Name: Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometrisi Analizi için Siyanobakterilerden Protein Dışı Amino Asitlerin Ekstraksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Öğrenin, sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi ile siyanobakterilerden protein dışı amino asitlerin ekstraksiyonunu. Bu yöntem, BMA ve izomerlerinin güvenilir analizi için toksisite araştırmalarına destek sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.P.B., K.J.R. ve S.M.M., Ian Potter Vakfı tarafından desteklenmektedir ve J.P.V., Avustralya Hükümeti Araştırma Eğitim Programı Stipend'in alıcısıdır.

Bu çalışmada Merismopedia siyanobakteri türü kullanılmıştır38.
1. Ham numune hazırlama
<ol><li>Alg pisliğini ilgilenilen su kaynağından veya siyanobakteriyel kültürlü bir şişeden toplayın ve 50 mL santrifüj tüpü38'e yerleştirin. NOT: Numune, daha sonraki ekstraksiyonlar için -20 °C'de dondurulmalı ve bir sonraki adımdan önce çözülmelidir.</li>
	<li>Numuneyi içeren tüpleri 25 °C'de 10 dakika boyunca 3.500 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı bir atık kabına boşaltın ve biyolojik atıklara atın. NOT: Süpernatant, eksozomun gelecekteki analizi için ayrılmış olabilir.</li>
	<li>Numune peletini içeren tüpü bir sızdırmazlık filmi ile güvenli bir şekilde örtün (bkz. Malzeme Tablosu) ve keskin, uzun burunlu bir cımbız kullanarak filmdeki birkaç deliği delin. Tüpü 30 dakika boyunca -80 ° C'de dik konumda saklayın.</li>
	<li>Dondurarak kurutucuyu 0,1 mbar ve -80 °C'de (~30 dakika) açın ve dengeleyin. NOT: Parametreler (adım 1.4), mevcut etüt için kullanılan dondurarak kurutucu için optimize edilmiştir (bkz. Laboratuvarda bulunan dondurarak kurutucu modeline göre standart çalışma prosedürlerini izleyin veya dondurarak kurutucu modeli -80 °C'ye kadar düşmezse mümkün olan en düşük sıcaklığı ayarlayın.<ol><li>Santrifüj tüplerini dik bir şekilde dondurarak kurutucu cam kabına yerleştirin ve kavanozu soğutmak için 5 dakika boyunca -80 °C dondurucunun içine yerleştirin.</li>
		<li>Cam kabı dondurucudan çıkarın ve lastik kapağı takın.</li>
		<li>Dondurarak kurutucunun kauçuk valf çıkışındaki tutamağın atmosfere havalandırıldığından emin olun (yukarı doğru bakarak) ve cam kabı sıkıca takın.</li>
		<li>Kavanozu vakuma maruz bırakmak için kauçuk valf çıkışının kolunu çok yavaş bir şekilde aşağı dönük konuma getirin ve tüm sıvının süblimasyonunu sağlamak için 24 saate kadar dondurarak kurumaya izin verin.</li>
		<li>Kavanozdaki vakumu serbest bırakmak için, kolu yukarı doğru işaret eden konuma getirin, cam kabı çıkarın ve dondurularak kurutulmuş numuneleri çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>15-50 mg kurutulmuş numune peletlerini 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne tartmak için analitik bir terazi kullanın. NOT: Numuneler, bu aşamada daha fazla işlenmediği takdirde -80 °C depolama alanına yerleştirilebilir.</li>
</ol>2. Hücre lizasyonu ve serbest NPAA'ların fraksiyonasyonu
<ol><li>Numune tüpüne bir mikropipet kullanarak 100 μL 100 ng/mL D5-2,4-DAB (bkz. Malzeme Tablosu) standardı ekleyin (isteğe bağlı).</li>
	<li>D5-2,4-DAB standardını eklerseniz, sırasıyla 300-600 μL w/v sulu trikloroasetik (TCA, bakınız Malzeme Tablosu) veya 300-600 μL %11,7-%13,3 TCA ekleyin. NOT: Pelet'i tamamen kaplayan bir sulu TCA hacmi seçin.</li>
	<li>Numune tüplerini ezilmiş buzla dolu bir kaba yerleştirin.</li>
	<li>Orta-yüksek güçte (% 70) bir prob sonicator ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın ve aşağıdaki adımları izleyerek numuneyi 1 dakika boyunca lize edin. DİKKAT: Gürültü önleyici kolluklar kullanarak uygun KKD'yi sağlayın.<ol><li>Kapıya kullanımda olan tabelaları yerleştirerek, duman davlumbazında sonikasyon yaparak ve gürültü önleyici kolluklar kullanarak prob sonicator'un kullanımına hazırlık olarak uygun güvenlik protokollerini izleyin.</li>
		<li>Sonikatöre açın ve aşağıdaki parametreleri girin: genlik,% 70; süre, 1 dk.</li>
		<li>Tüy bırakmayan bir kağıt mendil üzerine %70 etanol püskürtün (bkz. Malzeme Tablosu) ve probu silin.</li>
		<li>Probun ucunu numuneye tamamen daldırın ve başlat düğmesine basın.</li>
		<li>Prob sonicator durduğunda, numuneyi içeren santrifüj tüpünü 1 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Hücrelerin lize edildiğinden emin olmak için, 2.4.3-2.4.5 arasındaki adımları bir kez daha tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Protein çökelmesine izin vermek için numuneyi 12-24 saat boyunca 4 ° C'de bir buzdolabına koyun.</li>
	<li>%10 sulu TCA numunesini 8 °C'de 15 dakika boyunca 3.500 x g'de santrifüj yapın.</li>
	<li>Süpernatantı "Serbest Fraksiyon" etiketli 2 mL'lik bir tüpe aktarmak için bir mikropipet kullanın.</li>
	<li>Kalan numune peletini içeren santrifüj tüpüne %10 sulu TCA'lık 400 μL mikropipet ve pelet vorteks ajitasyonu veya mikropipet ucu ile parçalanır.</li>
	<li>Süpernatantı aynı 2 mL "Serbest Fraksiyon" tüpüne aktararak 2.6-2.7 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Kalan pelet ile santrifüj tüpüne 400 μL %10 TCA/aseton mikropipet ve vorteks veya mikropipet ucu ile peleti parçalayın.</li>
	<li>%10 TCA/aseton numunesini 3.500 x g'de 8 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı "Serbest Fraksiyon" etiketli 2 mL tüpe aktarmak için bir mikropipet kullanın.</li>
	<li>"Serbest Fraksiyon" tüpünü, kapağı açık bir santrifüj evaporatörüne yerleştirin (bakınız Malzeme Tablosu) tüm uçucu sıvılar uzaklaştırılana kadar (en az 1 saat).</li>
	<li>Numune uçucu sıvılardan arındırıldıktan sonra, tüpü sızdırmazlık filmi ile güvenli bir şekilde örtün ve keskin, uzun burunlu bir cımbız kullanarak filmi birkaç delikle delin. Numuneyi -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin.</li>
	<li>Adım 1.4'teki tüm adımları tekrarlayarak "Serbest Fraksiyon" numunesini dondurarak kurulayın.</li>
	<li>Dondurularak kurutulmuş numuneyi yeniden oluşturmak ve -80 °C dondurucu deposuna yerleştirmek için "Serbest Fraksiyon" tüpüne 200 μL 20 mM hidroklorik asit (HCl) mikropipeti. NOT: Numunenin "Serbest Fraksiyonu" 4. adımda filtrasyona hazırdır. Kalan pelet, protein fraksiyonasyonu için aşağıdaki adımlarda daha fazla işlenecektir.</li>
</ol>3. Proteine bağlı NPAA'ların fraksiyonasyonu
<ol><li>Cam kabuk şişelerini tanımlama için numune ayrıntılarıyla etiketlemek için bir cam gravür makinesi kullanın. NOT: Güçlü asit, mürekkep etiketlemesini dağıtabilir; bu nedenle, etiketlerin cam üzerine kazınması önerilir.</li>
	<li>Numune peleti üzerine 100 ng/mL D5-2,4-DAB standardında 100 μL mikropipet (isteğe bağlı).</li>
	<li>Numune peleti üzerine 400 μL %100 aseton mikropipet ve vorteks ajitasyonu veya mikropipet ucu kullanarak peleti parçalara ayırın.</li>
	<li>Yıkanmış ve yeniden askıya alınmış peleti ilgili cam kabuk şişesine aktarmak için 1.000 μL'de ayarlanmış 1 mL'lik bir mikropipet kullanın. NOT: Peletin cam kabuk şişesine tamamen aktarılmasına yardımcı olmak için çalkalanmış pelete başka bir 400 μL% 100 aseton eklenebilir. Bu, gerekirse üçüncü kez tekrarlanabilir.</li>
	<li>25 °C'de 5 dakika boyunca 8.000 x g'da santrifüj yapın ve sıvıyı biyolojik atıklara boşaltın.</li>
	<li>Kalan peleti, tüm sıvı giderilene ve pelet kuruyana (~ 1 saat) kadar santrifüjlü bir evaporatöre yerleştirin.</li>
	<li>Hidroliz şişesinin tabanına 1 mL 6 M HCl ekleyerek vakum hidroliz şişesini hazırlayın.</li>
	<li>Kurutulmuş numuneleri içeren etiketli kabuk şişelerini hidroliz şişesine dikkatlice yerleştirmek için cımbız kullanın ve dik ve kararlı bir konum sağlayın. NOT: Numune sayısı hidroliz şişesinin kapasitesinden azsa, numune şişelerinin dik tutulmasına yardımcı olmak için boş kabuk şişeleri kullanılabilir.</li>
	<li>Kapağı hidroliz şişesine takın ve valfi kapatmak için kapaktaki kırmızı düğmeyi itin.</li>
	<li>Vakum pompasını açın, vakum tüpünü hidroliz şişe kapağının kafasına takın ve vanayı açmak için kapaktaki yeşil düğmeye basın.</li>
	<li>Vakum pompasının (bkz. Malzeme Tablosu) havayı şişeden 1 dakika boyunca çıkarmasına izin verin.</li>
	<li>Hidroliz şişe kapağındaki kırmızı düğmeyi bastırarak şişeyi kapatın, vakum pompasını kapatın ve vakum tüpünü çıkarın.</li>
	<li>Laboratuvar tezgahındaki azot gazı musluğuna kauçuk bir tüp takın ve musluğu hafifçe açın. Başparmağınızı tüpün ucuna yerleştirin, kapatın ve basınç biriktikçe gaz kaçmaya başlayana kadar sayın. Bu, bir sonraki adımın zaman dilimi olacaktır. Gaz akışını uygun bir zaman dilimine ayarlayın.</li>
	<li>Kauçuk borunun diğer ucunu hidroliz şişe kapağının kafasına takın ve ardından hemen kapağın yeşil düğmesini itin. Adım 3.13'te belirlenen süreye kadar sayın ve kapaktaki kırmızı düğmeyi hızla itin ve lastik tüpü çıkarın.</li>
	<li>Cam hidroliz şişesinin havasız olduğundan ve azot gazı ile doldurulduğundan emin olmak için 3.10-3.14 arasındaki adımları iki kez tekrarlayın.</li>
	<li>Hidroliz şişesini 16-18 saat boyunca 110 °C'de ayarlanmış önceden ısıtılmış bir fırına yerleştirin.</li>
	<li>Cam hidroliz şişesini fırından çıkarmak için fırın eldivenleri kullanın ve duman davlumbazının içinde 10 dakika soğumasını bekleyin. Duman davlumbazının içinde, sizden uzağa bakarken, basınç ve gazı serbest bırakmak için yeşil düğmeyi itin.</li>
	<li>Kabuk şişelerini hidroliz şişesinden çıkarmak için cımbız kullanın.</li>
	<li>Hidrolize numune peletlerini, kabuk şişesine 200 mM HCl'lik 200 μL'lik mikro pipetleme ile yeniden oluşturun. Peletin vorteks veya pipet ucu kullanılarak yeniden askıya alındığından emin olun.</li>
	<li>Yeniden yapılandırılmış numune peletlerini içeren kabuk şişelerini 5.300 x g ve 25 °C'de 2 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
</ol>4. Örnek filtreleme
<ol><li>0,2 μm gözenekli membran filtreler içeren 2 mL filtre tüplerini (bakınız Malzeme Tablosu) "Serbest Fraksiyon" ve "Protein Fraksiyonu" olarak etiketleyin.</li>
	<li>Yeniden yapılandırılmış numuneleri adım 2.15 (serbest fraksiyon) ve adım 3.20'den (protein fraksiyonu) ilgili filtre tüplerine aktarın.</li>
	<li>Bunları 5.000 x g ve 25 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüje yerleştirin.</li>
	<li>Filtreleri filtre tüplerinden çıkarın ve kapağını kapatın. Numuneler artık adım 5'te amino asit türevlendirmesi için hazırdır. NOT: Numuneler, daha sonra türevlendirme ve analiz için saklanmak üzere -80 °C dondurucuya yerleştirilebilir.</li>
</ol>5. Amino asit türevlendirme
<ol><li>Numuneleri, üreticinin talimatlarına göre propil kloroformat (PCF)39 veya 6-aminokinolil-N-hidrosisüksinimidil karbamat (AQC)40 kullanarak türetin (bkz.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

NPAA'ların analizi için burada özetlenen ekstraksiyon protokolü, biyolojik numunelerdeki herhangi bir amino asidin analizi için geçerlidir. Siyanobakteriyel suşların izole edilmesi ve kültürlenmesi ile ilgili kılavuzlar için, Violi ve ark.38 tarafından çalışmada sunulan yöntemlere başvurulabilir. Protokoldeki ilk adım, numuneyi kuru ağırlığa karşı numuneler arasında normalleşmenin sağlanabileceği bir noktaya götürür. İkinci adım, analitleri serbest bırakmak için hücre lizisidir ve bu protokolde açıklandığı gibi prob sonikasyonu gibi mekanik bozulmalar / lizesler, donma / çözülme döngüleri, öğütme ve boncuk frezeleme ve enzimatik, deterjan ve / veya kimyasal lizis gibi mekanik olmayan bozulmalar dahil olmak üzere bir dizi teknik kullanılarak gerçekleştirilebilir. Mekanik bozulmanın, numunenin lize edilme kapasitesinin daha yüksek olmasına izin verirken, hücre içi bağların ve proteinlerin bozulmadan kalmasına izin verdiği için mekanik olmayanlara göre avantajlı olduğu bilinmektedir41, ancak örnek matrisi hücre lizasyonu için en uygun yöntemi belirleyebilir.
Protein çökeltisi, analiz için amino asitleri ekstrakte ederken bu protokolün kritik üçüncü adımıdır. TCA en yaygın kullanılan çözücüdür; Bununla birlikte, perklorik asit, aseton, metil tert-bütil eter (MTBE), metanol ve / veya asetonitril 8,42 de kullanılmıştır, burada her ekstraksiyon çözücüsünün farklı substratları ekstrakte etmesi ve çökeltmesi amaçlanmıştır. Burada açıklanan model, NPAA BMAA'yı ve izomerlerini siyanobakteriyel bir matristen çıkarır ve bir dizi farklı çözücü kullanılmasına rağmen, en yaygın ikisi suda% 10 TCA (sulu) ve% 10 TCA'dır asetonda. Genel olarak, TCA ile protein çökeltmesi, proteine bağlı amino asitlerden serbest amino asitleri fraksiyone etmek için amino asitleri çıkarmak için yaygın olarak kullanılır. Ek olarak, TCA ekstraksiyonu, toplam protein içeriğinin belirlenmesine, serbest fraksiyon için kirleticilerin azaltılmasına ve minimum protein bozunumu ile proteazların aktivitesinin azaltılmasına izin verir43. Serbest fraksiyonun TCA ekstraksiyonu, başlangıçta organik olarak çözünür maddeleri durulayarak, proteinlerin ve çökelti içindeki hücre duvarı kalıntıları gibi çözünmez bileşiklerin arkasında bırakarak çalışır, daha sonra güçlü bir asit kullanarak proteine bağlı amino asitlerin (bağlı fraksiyon) termal hidroliz ekstraksiyonu ile takip edilir.
Serbest fraksiyonun% 10 sulu TCA artı sonication ile fraksiyonasyonu, diğer organik çözücülere kıyasla en kapsamlı protein çökelmesini üretir44 ve en iyi amino asit geri kazanımları42. Bazı çalışmalar, daha küçük peptitler / biyomoleküller de dahil olmak üzere daha fazla molekülü çökeltmek, protein bozulmasını en aza indirmek ve tuzlar gibi kirleticileri azaltmak için organik bir çözücü (yani% 10 -% 20 TCA43) ile birleştirilmiş bir asit kullanmayı tercih etmektedir. Aseton içinde% 10 TCA'nın bir diğer avantajı, peletin hidroliz için hazırlanmasında daha hızlı kuruma hızıdır ve amino asit modifikasyonunu önlemek için nem kalıntısını en aza indirir. Bununla birlikte,% 10 sulu TCA artı sonikasyon, yalnızca asetonda% 10 TCA ile karşılaştırıldığında, serbest amino asitlerindaha iyi ekstraksiyon verimliliğine sahiptir. Ek olarak,% 10 sulu TCA çökeltilmesi, uzun bir kuruma süresi, tüm proteinleri veya küçük peptitleri / biyomolekülleri çökiteyememek ve ilgilenilen analite (yani, proteinler veya amino asitler) bağlı olarak, oksidasyon ve bozulmayı önlemek için katkı maddeleri ve indirgeyici maddeler gerektirmesi gibi sınırlamalara sahiptir45,46.
Bu protokol, protein çökelmesini arttırmak, daha küçük peptitlerin/biyomoleküllerin çökeltilmesini sağlamak, daha hızlı pelet kurutma sürelerine izin vermek ve her iki çözücü ekstraksiyon özelliğinden yararlanarak ekstraksiyon verimliliğini artırmak için asetonda %10 sulu TCA ve %10 TCA'nın bir kombinasyonunu kullanır. Bununla birlikte, asetonda% 10 sulu TCA ve% 10 TCA'nın kombinasyonu, aseton süpernatantındaki% 10 TCA, sulu serbest fraksiyon ile birleştirildikten sonra serbest fraksiyondaki küçük peptitleri / biyomolekülleri çökeltebilir. Bu durumda, çökeltiler hidroliz için bağlı fraksiyona aktarılmalıdır.
Bu protokolün ikinci yarısı, oksijensiz bir ortamda yüksek sıcaklıklarda asit-buhar hidrolizi yoluyla protein peletinden amino asitlerin (yani BMAA) salınmasını içerir. Hidroliz adımının ağırlıklı olarak sınırlayıcı faktörü, hazırlanmasının zaman alıcı ve zahmetli olmasıdır. Gece boyunca inkübasyon, hızlı ve zaman açısından verimli numune hazırlama ve analiz yapılmasını önler. Ek olarak, peletin bir santrifüj tüpünden bir kabuk şişesine kantitatif transferi (adım 3.4), kuru ağırlığa doğru bir normalleşme noktası sağlamak için özen ve sabır gerektiren zorlu bir işlemdir. Kullanıcının karşılaşabileceği olası sorunlar, peletin eksik transferi, pipet uçlarına ve orijinal tüpe yapışan ıslak çökeltilmiş proteinler ve pipet ucunu bloke eden pelet katı parçacıklarıdır. Peletin daha kolay aktarılmasına yardımcı olmak için pratik bir öneri, pipet ucunun ucundan yaklaşık 0,3-0,5 mm'yi bir çift makasla çıkarmak ve daha büyük pelet parçacıklarının çekilmesine ve kabuk şişesine salınmasına izin vermektir. Bu transfer yöntemi, tüm amino asit analizleri için protein ekstraksiyonu için yaygın bir uygulamadır. Bununla birlikte, peletin kabuk şişesine nicel olarak aktarılmasının verimliliğini ve doğruluğunu artırmak için yapılan değişiklikler araştırılmalıdır.
Amino asitleri proteine bağlı hallerinden serbest bırakmak için iki hidroliz tekniği formu kullanılabilir: sıvı faz hidrolizi ve asit-buhar hidrolizi. Numune üzerine 6 M HCl ilavesini içeren ve daha sonra gece boyunca 110 °C'lik bir fırına yerleştirilen sıvı fazlı hidroliz, bu protokolde açıklanan asit-buhar hidrolizine bir alternatiftir. Sıvı fazlı hidroliz kullanan ekstraksiyon teknikleri, özellikle AQC türevlendirmesi seçilirse,40'ı etiketlemek için temel koşullar gerektirdiğinden, tuzdan arındırma gibi daha fazla işlem gerektirebilir. Asit-buhar hidrolizi, tuzdan arındırmayı önler ve kullanıcıya, filtrasyondan önce son peletin yeniden sulandırılması üzerine türevlendirme tekniğini seçme özgürlüğü verir. Ayrıca, seçilen hidroliz yönteminden bağımsız olarak, numuneler, türevlendirme tekniği seçimine ve/veya analitik analize bağlı olarak matris saflaştırma ve konsantrasyon 29,47,48 için SPE gibi daha ileri işlemler gerektirebilir (örneğin, ters faz LC-MS/MS ve hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi [HILIC] LC-MS/MS 37 ). Bu protokolde 20 mM HCl'deki nihai peletin sulandırılması, ticari olarak temin edilebilen bir amino asit hidroliz kiti39 aracılığıyla PCF reaktifleri48 kullanılarak türevlendirme için uygundur (bkz. Hem AQC hem de PCF, numunede bulunan tüm amino asitleri, proteini ve protein olmayan kökeni türeyecektir ve analitlerin seçiciliği, LC-MS / MS kullanımı ve tutma süresi eşleşmesi kombinasyonu ve niceleyici ve niteleyici MRM'lerin dikkatli seçimi38 ile elde edilir. 
Mevcut hidroliz protokolleri, BMAA, 2,4-DAB ve AEG salınımı için değil, protein hidrolizi 32 için mevcut yöntemlere dayanan22 protein amino asidi için optimize edilmiştir; burada 18 saatten daha uzun süre inkübasyon, belirli amino asitlerin parçalanması ve modifikasyonu ile sonuçlanır, bu da LC-MS / MS analizini ve dolayısıyla elde edilen konsantrasyonlarıetkiler 32. Beach ve ark.49, BMAA ve proteinojenik amino asitleri analiz etmek için hidrolizi optimize etmek için zaman içinde (0.5-120 saat) hidrolizi araştırdı. Hidrolizin ilk 0.5 saatinde BMAA'nın erken hızlı bir şekilde salınmasına rağmen, hidroliz süresi arttıkça, 5 gün49'dan sonra bile, bozulmadan BMAA seviyelerinin artmaya devam ettiğini bulmuşlardır. Bağlı BMAA ve izomerlerinin gerçek doğası hakkında hala farklı görüşler ve sorular vardır, bazı çalışmalar BMAA'nın 50,51'i bağlaması veya proteinlere yanlış dahil edilmesi yerine14, BMAA-protein ilişkisinin yüzeysel olduğunu düşündürmektedir 52. Bununla birlikte, "bağlı" BMAA'nın analizindeki mevcut fikir birliği, amino asitleri ve dolayısıyla BMAA ve izomerlerini serbest bırakmak için peptitleri / proteinleri parçalayan doğrulanmış ve yaygın olarak kabul edilen hidroliz adımını gerektirir.
20 protein amino asidinin geri kazanım oranları, Sedgwick ve ark.42 tarafından TCA ekstraksiyonu kullanılarak yapılan bir çalışmada belirlendi ve yaklaşık% 100 iyileşme ile sonuçlandı. BMAA ve alg matrislerinden izomerleri söz konusu olduğunda, çeşitli ekstraksiyon çözücüleri kullanarak BMAA ekstraksiyonunun verimliliğini karşılaştıran çalışmalar,% 10 TCA'nın serbest BMAA27 için en verimli olduğunu bulmuştur. Sıvı faz hidrolizi kullanılarak ekstrakte edilen proteine bağlı BMAA için geri kazanım oranları, Glover ve ark.25 ve Faassen ve ark.53 tarafından yapılan çalışmalarda, doğruluğun çivili geri kazanım yöntemleriyle belirlendiği, ortalama BMAA geri kazanım oranının sırasıyla% 108.6 ve% 70 olduğu çalışmalarda belirlenmiştir. Faassen ve ark. başak kurtarma deneyleri için prosedürleri tanımladılar ve başak ekstraksiyon işleminin aşamasına bağlı olarak iyileşmenin nasıl değiştiğini gösterdiler53. Faassen ve ark. ayrıca burada sunulan asit-buhar protokolünün verimliliğini belirlemiş, ekstraksiyondan önce çivilenmiş BMAA izomerleri için% 83.6 ve hidroliz24'ten önce çivilenenler için% 68.6'lık geri kazanım oranları ile belirlenmiştir. Bu geri kazanımlar, ekstraksiyon yöntemleri ve analizler Banack 26 tarafından daha da doğrulandı, siyanobakteriyel bir matriste BMAA için% 94-106 iyileşme oranları ve% 5.6 ile% 20 arasında bir Göreceli Standart Sapma (RSD)% 5.6 ile%20 arasında, doğruluk için FDA kriterlerini karşıladı54. Her laboratuvarın bu protokolü başak kurtarma deneyleri yoluyla kullanmadan önce başlangıçta geri kazanım oranlarını ve doğruluğunu belirlemesi önerilir. Faassen ve ark.53 ve Glover ve ark.25'te sunulan iyileşme yöntemleri kılavuz olarak takip edilebilir.
Analitin proteine daha hızlı ekstraksiyonu için gece boyunca fırın hidrolizi yerine hidroliz tekniklerinin alternatif formları kullanılabilir. Örneğin, bir mikrodalga ekstraktör, hidroliz süresini 24 saatten 10 dakika55'e kadar önemli ölçüde azaltabilir. Amino asitler için mikrodalga hidrolizi, mikrodalga kabını oksijensiz bir ortamda hazırlamak ve monte etmek için bir torpido gözü kullanarak ve 6 M HCl ekleyerek geleneksel termal yöntemle aynı prensipleri kullanır. Hava geçirmez olduğunda, numuneyi içeren kap mikrodalga radyasyonuna maruz kalır. Mikrodalga hidrolizi, çeşitli numune matrislerinden amino asitleri çıkarmak için kullanılmıştır56,57,58; Bununla birlikte, BMAA'nın analizi için mikrodalga hidrolizi henüz geliştirilmemiş ve doğrulanmamıştır.
Sonuç olarak,% 10 sulu TCA protein çökeltmesi, siyanobakteriyel matrislerden serbest protein olmayan amino asitleri çıkarmak için en uygun yöntemdir27 ve termal hidroliz, proteine bağlı fraksiyonun güvenilir ve tekrarlanabilir bir ekstraksiyonunu sağlar. NPAA BMAA'yı ve izomerlerini siyanobakterilerden çıkarmak için kullanılan bu protokol doğrulanmıştır ve yaygın olarak kabul edilmektedir. BMAA'nın ekstraksiyonunu daha da optimize etmek için gelecekteki talimatlar, 22 protein amino asidinin özelliklerine göre gerçekleştirilen hidroliz adımına odaklanacaktır. Bununla birlikte, burada sunulan ekstraksiyon protokolü, BMAA'yı ve izomerlerini LC-MS / MS aracılığıyla analiz etmek için hala verimli ve etkili olarak kabul edilmelidir.

Amino asitler, en az bir amin ve karboksilik fonksiyonel grup içeren kimyasal bileşiklerdir. Bazı amino asitler ayrıca karboksilik dışında fonksiyonel bir asit grubu olan bir imino grubu içerir; Diğer amino asitler, α-karbon grubu1'e bağlı olmayan amin gruplarına sahiptir. 22'si ribozomal protein sentezinde genetik kodlama için kullanılan protein amino asitleri olarak bilinen 500'den fazla amino asit2 vardır 3. Bu 22 amino asit, esansiyel ve esansiyel olmayan olarak daha da alt bölümlere ayrılabilir. Esansiyel amino asitler, bir organizmanın düzgün çalışması için gereklidir ve sadece dış kaynaklar tarafından elde edilebilir. Esansiyel olmayan amino asitler organizma içinde sentezlenebilir. 22 amino asidin esansiyel / esansiyel olmayan olarak sınıflandırılması, bireysel türlere özgüdür. Diğer tüm amino asitler, protein sentezi için kodlanmamış protein olmayan amino asitlerdir (NPAA'lar). Amino asitler, ister protein ister protein dışı olsun, bir organizma içinde sinyal verme rolü oynayabilir ve metabolik aracılar olarak işlev görebilir4. Önemli ve değişen rolleri nedeniyle, amino asit seviyeleri organizma durumu, işlevselliği ve metabolik yolları vb. Hakkında bir fikir verebilir. Amino asitlerin bir polipeptit zincirine dahil edilebileceği iki ana mekanizma vardır: kodlamada 22 amino asidi kullanan ribozomal protein sentezi ve protein amino asitlerinin yanı sıra bazı NPAA'ların sentezde kullanılmasına izin veren ribozomal olmayan peptit sentezi. Bazı NPAA'lar protein amino asitlerini taklit edebilir ve potansiyel olarak peptitlere ve proteinlere yanlış dahil olmalarına neden olabilir. Yanlış birleşme, proteinlerin yanlış katlanmasına neden olur ve bu da, NPAA L-3,4 dihidroksifenilalaninin (L-DOPA) tirozin yerine yanlış dahil edilmesi, hücresel fonksiyonu ve sağlığı olumsuz yönde etkileyen zararlı etkilere sahiptir 5,7. Birleştirilmiş NPAA'ların ek bir kaynağı, amino asit kalıntılarının translasyonel sonrası modifikasyonu (PTM) yoluyladır. Amino asit kalıntıları, peptit veya protein konformasyonundaki değişiklikler, stabilite ve işlevsellik dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle modifiye edilir. PTM içeren protein veya peptitlerin hidrolizi üzerine, bu modifiye amino asit kalıntıları serbest NPAA formu 8,9'a salınır.
Siyanobakteriler, diatomlar ve dinoflagellatlar tarafından üretilen NPAA β-metilamino-L-alanin (BMAA)10, amiyotrofik lateral skleroz / parkinsonizm-demans kompleksi (ALS-PDC) 11,12, amiyotrofik lateral skleroz ve Alzheimer hastalığı 13 gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıklara katkıda bulunan bir faktör olarak rol oynayan şüpheli bir nörotoksindir. . BMAA'nın yanlışlıkla L-serin14 ve / veya diğer protein amino asitleri yerine proteinlerin polipeptit zincirine dahil edildiği öne sürülmektedir. BMAA'nın yanlış birleşmesi, proteinlerin yanlış katlanmasına yol açabilir ve bu da nöronlarda protein agregalarının birikmesine neden olabilir14. Son on yılda, BMAA'ya olan ilgi önemli ölçüde artmıştır. Tatlı su, deniz ve acı ortamlardan çok çeşitli siyanobakteriyel türlerin BMAA15'i ürettiği keşfedilmiştir ve bu da çeşitli ekosistemlere yaygın olarak dağılmalarına yol açmıştır16,17. Ek olarak, BMAA'nın gıda zinciri boyunca insan gıda ağına biyo-büyüteçleme yaptığı gösterilmiştir18,19. BMAA toksisitesinin potansiyel sağlık etkileri, anlayış eksikliği ve uyumsuzlukları nedeniyle, BMAA'nın toksisitesi nihai olarak anlaşılana veya BMAA'nın güvenli olduğu kabul edilene kadar daha fazla araştırmaya devam etmek zorunludur20,21.
Biyolojik numunelerdeki amino asitlerin analizi dört ana adıma ayrılabilir: numune hazırlama, amino asit türevlendirme, ayırma ve algılama ve tanımlama ve nicelleştirme. Sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS), amino asitlerin hedefli ve tekrarlanabilir bir şekilde ayrılmasını ve analizini sağladığı için tercih edilen analiz yöntemidir.
Siyanobakteriyel ve diğer alg örneklerini analiz etmek için numune hazırlama teknikleri, ağırlıklı olarak serbest ve proteine bağlı formlarındaki amino asitler için bir ekstraksiyon yöntemi içerir. Yıllar geçtikçe, ekstraksiyon yöntemleri, serbest amino asitleri bağlı formlarından ayırmak için numunenin çözülmesi, ardından protein çökeltilmesi ve bağlı amino asitlerin yüksek sıcaklıklarda hidroklorik asit (HCl) ile hidroliz yoluyla salınması da dahil olmak üzere ortak elementlerle nispeten tutarlı kalmıştır22 . Bu ekstraksiyon formu protein amino asitleri için optimize edilmiş ve NPAA'lar için kullanılmıştır. Bununla birlikte, aynı siyanobakteri türlerinde BMAA ve izomerlerinin (Şekil 1), aminoetilglisin (AEG) ve 2,4-diaminobütirik asidin (2,4-DAB) tespiti ve nicelleştirilmesi, literatürde tutarsız sonuçlar göstermiştir; büyüme koşullarındaki farklılıklarda ve / veya değişen miktarlarda BMAA23 üreten alglerin suşunda yatan olası bir açıklama bulunmaktadır. . BMAA ve izomerlerinin tespiti ve nicelleştirilmesindeki tutarsızlıklar için daha olası bir açıklamanın, doğrulanmamış deneysel protokollerden, çok çeşitli analitik tekniklerin kullanılmasından ve rapor edilen yöntemlerdeki yetersiz deneysel detaylardan kaynaklandığı iddia edilmiştir16,24 ve tekrarlanamaz laboratuvarlar arası verilere yol açmaktadır. Bununla birlikte, Glover ve ark.25 ve Banack 26, yakın zamanda, Uluslararası Analitik Kimyagerler Derneği (AOAC), ABD Farmakopesi ve tek laboratuvar doğrulaması için gerekli FDA kılavuzlarına uygun olarak, ultra performanslı sıvı kromatografisi (UPLC)-MS / MS kullanarak BMAA ve izomerlerinin tespiti ve nicelleştirilmesi için analitik bir teknik geliştirmiş ve doğrulamıştır.
Bu doğrulama deneyleri, BMAA ve izomerlerinin ayrılması ve tespitine odaklandı ve numune hazırlama protokollerindeki tutarsızlıkları ele almadı. Lage ve ark.27, siyanobakteriyel örneklerde BMAA ve izomerlerini ölçmek için üç yaygın ekstraksiyon yönteminin performansını LC-MS / MS aracılığıyla karşılaştırmıştır: serbest amino asitlerin katı faz ekstraksiyonu (SPE)28,29; metanol ekstraksiyonu ve aseton çökeltmesini içeren bir protein çökeltme yöntemi30; ve BMAA için en yaygın kullanılan ekstraksiyon yöntemi, trikloroasetik asit (TCA) ile protein çökeltme31. TCA protein çökeltmesinin optimal protokol olduğu ve test numunelerinde diğer ekstraksiyon yöntemlerine kıyasla daha yüksek BMAA konsantrasyonları sağladığı sonucuna varmışlardır. Çalışmaları, bir siyanobakteri matrisinde 6-aminokinolil-N-hidroksissüksinimidil karbamat (AQC) kullanılarak BMAA'nın türevleştirilmesiyle TCA ekstraksiyonunu doğrulamış ve güvenilir ve tekrarlanabilir BMAA verileri elde etmek için yerleşik bir kılavuz sağlamıştır. TCA amino asit ekstraksiyonu, diğer matrislere de uygulanabilen, kabul görmüş ve yaygın bir numune hazırlama tekniğidir. Bununla birlikte, hidroliz sırasında amino asidin stabilitesi, kimyasal değiştiricilerin ve indirgeyici ajanların kullanımı ile üstesinden gelinebilecek bozulma veya oksidasyonu önlemek için dikkate alınmalıdır32. TCA ekstraksiyonu rutin olarak kullanılır ve yeni araştırma öğrencilerine öğretilir ve protokol yaygın olarak rapor edilmesine rağmen, bu yöntemin uygulanmasında görsel bir yardım, uygun ve tutarlı bir şekilde yürütülmesini sağlayan değerli bir kaynaktır.
Ters faz kromatografisi, amino asitleri ayırmak için yaygın olarak kullanılır ve analizlerden önce bir türevlendirme adımı gerektirir. BMAA gibi amino asitlerin türevleştirilmesi, kromatografik retansiyona izin verir ve izomerler arasındaki çözünürlüğü artırabilir. Aynı zamanda moleküler kütleyi arttırır ve kütle spektrometresinde iyonizasyonu geliştirir. Propil kloroformat (PCF)33, 6-aminokinolil-N-hidrosisüksinimidil karbamat (AQC)27, 9-floresilmetil kloroformat (FMOC)34 ve dansil klorür (DC)35 dahil olmak üzere LC-MS / MS aracılığıyla amino asitlerin analizi için çeşitli türev reaktifler kullanılmıştır. Bununla birlikte, BMAA'yı analiz etmek için doğrulanmış tek teknikler, türev reaktifleri olarak PCF 36 veya AQC 24,26,37 kullandı.
Bu protokolün kapsamı, NPAA'ların siyanobakteriyel matrislerden TCA ekstraksiyonuna odaklanmıştır. Akademik ve endüstri araştırma laboratuvarlarında rutin olarak kullanılan ve öğretilen, ayrıntılarda kısa olabilecek el yazmalarına dayanan emek yoğun bir yöntemdir; Bu nedenle, bu protokol, model amino asit olarak serbest ve bağlı BMAA'nın analizi için numunelerin hazırlanmasında yer alan prosedür ve tekniklerin ayrıntılarını sağlar.

<table><tbody><tr><td>1 mL cam kabuk şişeleri</td><td>SHIMADZU</td><td>REST-24663</td><td></td></tr><tr><td>%10 TCA çözeltisi</td><td></td><td></td><td>%100 (a/h) ila %10 sulu TCA ile seyreltin;</td></tr><tr><td>% 100 TCA çözeltisi</td><td></td><td></td><td>TCA'yı aşağıdaki orana göre suda çözün: 2.2 g: 1 mL (TCA: H < alt > 2 < / alt > O)</td></tr> <tr><td>1000 &; mikro; L mikropipet</td><td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td><td>Z683809</td><td></td></tr><tr><td>%13,3 TCA çözeltisi</td><td></td><td></td><td>%100 (a/h) ila %13,3 sulu TCA ile seyreltin;</td></tr><tr><td>2 mL tüpler</td><td>MERCK</td><td>BR780546-500EA</td><td></td></tr><tr><td>20 mM HCl</td><td>Chem-Supply Pty Ltd</td><td>7647-01-0</td><td>Stoktan</td></tr><tr><td>üretilmiştir 20-200 ve mikro; L mikropipet</td><td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td><td>Z740441</td><td></td></tr><tr><td>6 M HCl</td><td>Chem-Supply Pty Ltd</td><td>7647-01-0</td><td>Stoktan üretilmiştir</td></tr><tr><td>%70 etanol</td><td>Supelco</td><td>1.11727</td><td>Seyreltik 70:1 Etanol:</td></tr> <tr><td>su-80 &�; C Dondurucu</td><td>Martin CHRIST</td><td>102142</td><td>Alpha 2-4 Ldplus</td></tr><tr><td>AccQ-Tag Ultra Türevlendirme Kiti&nbsp;</td><td>Sular</td><td>186003836</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Chem-Supply Pty Ltd</td><td>34967-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Analitik Terazi Dengesi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj evaporatör</td><td>Thermo Scientific</td><td>13442549</td><td>DNA120-115 SpeedVac Konsantratör</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>MERCK</td><td>EP022620100-1EA</td><td></td></tr><tr><td>D5-2,4-DAB standardı</td><td>CDN İzotopları</td><td>D-7568</td><td></td></tr><tr><td>Kurutma Fırını</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ez:faastTM Amino Asit Analiz</td><td>Kiti Phenomenex</td><td>CEO-8492</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tüp tutucu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tüpleri</td><td>MERCK</td><td>T2318-500EA</td><td>Greiner santrifüj tüpleri</td></tr><tr><td>Filtre Tüpleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8161-100EA</td><td>Corning Costar Spin-X santrifüj tüpü filtreleri (gözenek boyutu 0.22 &mu; m)</td></tr> <tr><td>Cam oymacı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidroliz şişesi ve Kapak</td><td>Eldex Laboratuvarları/Sular</td><td>WAT007568 & </td><td></td>WAT007569</tr><tr><td>Buz ve kap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tüy bırakmayan kağıt mendil</td><td>Kimwipes/Sigma-Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q su</td><td></td><td></td><td>18,2 M&Omega;. cm</td></tr><tr>Hortumlu <td></td><td></td><td></td><td>nitrojen musluğu</td></tr><tr><td>P1000 Mikropipet</td><td>MERCK</td><td>EP3123000063</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipet uçları</td><td>MERCK</td><td>Z740127</td><td></td></tr><tr><td>P200 Mikropipet</td><td>MERCK</td><td>EP3123000055-1EA</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipet uçları</td><td>MERCK</td><td>Z740125</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>MERCK</td><td>P7793</td><td>Sızdırmazlık filmi</td></tr><tr><td>KKD - gürültü önleyici kulaklıklar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KKD - fırın eldivenleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prob sonikatörü</td><td>QSONICA Sonicators</td><td>Q125 Sonicator</td><td>Lütfen tüm uygun KKD'lerin (yani gürültü önleyici kulaklıklar) olduğundan emin</td></tr> <tr><td>olun.ample: transfer spatulası</td><td></td><td></td><td></td>:</tr><tr><td>Trikloroasetik asit (TCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>: T6399-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hortumlu</td><td></td><td></td><td></td> Vakum Pompası</tr></tbody></table>

sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi analizi için siyanobakterilerden protein dışı amino asitlerin ekstraksiyonu

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Protein olmayan amino asitler (NPAA'lar), proteinlere translasyon için genetik olarak kodlanmamış büyük bir amino asit sınıfıdır (AA'lar). NPAA'ların analizi, hücresel alım ve / veya fonksiyon, metabolik yollar ve potansiyel toksisite hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. β-metilamino-L-alanin (BMAA), çeşitli alg türleri tarafından üretilen nörotoksik bir NPAA'dır ve önemli araştırma ilgisine yol açan nörodejeneratif hastalıklar için artmış bir risk ile ilişkilidir. Analiz için AA'ları çıkarmanın birçok yolu vardır, sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi en yaygın olanıdır, protein çökelmesini ve ardından protein peletinin asit hidrolizini gerektirir. Alg türlerinde BMAA'nın varlığı üzerine yapılan çalışmalar, doğrulanmamış numune hazırlama / ekstraksiyon ve analizinin birincil neden olması ile çelişkili sonuçlar vermektedir. Çoğu NPAA'da olduğu gibi,% 10 sulu TCA'da protein çökeltmesi ve dumanlı HCl ile hidroliz, BMAA ve izomerleri aminoetilgis (AEG) ve 2,4-diaminobütirik asit (2,4-DAB) için en uygun ekstraksiyon şeklidir. Mevcut protokol, araştırma ve öğretim laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan doğrulanmış bir NPAA ekstraksiyon yöntemindeki adımları açıklamaktadır.

Ayıklama protokolünün bir gösterimi, özetlenmiş bir başvuru kılavuzu olarak Şekil 2'de verilmiştir. Violi ve ark.38 tarafından elde edilen sonuçlar, siyanobakterilerden BMAA izomerlerinin analizi için bu ekstraksiyon protokolünden pozitif bir sonucu temsil etmek üzere seçilmiştir. 11 doğu Avustralya tatlı su bölgesinden on dokuz tek siyanobakteri türü kültürlendi. Aynı protokolü kullanarak, BMAA izomerleri serbest ve protein fraksiyonlarına ekstrakte edildi, PCF ile türetildi ve LC-MS / MS kullanılarak analiz edildi. siyanobakteriyel izolatların on yedisi BMAA için pozitifti ve 19'un tümü 2,4-DAB izomerini içeriyordu. Doğrulanmış bir LC-MS / MS yöntemi kullanılarak ve beklenen tutma süresinde biri niceleyici iyon ve ikisi niteleyici iyon olarak en az üç çoklu reaksiyon izleme (MRM) geçişi gözlemlenerek pozitif bir sonuç doğrulanır. BMAA ve izomerlerini içeren bir standardın temsili MRM kromatogramı, renk kodlu çizgilerle gösterilir, Şekil 3'te gösterilmiştir. Serbest ve bağlı fraksiyonlardaki BMAA ve izomer konsantrasyonunu göstermek için bölümlere ayrılmış 19 numunenin hepsinde BMAA ve izomerlerin varlığı ve konsantrasyonu Tablo 1'de özetlenmiştir. Liddell Gölü'nden (NSW, Avustralya) toplanan Merismopedia türlerinin serbest fraksiyonunda, serbest fraksiyonun 68.38 μg / g kuru ağırlık (DW) ± 2.25 μg / g DW, 2.4-DAB konsantrasyonunda 1.223.98 μg / g DW ± 20.7 μg / DWG konsantrasyonunda bir BMAA konsantrasyonu içerdiği üç izomerin tümü için pozitif bir tespit gözlenmiştir. ve 125.27 μg / g DW ± 4.19 μg / g DW konsantrasyonuna sahip AEG. Kromatografik MRM'ler Şekil 4'te gösterilmiştir. Bir numunede BMAA ve izomerleri için negatif bir sonuç göstermek için, Walka Su İşleri'nden (NSW, Avustralya) toplanan Microcystis flos-aquae türlerinin bağlı fraksiyonu Şekil 5'te kromatografik olarak sunulmuştur. Bağlı fraksiyon BMAA, 2,4-DAB ve / veya AEG içermezken, serbest fraksiyonu sırasıyla 79.86 μg / g DW ± 1.59 μg / g DW, 1.156.15 μg / g DW ± 8.46 μg / g DW ve 433.83 μg / g DW ± 8.92 μg / g DW konsantrasyonları ile üç izomerin tümünü içeriyordu.
Böylece, bu protokolün kullanılmasıyla, Violi ve ark.38 , doğu Avustralya tatlı su siyanobakterilerinde BMAA izomerlerinin varlığını doğruladı ve hangi siyanobakterilerin toksin üretme yeteneklerine sahip olduğunu belirledi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig01.jpg"> Şekil 1: BMAA ve izomerleri 2,4-DAB ve AEG'nin kimyasal yapısı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig02.jpg"> Şekil 2: Ekstraksiyon protokolünün özetlenmiş referans diyagramı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig03.jpg"> Şekil 3: Vurgulanan tepe noktaları ile gösterilen, tutma esasına dayalı izomer tanımlaması için D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA ve AEG içeren bir kalibrasyon standardının LC-MS/MS kromatogramı. Anahtar: D5-2,4-DAB 338,01 m/z &gt; 6,4 dakikada 278,10 m/z (kırmızı), 2,4-DAB 333,01 m/z &gt; 6,4 dakikada 273,10 m/z (yeşil), 7,4 dakikada AEG 333,01 m/z &gt; 88,00 m/z (turuncu) ve 7,8 dakikada 187,10 m/z (mavi) &gt; BMAA 333,01 m/z. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig04.jpg"> Şekil 4: Liddell Gölü'nden (NSW, Avustralya) toplanan Merismopedia türlerinde D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA ve AEG'yi tespit etmek için LC-MS / MS kromatogramı, vurgulanan zirvelerle gösterilir. Anahtar: D5-2,4-DAB 338,01 m/z &gt; 6,4 dakikada 278,10 m/z (kırmızı), 2,4-DAB 333,01 m/z &gt; 6,4 dakikada 273,10 m/z (yeşil), 7,4 dakikada AEG 333,01 m/z &gt; 88,00 m/z (turuncu) ve 7,8 dakikada 187,10 m/z (mavi) &gt; BMAA 333,01 m/z. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig05.jpg"> Şekil 5: Walka Su İşleri'nden (NSW, Avustralya) toplanan Microcystis flos-aquae türlerinin bağlı bir fraksiyonunda 2,4-DAB, BMAA ve AEG için negatif bir kontrolün LC-MS / MS kromatogramı. Anahtar: D5-2,4-DAB 338,01 m/z &gt; 6,4 dakikada 278,10 m/z (kırmızı - tepe noktası vurgulanmış), 2,4-DAB 333,01 m/z &gt; 6,4 dakikada 273,10 m/z (yeşil), 7,4 dakikada AEG 333,01 m/z &gt; 88,00 m/z (turuncu) ve 7,8 dakikada 187,10 m/z (mavi) &gt; BMAA 333,01 m/z. Kesikli çizgiler, eksik 2,4-DAB, AEG ve BMAA için bekletme sürelerini temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Siyanobakteriyel izolatlarda BMAA, AEG ve 2,4-DAB konsantrasyonları. Konsantrasyonlar ortalamanın standart hatasını ± (n = 3). ND algılanmadığını gösterir. Tespit edilen her izomerin en yüksek konsantrasyonu yeşil renkle vurgulanır. Tablo, Violi et al.38'in değiştirilmiş bir versiyonudur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779_Table%201.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Bu protokol, sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi kullanılarak analiz edilmeden önce trikloroasetik asit (TCA) protein çökeltmesi ve asit hidrolizi yoluyla biyolojik matrislerden protein olmayan amino asitlerin ekstraksiyonunu açıklamaktadır.

Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometrisi Analizi için Siyanobakterilerden Protein Dışı Amino Asitlerin Ekstraksiyonu

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...

Bu protokol, kullanıcılara yardımcı olacak ve öğrencilere BMA, AEG ve 2, 4-DAB'ın çıkarılmasında doğru adımları öğretecektir. Böylece hata olasılığını en aza indirir ve tutarlı sonuçlar üretir. Bu yöntem, BMA ve izomerlerinin, AEG ve 2, 4-DAB'ın sauna bakteri matrisinde ekstraksiyonu için yaygın olarak kullanılan ve doğrulanmış bir yöntemdir.Bu yöntem, BMA'ların toksisitesi ile ilgili daha fazla araştırma yapmak ve BMA ve ilişkili sağlık etkileri hakkında daha fazla bilgi sağlamak için kullanılabilir. Siyanobakteri örneğini 25 santigrat derecede 10 dakika boyunca 3.500 G'de merkezleyerek başlayın. Ve süpernatantı biyolojik atıklara atmak.Pelet içeren santrifüj tüpünü bir sızdırmazlık filmi ile örtün ve keskin bir uzun burun cımbızı kullanarak filmdeki birkaç deliği delin. Ardından tüpü eksi 80 santigrat derecede dik olarak saklayın. 30 dakika sonra, tüpü dik bir şekilde dondurarak kurutucu cam bir kaba yerleştirin ve kabı soğutma için beş dakika boyunca eksi 80 santigrat derece dondurucunun içine yerleştirin.Cam kabı dondurucudan çıkarın ve lastik kapağı takın. Dondurarak kurutucunun kauçuk valf çıkışındaki tutamağın yukarı baktığından ve atmosfere havalandırıldığından emin olun. Cam kabı sıkıca takın.Kavanozu vakuma maruz bırakmak için lastik valf çıkışının kolunu yavaşça aşağı doğru çevirin. Ve tüm sıvıyı süblimleştirmek için 24 saate kadar dondurarak kurumaya bırakın. İşiniz bittiğinde, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 15 ila 50 miligram dondurulmuş numune peletini tartın.Analitik terazi kullanma. Numuneye, 300 ila 600 mikrolitre% 10 sulu Trikloroasetik asit veya TCA ekleyin. Numune tüplerini ezilmiş buzla dolu bir kaba yerleştirin.Sonik probu, probun ucunu numuneye tamamen batırmadan ve başlat düğmesine basmadan önce% 70 etanol püskürtülen tüy bırakmayan bir kağıt mendille silin. İşiniz bittiğinde, santrifüj tüpünü içeren numuneyi bir dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ve hücre lizisini sağlamak için sonikasyon işlemini tekrarlayın.Numuneyi 24 saat boyunca dört santigrat derecede soğuttuktan sonra. Sekiz santigrat derecede 15 dakika boyunca 3.500 G'de santrifüj. Daha sonra bir mikro pipet kullanarak, süpernatantı serbest fraksiyon etiketli iki mililitrelik bir tüpe aktarın.Numune peletine 400 mikrolitre %10 sulu TCA ekleyin ve peleti vorteks ajitasyonu veya mikro pipet ucu ile parçalayın. Santrifüj yapın ve süpernatantı aynı iki mililitrelik serbest fraksiyon tüpüne aktarın. %10 TCA asetonunu kullanarak bu adımı üçüncü kez tekrarlayın.Serbest fraksiyon tüpünü, kapağı açık olacak şekilde, tüm uçucu sıvı çıkarılana kadar santrifüjlü bir evaporatöre yerleştirin. Numune uçucu sıvılardan arındırıldıktan sonra, tüpü tavan filmi ile güvenli bir şekilde örtün ve keskin bir uzun burun cımbızı kullanarak filmi birkaç delikle delin. Daha önce gösterilen dondurarak kurutmadan sonra, numuneyi 200 mikrolitre 20 milimolar hidroklorik asit ile yeniden oluşturun ve eksi 80 santigrat derece dondurucuya yerleştirin.Bir mikro pipet kullanarak numune peletine 400 mikrolitre %100 aseton ekleyin ve vorteks ajitasyonu veya mikro pipet ucu kullanarak peleti parçalayın. Yıkanmış ve yeniden askıya alınmış peleti kantitatif olarak ilgili cam kabuk şişesine aktarın. Bir mililitrelik mikro pipet kullanarak.Kalan peletin aktarılmasına yardımcı olmak için numune tüpüne 400 mikrolitre aseton daha ekleyin. Pelet çıkarılana ve pelet kuruyana kadar peleti santrifüjlü bir evaporatörde kurutmadan önce süpernatant sıvıyı santrifüj yapın ve biyolojik atık haline getirin. Vakumlu hidroliz dosyasını hazırlamak için, hidroliz dosyasının altına bir mililitre altı molar hidroklorik asit ekleyin.Kurutulmuş numunelerle etiketlenmiş kabuk şişelerini, dik ve stabil bir pozisyon sağlayan cımbız kullanarak hidroliz dosyasına dikkatlice yerleştirin. Kapağı hidroliz dosyasına takın ve valfi kapatmak için kapaktaki kırmızı düğmeyi itin. Vakum pompasını açtıktan sonra, vakum tüpünü hidroliz dosyası kapağının kafasına takın ve vanayı açmak için kapaktaki yeşil düğmeye basın.Ardından, vakum pompasının havayı şişeden bir dakika boyunca çıkarmasına izin verin. Ardından, hidroliz şişe kapağındaki kırmızı düğmeyi bastırarak şişeyi kapatın. Vakum pompasını kapatın ve vakum tüpünü çıkarın.Laboratuvar tezgahındaki azot gazı musluğuna kauçuk bir tüp takın. Ve musluğu hafifçe açın. Başparmağınızı tüpün sonuna yerleştirin, kapatın ve basınç biriktikçe gaz kaçmaya başlayana kadar sayın.Ardından, kauçuk borunun diğer ucunu hidroliz şişe kapağının kafasına takın. Ve hemen kapağın yeşil düğmesini itin. Gazın kaçması için geçen süreyi sayın.Kapaktaki kırmızı düğmeyi hızla itin ve lastik tüpü çıkarın. Tüm vakum işleme işlemini iki kez tekrarlayın. Cam hidroliz şişesinin havasız olmasını ve azot gazı ile doldurulmasını sağlamak.Hidroliz şişesini 16 ila 18 saat boyunca 110 santigrat derecede ayarlanmış önceden ısıtılmış bir fırına yerleştirin. Fırın eldivenlerini kullanarak, cam hidroliz şişesini fırından çıkarın. Şişenin duman davlumbazının içinde 10 dakika soğumasını bekleyin ve yeşil düğmeyi iterek basınç ve gazı serbest bırakmak için uzağa bakacak şekilde itin.Hidrolize numune peletlerini 200 mikrolitre 20 molar hidroklorik asit ile kabuk şişesine yeniden oluşturun ve peleti yeniden askıya alın. Yeniden yapılandırılmış numune peletlerini içeren kabuk şişelerini 5, 300 G ve 25 santigrat derecede iki dakika boyunca santrifüj edin. Yeniden yapılandırılmış serbest fraksiyon numunelerini ve protein fraksiyonunu, 0,2 mikron gözenek membran filtreleri içeren ve serbest fraksiyon ve protein fraksiyonu olarak etiketlenmiş iki mililitrelik filtre tüplerine aktarın.Santrifüjleme için tüpleri 30 dakika boyunca 5.000 G ve 25 santigrat derecede yerleştirin. Beta-Metilamino-L-alanin veya BMAA içeren bir standardın çoklu reaksiyon izleme kromatogramı ve renk kodlu çizgilerle belirtilen izomerleri burada gösterilmiştir. Üç izomer, BMAA, DAB ve AEG için pozitif bir tespit, Liddel Gölü'nden toplanan Merismopedia türlerinin serbest fraksiyonunda gözlendi.Waka Waterworks'ten toplanan Microcystis flos-aquae türlerinin bağlı fraksiyonu, BMAA ve izomerleri için olumsuz bir sonuç göstermiştir. Yeniden askıya alınan pelet, Siyanobakteri kütlesine dayanan doğru bir normalleşme noktasına izin vermek için ilgili kabuk şişesine kantitatif olarak aktarılmalıdır. Bu adım gerçekleştirilirken hastalara ve durum tespitine dikkat edilmesi önerilir.Bu prosedürü izleyerek. Ekstrakte edilen fraksiyonların ters faza izin vermek için bir devitalizasyon adımından geçmesi gerekecektir. Sıvı kromatografisi, tandem kütle spektrometresi analizi.Bu tekniğin uygulanması çeşitli bilimsel alanları genişletir. Çevresel örneklerde sinotoksinlerin analizi yoluyla çevre bilimlerinin dahil edilmesi. Ve BMA'nın Yanlış Birleştirme teorisinin araştırılması yoluyla toksikoloji ve biyokimya gibi alanlar.

extraction-non-protein-amino-acids-from-cyanobacteria-for-liquid

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

13 C-izotop etiketleme çeşitli türleri için mikroorganizmaların hücre merkezi metabolizma belirlenmesi için yararlı bir tekniktir. Hücreleri belirli bir substrat ile etiketli kültüre edildikten sonra, GC-MS ölçüm aminoasittir benzersiz etiketleme desen dayalı işlevsel metabolik yollar ortaya çıkarabilir.

Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif 13</supAminoasittir> C-etiketleme

Hücreleri stres koşullarına karşılaştığınızda Reaktif oksijen türlerinin seviyesi yükselir. Burada, 3'-3 'diaminobenzidin lekelenmesi örneğin yanı sıra redoks proteom profil cysTMT etiketleme ve kütle spektrometrisi...

İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil

Kaynak: Samuels, D. J. ve diğerleri. Staphylococcus aureus'un metabolit analizi için Tandem Sıvı Kromatografi–Kütle Spektrometrisi Tabanlı Yaklaşım. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, S. aureus'tan hücre içi metabolitleri tanımlamak ve nicelendirmek için sıvı kromatografi-kütle spektrometrisinin kullanımını göstermektedir. Metabolit ekstraksiyonu, peptid normalizasyonu, sıvı kromatografi ve kütle spektrometrik analizinde yer alan adımları özetlemektedir.

S. aureus'tan Metabolitlerin Analizi İçin Sıvı Kromatografi–Kütle Spektrometrisi Temelli Yaklaşım

Bu protokol, deniz suyundan toplanan mikrobiyal biyokütleden protein ve DNA'nın ekstraksiyonu ve konsantrasyonu ve ardından tandem kütle spektrometresi tabanlı proteomik analiz için uygun triptik peptitlerin üretilmesi içindir.

Bir Aquatic Mikrobiyal Metaproteomics İş Akışı: Tandem Kütle Spektrometre tabanlı analiz için uygun Triptik Peptitler için Hücreleri itibaren

Burada, sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi ile, Staphylococcus aureus ve bunların daha sonraki analiz metabolitlerin ekstraksiyonu için bir protokol açıklar.

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım<em&gt; Stafilokok aureus</em

Bu iletişim kuralı metabolizma birden çok besin kaynaklarının nicelik ve kapsamlı bir şekilde araştırmak için deneysel bir işlem açıklanır. İzotopik izleyici deneyleri ve analitik bir yordam, bir kombinasyonuna göre bu iş akışı, tüketilen besin kaderi ve molekülleri synthetized metabolik kökenli mikroorganizmalar tarafından belirlenecek sağlar.

Birden çok besin kaynaklarının mikrobiyal metabolizma araştırmaya izotopik izleyici deneyler kombinasyonuna göre iş akışı

Burada, siteye özgü protein asetilasyon ve/veya succinylation İskan izni (stoichiometry) sonra sunulan değişiklikler için endojen değişiklikler ratiometric analizi ile tüm bir Proteom, tarafsız miktar mevcut nicel kimyasal asilasyonu kararlı izotop etiketli anhidritler kullanarak. Hassas verileri bağımsız edinme kütle spektrometresi ile birlikte, doğru site doluluk ölçümler elde edilir.

Siteye özel Protein lizin asetilasyon ve Succinylation veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanılarak Stoichiometry miktar

Çoklu biyomoleküllerin sistem çapında analiz biyolojik süreçlere işlevsel ve mekanik anlayışlar elde etmek için çok önemlidir. Bu konuda geniş bir protokol, senkronize Chlamydomonas kültüründen toplanan tek bir örnekten lipidler, metabolitler, proteinler ve nişasta yüksek verimlilik ekstraksiyonu için tanımlanmıştır.

Yeşil Alga Chlamydomonas reinhardtii eşitlenmiş kültürlerin derinlemesine analizi için Multi-Omics ekstraksiyon yöntemi

Burada, hücre siz protein sentezi reaksiyonlarında merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 bileşiği ölçmek için sağlam bir protokol salıyoruz. Hücresiz sentez karışımı ters fazlı sıvı kromatografi kullanılarak etkili ayrıştırma için anilin ile türevize edilir ve daha sonra izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar kullanılarak kütle spektrometresi ile ölçülür.

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Siyanobakteri çiçeklenmelerinin ve ilişkili siyanotoksinlerin erken tespiti için hızlı multidisiplinerstrateji burada açıklanmıştır. Su örneklerinde ve bivalve numuneler gibi organik matrislerde siyanobakterilerin ve ilgili siyanotoksinlerin 24 saat içinde tespit edilmesine izin verir.

Hızlı Algılama Stratejisi Kullanılarak Siyanobakteri Çiçeklenmelerinin ve İlişkili Siyanotoksinlerin Erken Tespiti

Protokoller, karmaşık lisat bazlı hücre içermeyen sistemlerde metabolik reaksiyonları incelemek için kırma indeksi veya kütle spektrometrik tespiti ile birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemlerini açıklar.

Sıvı Kromatografisi, Lysate Tabanlı Hücre içermeyen Sistemlerde Metabolit Profilleme için Kırılma İndeksi veya Kütle Spektrometrik Algılaması ile Birleştirilmiştir

Öğrenin, sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi ile siyanobakterilerden protein dışı amino asitlerin ekstraksiyonunu. Bu yöntem, BMA ve izomerlerinin güvenilir analizi için toksisite araştırmalarına destek sağlar.

Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometrisi Analizi için Siyanobakterilerden Protein Dışı Amino Asitlerin Ekstraksiyonu

Daha fazla video keşfet