üçüncü kez tekrarlayın.

Serbest fraksiyon tüpünü, kapağı açık olacak şekilde, tüm uçucu sıvı çıkarılana kadar santrifüjlü bir evaporatöre yerleştirin. Numune uçucu sıvılardan arındırıldıktan sonra, tüpü tavan filmi ile güvenli bir şekilde örtün ve keskin bir uzun burun cımbızı kullanarak filmi birkaç delikle delin. Daha önce gösterilen dondurarak kurutmadan sonra, numuneyi 200 mikrolitre 20 milimolar hidroklorik asit ile yeniden oluşturun ve eksi 80 santigrat derece dondurucuya yerleştirin.

Bir mikro pipet kullanarak numune peletine 400 mikrolitre %100 aseton ekleyin ve vorteks ajitasyonu veya mikro pipet ucu kullanarak peleti parçalayın. Yıkanmış ve yeniden askıya alınmış peleti kantitatif olarak ilgili cam kabuk şişesine aktarın. Bir mililitrelik mikro pipet kullanarak.

Kalan peletin aktarılmasına yardımcı olmak için numune tüpüne 400 mikrolitre aseton daha ekleyin. Pelet çıkarılana ve pelet kuruyana kadar peleti santrifüjlü bir evaporatörde kurutmadan önce süpernatant sıvıyı santrifüj yapın ve biyolojik atık haline getirin. Vakumlu hidroliz dosyasını hazırlamak için, hidroliz dosyasının altına bir mililitre altı molar hidroklorik asit ekleyin.

Kurutulmuş numunelerle etiketlenmiş kabuk şişelerini, dik ve stabil bir pozisyon sağlayan cımbız kullanarak hidroliz dosyasına dikkatlice yerleştirin. Kapağı hidroliz dosyasına takın ve valfi kapatmak için kapaktaki kırmızı düğmeyi itin. Vakum pompasını açtıktan sonra, vakum tüpünü hidroliz dosyası kapağının kafasına takın ve vanayı açmak için kapaktaki yeşil düğmeye basın.

Ardından, vakum pompasının havayı şişeden bir dakika boyunca çıkarmasına izin verin. Ardından, hidroliz şişe kapağındaki kırmızı düğmeyi bastırarak şişeyi kapatın. Vakum pompasını kapatın ve vakum tüpünü çıkarın.

Laboratuvar tezgahındaki azot gazı musluğuna kauçuk bir tüp takın. Ve musluğu hafifçe açın. Başparmağınızı tüpün sonuna yerleştirin, kapatın ve basınç biriktikçe gaz kaçmaya başlayana kadar sayın.

Ardından, kauçuk borunun diğer ucunu hidroliz şişe kapağının kafasına takın. Ve hemen kapağın yeşil düğmesini itin. Gazın kaçması için geçen süreyi sayın.

Kapaktaki kırmızı düğmeyi hızla itin ve lastik tüpü çıkarın. Tüm vakum işleme işlemini iki kez tekrarlayın. Cam hidroliz şişesinin havasız olmasını ve azot gazı ile doldurulmasını sağlamak.

Hidroliz şişesini 16 ila 18 saat boyunca 110 santigrat derecede ayarlanmış önceden ısıtılmış bir fırına yerleştirin. Fırın eldivenlerini kullanarak, cam hidroliz şişesini fırından çıkarın. Şişenin duman davlumbazının içinde 10 dakika soğumasını bekleyin ve yeşil düğmeyi iterek basınç ve gazı serbest bırakmak için uzağa bakacak şekilde itin.

Hidrolize numune peletlerini 200 mikrolitre 20 molar hidroklorik asit ile kabuk şişesine yeniden oluşturun ve peleti yeniden askıya alın. Yeniden yapılandırılmış numune peletlerini içeren kabuk şişelerini 5, 300 G ve 25 santigrat derecede iki dakika boyunca santrifüj edin. Yeniden yapılandırılmış serbest fraksiyon numunelerini ve protein fraksiyonunu, 0,2 mikron gözenek membran filtreleri içeren ve serbest fraksiyon ve protein fraksiyonu olarak etiketlenmiş iki mililitrelik filtre tüplerine aktarın.

Santrifüjleme için tüpleri 30 dakika boyunca 5.000 G ve 25 santigrat derecede yerleştirin. Beta-Metilamino-L-alanin veya BMAA içeren bir standardın çoklu reaksiyon izleme kromatogramı ve renk kodlu çizgilerle belirtilen izomerleri burada gösterilmiştir. Üç izomer, BMAA, DAB ve AEG için pozitif bir tespit, Liddel Gölü'nden toplanan Merismopedia türlerinin serbest fraksiyonunda gözlendi.

Waka Waterworks'ten toplanan Microcystis flos-aquae türlerinin bağlı fraksiyonu, BMAA ve izomerleri için olumsuz bir sonuç göstermiştir. Yeniden askıya alınan pelet, Siyanobakteri kütlesine dayanan doğru bir normalleşme noktasına izin vermek için ilgili kabuk şişesine kantitatif olarak aktarılmalıdır. Bu adım gerçekleştirilirken hastalara ve durum tespitine dikkat edilmesi önerilir.

Bu prosedürü izleyerek. Ekstrakte edilen fraksiyonların ters faza izin vermek için bir devitalizasyon adımından geçmesi gerekecektir. Sıvı kromatografisi, tandem kütle spektrometresi analizi.

Bu tekniğin uygulanması çeşitli bilimsel alanları genişletir. Çevresel örneklerde sinotoksinlerin analizi yoluyla çevre bilimlerinin dahil edilmesi. Ve BMA'nın Yanlış Birleştirme teorisinin araştırılması yoluyla toksikoloji ve biyokimya gibi alanlar.