Name: İnsan pluripotent kök hücrelerinin besleyici hücreler üzerinde etilendiamintetraasetik asit aracılı yapışma ile hızlı, uygun maliyetli, enzimsiz geçişi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Öğrenin, besleyici hücreler üzerinde EDTA aracılı yapışma ile insan pluripotent kök hücrelerinin hızlı ve uygun maliyetli enzimsiz geçiş yöntemini. Bu teknik hücre hasarını azaltır ve pluripotensiyi korur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ön deneyler sırasındaki yardımları için Lars Moen'e ve tesislerin kullanımı için Oslo Üniversitesi Hastanesi Norveç Kök Hücre Araştırma Merkezi'ndeki İnsan Pluripotent Kök Hücreleri için Norveç Çekirdek Tesisi'ne teşekkür ederiz. H9 hESC hattı WiCell'den, HS429 hESC hattı ise Karolinska Enstitüsü'ndeki Outi Hovatta'dan elde edildi. Her ikisi de Malzeme Transfer Anlaşmalarına uygun olarak kullanılmıştır. NCS001 ve NCS002 hiPSC hatları, İnsan Pluripotent Kök Hücreleri için Norveç Çekirdek Tesisi tarafından üretildi. Bu yeniden programlama ve burada bildirilen tüm çalışmalar, Güneydoğu Norveç Bölgesel Etik Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir (onay REK 2017/110).

Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. İnsan fibroblast hücrelerinin yetiştirilmesi ve besleyici hücre tabakasının hazırlanması
<ol><li>Her bir T-75 kültür şişesi başına (ihtiyaç duyulduğunda şişe sayısı) 0.5 ×10 6 insan sünnet derisi fibroblastı (bundan böyle "besleyici hücreler" olarak anılacaktır) 20 mL Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) ile (w/)% 10 fetal sığır serumu (FBS), bundan sonra "besleyici hücre ortamı" olarak adlandırılacaktır.</li>
	<li>Besleyici hücreler %90 birleşmeye ulaştığında, ortamı çıkarın ve ortamdaki faktörler tarafından tripsinin inhibisyonunu önlemek için şişe başına 10 mL Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile 3 kez yıkayın. Her şişeye 2 mL tripsin-EDTA ekleyin ve şişe(ler)i 37 °C/%5CO2 inkübatöre 5 dakika veya besleyici hücreler şişe(ler)den ayrılana kadar yerleştirin. Mikroskop altında hücrelerin ayrılmasını yüzen hücre kümeleri veya tek hücreler olarak gözlemleyin.</li>
	<li>Tripsin-EDTA'yı etkisiz hale getirmek için her şişeye 5 mL taze önceden ısıtılmış besleyici hücre ortamı ekleyin ve pipetleme yoluyla besleyici hücreleri nazikçe askıya alın.</li>
	<li>Besleyici hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü kapatın ve besleyici hücreleri 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyerek peletleyin.</li>
	<li>Besleyici hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın. Daha sonra, peleti 4 mL taze besleyici hücre ortamında dikkatlice yeniden süspanse edin. Bir hücre sayma odası veya başka bir hücre sayma aparatı kullanarak saymadan önce besleyici hücrelerin iyice yeniden süspanse edildiğinden emin olun.</li>
	<li>Genişleme için gerekli sayıda yeni T-75 kültür şişesine 0,5 ×10 6 besleyici hücre ekleyin ve her şişeye 20 mL taze besleyici hücre ortamı ekleyin. Besleyici hücreler %90 birleşmeye ulaşana kadar kültür şişelerini 37 °C/%5CO2 inkübatörde inkübe edin. NOT: Besleyici hücreler en az 25. geçişe kadar kullanılabilir.</li>
	<li>hESC'lerin/hiPSC'lerin kültürlenmesi için kullanılacak 35 mm'lik doku kültürü kaplarının sayısı için gereken besleyici hücre sayısını hesaplayın. NOT: Genellikle, doku kültürü kabı başına 3.0 ×10 5 besleyici hücre, birleşik bir besleyici hücre tabakası oluşturmak için yeterlidir.</li>
	<li>Besleyici hücrelerin çoğalmasını önlemek için, iki yoldan biriyle mitotik olarak tutuklandıklarından emin olun. NOT: Her iki yöntem için, büyük miktarda mitotik olarak tutuklanmış besleyici hücreler oluşturulabilir ve daha sonra kullanılmak üzere alikotlarda dondurulabilir.<ol><li>İhtiyaç duyulan tüm besleyici hücreleri 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktararak ve besleyici hücre ortamı ile toplam 5 mL hacme kadar doldurarak gama ışınlaması ile mitotik tutuklama gerçekleştirin. Hemen oda sıcaklığında bir gama ışınlama makinesine taşıyın ve besleyici hücreleri mitotik olarak tutuklamak için ışınlayın (20 dakika boyunca 300 kV ve 10 mA). NOT: Taşımadaki bir gecikme, besleyici hücrelerin 50 mL'lik santrifüj tüpünün duvarına istenmeyen şekilde bağlanmasına neden olabilir. Taşıma birkaç dakikadan fazla sürüyorsa, boruyu sürekli çalkalayarak besleme hücrelerinin taşıma sırasında askıda kalmasını sağlayın.</li>
		<li>5 mL besleyici hücre ortamında ihtiyaç duyulan tüm besleyici hücreleri 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktararak mitomisin C kullanarak mitotik tutuklama gerçekleştirin ve ardından 20 μg/mL mitomisin C içeren 15 mL besleyici hücre ortamı ekleyin ve 37 °C /% 5 CO2 inkübatörde 3 saat inkübe edin. 20 mL 37 °C PBS ekleyin, hücreleri 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleme ile peletleyin, PBS yıkamasını iki kez daha tekrarlayın ve besleyici hücre ortamında yeniden süspanse edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Besleyici hücreler mitotik olarak tutuklandıktan sonra, doku kültürü başlığına geri dönün ve besleyici hücreleri aşağıdaki gibi 35 mm doku kültürü kabı başına 3.0 ×10 5 hücrede plakalayın. Besleyici hücrelerin tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olun, mL başına 1.5 × 105'lik bir besleyici hücre konsantrasyonuna ulaşmak için besleyici hücre ortamı ekleyin ve her 35 mm'lik doku kültürü kabına bu besleyici hücre süspansiyonundan 2 mL ekleyin.</li>
	<li>Kültür kaplarını 37 °C/%5CO2 inkübatöre aktarın. Besleyici hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için, kültür kaplarını inkübatör rafında yavaş ama sıkı bir şekilde 3x ileri ve geri hareket ettirin, ardından bir duraklama yapın ve ardından aynı işlemi soldan sağa 3x gerçekleştirin. Bulaşıkları tekrar hareket ettirmeyin ve inkübatör kapağını yavaşça kapatın.</li>
	<li>24 saat sonra, besleyici hücre ortamından% 10 serum replasmanı (SR) ile IMDM'ye geçin. Bu ortamı daha sonra her üç günde bir değiştirin. Besleyici hücreler ilk 3 günden sonra kullanıma hazırdır.</li>
</ol>2. hESC veya hiPSC kolonilerinin mekanik hasadı
<ol><li>%80 Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM), %20 SR, 1 mM glutamin ikamesi 100x, 1 mM esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 1 mM penisilin/streptomisin (P/S), 0.1 mM 2-merkaptoetanol ve 10 ng/mL bazik fibroblast büyüme faktöründen (bFGF) oluşan hESC ortamını önceden ısıtın. hESC ortamı, besleyici hücrelerdeki hESC'lerin veya hiPSC'lerin kültürü için kullanılır.</li>
	<li>Mitotik olarak tutuklanmış besleyici hücreler içeren taze 35 mm'lik doku kültürü kaplarını alın ve hESC/hiPSC kolonilerinin transferinden en az 30 dakika önce besleyici hücre ortamını bFGF içeren 1,2 mL hESC ortamı ile değiştirin.</li>
	<li>Bir laminer akış başlığı içine yerleştirilmiş 10x büyütmeli bir mikroskop altında mitotik olarak tutuklanmış besleyici hücrelere hESC / hiPSC kolonileri içeren bir kültür kabı yerleştirin. Her koloninin çevresini dikkatlice kesmek için steril bir neşter kullanın ve ardından her koloniyi kabaca 5-6 eşit parçaya bölün. Koloni parçalarını neşter bıçağının ucuyla dikkatlice kaldırın, böylece besleyici hücre katmanından ayrılırlar ve ortamda serbestçe yüzerler.<ol><li>Bir koloni içindeki hESC'lere/hiPSC'lere kıyasla daha az belirgin çekirdeğe sahip daha küçük hücre adaları olarak görünen, farklılaşan hücreler içeren koloni bölgelerinden kaçınmaya çalışın.</li>
	</ol></li>
	<li>Serbestçe yüzen kolonileri 1 mL'lik bir pipetle besleyici hücreleri içeren yeni kültür kaplarına aktarın. Kolonileri ayrı tutmaya çalışın, böylece daha sonra birbirlerine dönüşmezler. Kültür kaplarını dikkatlice bir hücre inkübatörüne taşıyın ve ertesi güne kadar bulaşıkları rahatsız etmekten kaçının.</li>
	<li>Ertesi gün, bFGF içeren 600 μL hESC ortamını 1.8 mL'lik bir son hacme dikkatlice ekleyin. hESC + bFGF ortamını her gün bir sonraki geçişe kadar (genellikle 1 hafta sonra) değiştirin.</li>
</ol>3. EDTA aracılı yapışma bozukluğu kullanılarak hESC veya hiPSC kolonilerinin toplanması
<ol><li>Mitotik olarak tutuklanmış besleyici hücrelere sahip taze kültür kapları alın ve kolonilerin transferinden en az 30 dakika önce %10 SR ile IMDM'den 1,2 mL önceden ısıtılmış hESC + bFGF ortamına geçin.</li>
	<li>Bir seferde hESC veya hiPSC kolonileri içeren bir kültür kabı kullanın. hESC + bFGF ortamını çıkarın ve olası bağlanmamış hücreleri ve hücre kalıntılarını ortadan kaldırmak için kolonileri 1 mL oda sıcaklığında DPBS ile yıkayın. 1 mL 0,5 mM EDTA ekleyin ve 37 °C'de 1 dakika inkübe edin. Laminer akış başlığında bir ısıtma plakası varsa, daha iyi yapışma için bu adımı ve ısıtma plakası üzerindeki bölüm 4'teki adımları gerçekleştirin.</li>
	<li>1 dakikalık inkübasyondan sonra, EDTA çözeltisini çıkarın ve 1 mL'lik bir pipet kullanarak dikkatlice 1 mL hESC + bFGF ortamı ekleyin. Kolonileri besleyici hücre katmanından serbest bırakmak için aynı pipetle hafifçe ezin. Besleyici hücre tabakası gevşeyip ayrı bir küme halinde kendi üzerine katlanana kadar dikkatlice ezmeye devam edin. Pipet ucuyla besleyici hücre katmanını çekin.</li>
	<li>Askıda olan hESC/hiPSC kolonilerini yeni bir 1 mL pipet ile besleyici hücreleri ve hESC + bFGF ortamını içeren yeni kültür kaplarına 1:5 oranında bölerek aktarın. Koloniler, her yeni kültür kabı içinde eşit olarak dağılma eğilimindedir, ancak çanağı nazikçe bir yandan diğer yana hareket ettirerek bunu kolaylaştırır. hESC + bFGF ortamını her gün bir sonraki geçişe kadar (genellikle 1 hafta sonra) değiştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Skottman, H., Hovet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Culture conditions for human embryonic stem cells.</a> Reproduction. 132 (5), 691-698 (2006).</li>
<li>Hovatta, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 18 (7), 1404-1409 (2003).</li>
<li>Desai, N., Rambhia, P., Gishto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell+cultivation%3A+historical+perspective+and+evolution+of+xeno-free+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell cultivation: historical perspective and evolution of xeno-free culture systems.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 9(2015).</li>
<li>Villa-Diaz, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+polymer+coatings+for+long-term+growth+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthetic polymer coatings for long-term growth of human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 581-583 (2010).</li>
<li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFb+superfamily+signaling+regulates+the+state+of+human+stem+cell+pluripotency+and+capacity+to+create+well-structured+telencephalic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TGFb superfamily signaling regulates the state of human stem cell pluripotency and capacity to create well-structured telencephalic organoids.</a> Stem Cell Reports. 17 (10), 2220-2238 (2022).</li>
<li>Garitaonandia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+risk+of+genetic+and+epigenetic+instability+in+human+embryonic+stem+cells+associated+with+specific+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions.</a> PLoS One. 10 (2), e0118307(2015).</li>
<li>Inzunza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+in+serum+replacement+medium+using+postnatal+human+fibroblasts+as+feeder+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells.</a> Stem Cells. 23, 544-549 (2005).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Rivera, T., Zhao, Y., Ni, Y., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-induced+pluripotent+stem+cell+culture+methods+under+cGMP+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human-induced pluripotent stem cell culture methods under cGMP conditions.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 117(2020).</li>
<li>Castro-Viñuelas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tips+and+tricks+for+successfully+culturing+and+adapting+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Tips and tricks for successfully culturing and adapting human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 23, 569-581 (2021).</li>
<li>Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+maintenance+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Derivation and maintenance of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 873, 69-90 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
</ol>

Joel C. Glover direktör ve Hege Brincker Fjerdingstad, Norveç İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Çekirdek Tesisi'nin günlük yöneticisidir. Yazarların ifşa etmek için rekabet eden mali çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.

EDTA aracılı yapışma bozukluğu kullanılarak besleyici hücreler üzerinde kültürlenen hESC'lerin ve hiPSC'lerin hasat edilmesi için hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem tanımladık ve bunu öncelikle bir neşter kullanarak geleneksel mekanik hasat yöntemiyle karşılaştırdık. Ayrıca, EDTA bazlı hasadı, yöntemin hızı açısından enzimatik hasatla karşılaştırdık, ancak ortaya çıkan koloni kalitesinin yönlerine göre karşılaştırmadık. Bunun nedeni, enzimatik hasadın doğası gereği daha değişken olması ve yöntemler arası farklılıkları gizleyebilecek daha yüksek bir genomik sapmaprevalansı 5 ile bağlantılı olmasıdır.
EDTA bazlı hasadın diğer yöntemlerden daha hızlı ve daha verimli olduğunu ve mekanik hasattan daha küçük ve morfolojik olarak daha homojen koloniler ürettiğini gösteriyoruz. Bu ikinci özellik, hücre sağkalımı açısından faydalıdır, çünkü mekanik hasatla elde edilen daha büyük kümeler merkezi nekroza eğilimlidir, enzimatik sindirim ise apoptoza daha yatkın olan ve hayatta kalmak için örneğin ROCK inhibitörleri ile ekstra tedavi gerektiren izole hESC'ler ve hiPSC'ler üretme eğilimindedir. EDTA bazlı hasat en az 20 geçiş için kullanılabilir. EDTA bazlı ve mekanik hasat yöntemleri, koloni hücre yoğunluğu, mRNA ve kök genlerinin protein ekspresyonu, embriyoid cisimlerdeki üç germ tabakasının farklılaşması ve genomik anormallikler söz konusu olduğunda karşılaştırılabilir. Amaç verimlilik, daha yüksek verim, daha az değişkenlik ve hESC'lerin ve hiPSC'lerin daha nazik kullanımı ise, EDTA bazlı hasat tercih edilir.
Ayrıca, besleyici hücrelerde kültürlenen hESC'lerin ve hiPSC'lerin EDTA bazlı hasadının, daha saf bir durumu korumanın ucuz bir yolu olduğunu ve bunun arzu edildiği durumlarda besleyici tabanlıdan besleyicisiz kültüre yumuşak bir geçiş sağladığını da not ediyoruz.
Protokol içindeki kritik adımlar EDTA aracılı yapışmanın en kritik adımları, protokol bölüm 3 (EDTA çözeltisinde inkübasyon) ve bölüm 4'tür (öğütme). EDTA çözeltisine maruz kalma 1 dakikadan uzunsa, tek hücrelere tamamen ayrışma riski artar. Bu, öğütme çok uzun veya çok sertse de ortaya çıkabilir. İkincisi, pipet ucu boyutundan etkilenir. Burada açıklandığı gibi 1 mL hücre kültürü pipetlerinin kullanılması idealdir. Daha küçük uç çapına sahip farklı türde bir pipet kullanmak risklidir.
Sorun giderme Besleyici hücreler çoğalmaya devam ederse, mitotik tutuklama etkili olmamıştır ve yeni bir parti alınmalı ve prosedür yeniden başlatılmalıdır. Koloniler besleyici hücre katmanından gevşemezse, EDTA'da Ca2 + olmadığından ve EDTA'yı eklemeden önce kalan hücre kültürü ortamını çıkarmak için kolonileri içeren kültür kabının PBS ile iyice durulandığından emin olunmalıdır. İzole edilmiş hücreler veya çok küçük hücre kümeleri oluşturan çok fazla ayrışma, aşırı yıpranma nedeniyle ortaya çıkabilir ve yeni kolonilerin kurulmasını tehlikeye atabilir. Ortaya çıkan hücre kümelerinin ~ 60 μm çapında olduğunu doğrulamak için protokolün deneme çalışmalarında öğütme derecesi ampirik olarak belirlenmelidir. Besleyici katman, özellikle hESC'ler/hiPSC'ler hasada hazır olmadan önce kültür kabından kendiliğinden ayrılırsa, bunun nedeni besleyici hücrelerin hazırlandıktan sonra ~7 gün içinde kullanılmamış olması olabilir. Bu nedenle, besleyici hücrelerin kullanım süresi dikkatle izlenmelidir. EDTA'ya maruz kalma sırasında besleyici katman ayrışırsa (burada kullanılan besleyici hücrelerde hiç gözlemlemediğimiz bir şey), besleyici hücrenin tipi veya kültür yöntemi değiştirilmelidir.
Tekniğin sınırlamaları Tekniğin ana sınırlaması, başarılı bir sonuç elde etmek için yapışma işleminin görsel olarak incelenmesini gerektirmesidir. Bu, kullanıcıların, kolonilerin besleyici hücre katmanından ne zaman salındığını ve besleyici hücre katmanının alt tabakadan ne zaman gevşediğini nasıl belirleyeceklerini öğrenmeleri gerektiği anlamına gelir. Bununla birlikte, bu zor değildir ve deneyimlerimize göre, tekniğin yeni kullanıcıları birkaç denemede ustalaşabilir.
Hasat edilen hESC'lerin veya hiPSC'lerin birkaç besleyici hücre tarafından kontamine olma olasılığı da vardır. Amaç, besleyici olmayan koşullara geçmek veya tahliller için hESC'leri veya hiPSC'leri izole etmekse, bu tür kontaminasyon saflığı tehlikeye atacaktır. Burada kullanılan besleyici hücrelerle (insan sünnet derisi fibroblastları), enzimatik sindirimde bile besleyici hücre tabakasını ayırmanın son derece zor olduğunu not ediyoruz (gösterilmemiştir). Ayrışmamış besleyici hücre tabakası toto'da çıkarıldığından, hasat edilen hESC'lerin veya hiPSC'lerin kontaminasyonu muhtemelen ihmal edilebilir düzeydedir. Besleyici hücreler ayrıca mitotik olarak tutuklandığından, herhangi bir kontaminasyon, hESC'lerin veya hiPSC'lerin daha fazla geçmesiyle sonunda sıfıra inecektir.
Mevcut yöntemlere göre önemi hESC'lerin ve hiPSC'lerin kültürlenmesi için mevcut norm, bunu geçiş için EDTA kullanımının yaygın olduğu besleyicisiz koşullar altında yapmaktır. Besleyicisiz kültür, yapışmayı sağlayan özel olarak formüle edilmiş ortam ve kültür substratlarının kullanımına bağlıdır. Bu reaktifler, bazı laboratuvar bütçelerini aşabilecek ek bir masraf gerektirir. Ek olarak, besleyicisiz koşullar altında kültür, besleyicisiz kültür ortamında spesifik faktörlerin olmaması ve bunun sonucunda saf durumdan astarlanmış duruma geçiş nedeniyle bozulmuş bir farklılaşma potansiyeli ile ilişkilendirilmiştir. Mitotik olarak tutuklanmış besleyici hücreler üzerindeki büyüme, bu geçişi önler ve genel maliyetleri yönetilebilir bir seviyeye indirebilir, böylece laboratuvar araştırmalarında pluripotent kök hücrelerin daha geniş kullanımını kolaylaştırır.

HCESC'lerin ve hiPSC'lerin in vitro olarak uygun şekilde bakımı, insan hücresi ve gelişim biyolojisindeki çeşitli araştırma yolları için temel ve uygun bir metodolojidir. hESC'lerin ve hiPSC'lerin doğasında var olan farklılaşma dürtüsü nedeniyle, farklılaşmamış durumu in vitro olarak korumak özel bir özen ve dikkat gerektirir. Bu nedenle, hESC'lerin ve hiPSC'lerin bakımı ve geçişi için mümkün olduğunca az metodolojik değişkenlik ile uygun maliyetli protokoller geliştirmek büyük bir genel faydaya sahiptir.
Başlangıçta, hESC'ler ve hiPSC'ler, farklılaşmamış durumun 1,2,3 uzun süreli kültürüne ve korunmasına yardımcı olmak için farklı tipte besleyici hücreler üzerinde kültürlendi. Daha yakın zamanlarda, besleyici olmayan koşullar altında kültür, besleyici hücrelerle uğraşmaktan tamamen kaçındığı için norm haline gelmiştir4. Bununla birlikte, bazı laboratuvarlar ve çekirdek tesisler hala besleyici hücreler üzerinde hESC'leri veya hiPSC'leri kültürlemektedir. Besleyicisiz kültür daha pahalıdır, çünkü koloni yapışmasını sağlamak için özel bileşimlere sahip kültür ortamının ve kültür yüzeyinin bir tür kaplamasının kullanılmasını gerektirir (ana hücre dışı matris [ECM] bileşenleri veya ticari bir ECM bileşiği veya ticari olarak temin edilebilen kaplanmış plakalar kullanılarak). Masraf önemsiz değildir ve hESC veya hiPSC tabanlı araştırma ve geliştirme yapmakla ilgilenen bazı laboratuvarlar için potansiyel bir mali engel teşkil etmektedir. Ayrıca, besleyicisiz koşullar altında kültür, hESC'leri ve hiPSC'leri besleyici hücrelerde5 tutulandan daha az saf bir duruma getirme eğilimindedir ve bu, sonraki farklılaşmayı tehlikeye atabilir ve genetik varyasyonlarayol açabilir 6.
Tarihsel olarak, besleyici hücreler üzerinde kültürlenen hESC'lerin ve hiPSC'lerin pasajı, mikroskop altında kolonileri çıkarmak için bir neşter kullanarak mekanik hasadı içeriyordu7 - ancak bu daha sonra büyük ölçüde, kolonileri veya ayrışmış hücreleri izole etmek için hafif kazıma ile veya olmadan enzimatik sindirim ile desteklendi. Mekanik hasat sıkıcıdır ve hassas mikrocerrahi gerektirir. Enzimatik hasat, partiden partiye enzim farklılıkları nedeniyle verimlilik açısından değişebilir ve ROCK inhibitörleri 8,9 tarafından etkisiz hale getirilmedikçe hücre ölümünü teşvik eden ve anormal karyotiplerin9 insidansını artıran tam ayrışmayı destekleme eğilimindedir.
Mekanik ve enzimatik hasadın dezavantajlarından kaçınırken, besleyici hücrelerde hESC ve hiPSC'lerin kültürlenmesinin daha düşük masrafından ve daha fazla farklılaşma potansiyelinden yararlanmak için, EDTA aracılı yapışma bozukluğu kullanarak insan sünnet derisi fibroblastlarının besleyici tabakasında tutulan hESC ve hiPSC kolonilerinin hasadı için hızlı, etkili, uygun maliyetli, yüksek verimli bir yöntem oluşturduk. Verimi, değişkenliği ve kök hücre kalitesini mekanik hasatla elde edilenlerle karşılaştırdık (bu yaklaşımın gerektirdiği ek değişkenlik nedeniyle enzimatik sindirimle karşılaştırmadık). EDTA aracılı yapışma bozukluğunun, aşağı akış kullanımı ve analizler için istenirse, kolonileri besleyici bazlı kültürden besleyicisiz koşullara aktarmak için de iyi çalıştığını not ediyoruz. Bu yöntem, tutarlı bir pasaj yöntemi ile bir geçiş sağlar, çünkü EDTA kaynaklı yapışma bozukluğu, besleyici içermeyen kültürler için kullanılan popüler bir yaklaşımdır.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>50 mL santrifüj tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-18B-250UG</td><td></td></tr><tr><td>Marka B&ı rker Haznesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>10628431</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık neşterler no.15</td><td>Susann-Morton</td><td>505</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x) Ca/Mg</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Easy Grip doku kültürü kabı, 35 x 10 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipeti 1 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipeti 200 & mu; L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Sığır Serumu)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Filtre ucu 1.000 &mu; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.1186.210</td><td></td></tr><tr><td>Filtre ucu 200 & mu; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.211</td><td></td></tr><tr><td>Gama Hücresi 3000 ELAN ışınlama makinesi (alternatif olarak, proliferasyonu durdurmak için Mitomisin C kullanın)</td> <td>En İyi Theratronics</td><td>BT / MTS 8007 GC3000E</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Büyüme Faktörü Azaltılmış Matrixgel</td><td>Corning</td><td>734-0269</td><td></td></tr><tr><td>H9 hESC hattı</td><td>WiCell</td><td>WAe009-A</td><td></td></tr><tr><td>hPSC Genetik Analiz Kiti</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>#07550</td><td></td></tr><tr><td>HS429 hESC hattı&nbsp;</td><td>ECACC</td><td>KIe024-A</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Sünnet Derisi Fibroblastları -CRL2429 hattı</td><td>ATTC</td><td>CRL2429</td><td></td></tr><tr><td>IMDM (1x)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>iPSC hatları</td><td>İnsan Pluripotent Kök Hücreleri için Norveç Çekirdek Tesisi</td><td>NCS001 & NCS002</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Lazer Taramalı Konfokal Mikroskop veya eşdeğeri (Zeiss'ten LSM 700 kullanıyoruz)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>CETI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mitomisin C</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4287</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA)</td> <td>Gibco</td><td>11140.035</td><td></td></tr><tr><td>Pipetler, plastik 10 mL</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>Pipetler, plastik, 5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001</td><td></td></tr><tr><td>Serum Replasmanı (SR)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Steril filtreler 0.22 um</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.102</td><td></td></tr><tr><td>T-75 kültür şişesi</td><td>ThermoScientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi Leke (%0,4)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA, 500 mL</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan pluripotent kök hücrelerinin besleyici hücreler üzerinde etilendiamintetraasetik asit aracılı yapışma ile hızlı, uygun maliyetli, enzimsiz geçişi

Rapid, Cost-Efficient, Enzyme-Free Passaging of Human Pluripotent Stem Cells on Feeder Cells by Ethylenediaminetetraacetic Acid-Mediated Dis-Adhesion

İnsan pluripotent kök hücreleri (insan embriyonik kök hücreleri, hESC'ler ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler, hiPSC'ler) orijinal olarak uzun süreli kültürde farklılaşmamış bir durumda bakım için farklı besleyici hücre türleri üzerinde kültürlendi. Bu yaklaşımın yerini büyük ölçüde besleyicisiz kültür protokolleri almıştır, ancak bunlar daha maliyetli reaktifler içerir ve hücrelerin farklılaşma kapasitesini kısıtlayan astarlanmış bir duruma geçişi teşvik edebilir. Hem besleyici hem de besleyicisiz koşullarda, geçiş için hESC veya hiPSC kolonilerinin hasat edilmesi, kültürlerin genişletilmesi için gerekli bir prosedürdür.
Besleyici hücrelerde kültürlenen hESC'lerin/hiPSC'lerin geçirilmesi için kolay ve yüksek verimli bir prosedür sağlamak için, kalsiyum şelatörü etilendiamintetraasetik asit (EDTA) tarafından ortaya çıkarılan yapışma bozukluğunu kullanan bir hasat yöntemi oluşturduk. Bu yaklaşımı, kolonilerin mikroskop altında bir neşter ile izole edildiği orijinal mekanik hasat yaklaşımıyla karşılaştırarak elde edilen pasajlı hücrelerin verimini ve kalitesini değerlendirdik (enzimatik hasatla ilişkili reaktif değişkenliğini önlemek için karşılaştırıcı olarak mekanik hasat seçilmiştir).
Bir dizi deneyde, insan sünnet derisi fibroblastlarının besleyici hücre tabakası üzerinde iki farklı hESC hattı korunmuştur. Her hat, EDTA bazlı veya mekanik hasat kullanılarak çoklu geçişlere tabi tutuldu ve koloni büyüklüğü ve morfolojisi, hücre yoğunluğu, kök belirteç ekspresyonu, embriyoid cisimlerdeki üç germ katmanına farklılaşma ve genomik sapmalar açısından değerlendirildi. Başka bir deney setinde, iki farklı hiPSC hattında EDTA bazlı hasat kullandık ve benzer sonuçlar elde ettik. EDTA'nın neden olduğu yapışma kesilmesi zamandan tasarruf sağladı ve mekanik hasada kıyasla daha uygun boyutta ve daha düzgün morfolojide daha yüksek koloni verimi verdi. Ayrıca enzimatik hasattan daha hızlıydı ve enzim parti değişkenliğine eğilimli değildi. EDTA kaynaklı yapışma giderme yöntemi, aşağı akış kullanımı ve analizi için istenirse, hESC/hiPSC hatlarının besleyici hücre bazlı kültürden besleyicisiz koşullara aktarılmasını da kolaylaştırır.

Aşağıda belgelenen tahlil ve karşılaştırmalarda, iki hESC hattı (sırasıyla WiCell ve Karolinska Enstitüsü'nden H9 ve HS429) ve iki hiPSC hattı (her ikisi de İnsan Pluripotent Kök Hücreleri için Norveç Çekirdek Tesisi tarafından üretilen NCS001 ve NCS002) kullandık. Şekil ve tablolarda sunulan veriler hESC hatlarından alınmıştır, ancak hiPSC hatlarından tamamen benzer sonuçlar elde edilmiştir.
Elimizde, mekanik hasat, kolonilerin ~200-250 μm çapında yaklaşık beş ila altı kümeye bölünmesine neden olurken, EDTA'nın neden olduğu yapışma ve ardından öğütme ile, her koloni ~60 μm çapında ~10-20 kümeye bölündü. EDTA ile hasat edilen her kümedeki hücre sayısının ~ 20 olduğunu tahmin ediyoruz. Bir koloniyi bir neşter ile bu büyüklükteki kümelere bölmek pratik olmadığından, bu bakımdan, EDTA'nın neden olduğu yapışma bozukluğu, koloni hücresinin hayatta kalması için daha elverişli boyutta kümeler oluşturduğundanüstündür 10,11.
EDTA kullanılarak hasat edilen hESC/hiPSC kolonileri, mekanik olarak hasat edilen kolonilere kıyasla boyut ve şekil olarak daha homojendi (Şekil 1A-F). Bunun nedeni, mekanik hasat için gereken kesimin düz olmayan kenarlar ve değişen yığın boyutları oluşturmasıdır. Bunu nicel olarak değerlendirmek için, ImageJ-win64 protokolünü12 kullanarak geçtikten 5 gün sonra koloni daireselliğini (koloni kenarlarının ne kadar yuvarlak olduğunun bir ölçüsü olarak; 1 değeri mükemmel bir daireyi gösterir) değerlendirdik. Mekanik olarak hasat edilen kolonilerde koloni döngüselliği önemli ölçüde daha düşüktü (mekanik hasat: 0.61 ± 0.10; EDTA bazlı hasat: 0.84 ± 0.01; n = 10, p &lt; 0.001, Mann-Whitney U-testi, U = 10).
Koloni oluşumu sırasında hasat sonrası hücre-hücre etkileşimlerinin bir ölçüsü olan hasat edilen ve yeniden kaplanan kolonilerdeki hücre yoğunluğu, EDTA bazlı hasat ve mekanik hasat ile benzerdi (Tablo 1 ve Şekil 1G, H). Mekanik olarak hasat edilen koloniler, merkez bölgelerinde nekroz geliştirme eğilimi daha yüksekti (Şekil 1J). Bu muhtemelen şekildeki değişkenlikten ve özellikle mekanik olarak izole edilmiş hücre kümelerinin boyutundan kaynaklanıyordu, çünkü bu kümeler çok büyük olduğunda, yeni kültür kaplarına aktarılırken kolayca kendi üzerlerine katlanabilirler. Farklı kenarlara sahip yarı saydam bir görünüm sergileyen EDTA kullanılarak hasat edilen kolonilerde durum böyle değildi (Şekil 1I).
EDTA bazlı hasat kullanarak, esasen bir kuyuda kurulmuş olan tüm kolonileri 2-3 dakika içinde toplayabildik. Mekanik hasat kullanarak, tüm kolonileri bir kuyuda toplamak sıkıcı ve zaman alıcı olacaktır. Tipik olarak mekanik hasat kullanarak yalnızca ~0 veya ~20-25 koloni toplamayı başardık ve bu ~20 dakika sürdü. Benzer şekilde, kollajenaz sindirimi ve ardından hafif kazıma kullanılarak, toplam prosedür sadece birkaç dakika sürmesine rağmen, tüm kolonileri hasat etmek tipik olarak zordu. Bu nedenle, EDTA bazlı hasat, enzimatik hasattan daha hızlı veya daha hızlıdır ve mekanik veya enzimatik hasattan daha verimlidir.
Farklı hasat yöntemlerinin saplılık ve pluripotentlik üzerindeki etkisini değerlendirmek için, önce EDTA bazlı veya mekanik hasat kullanılarak 20 geçişten sonra elde edilen kolonileri qPCR analizine (Şekil 2) ve saplılık belirteçleri için immünositokimyasal boyamaya (Şekil 3 ve Şekil 4) tabi tuttuk. Her iki yöntem kullanılarak elde edilen koloniler, hem mRNA hem de protein seviyelerinde stabil bir saplılık belirteçleri ekspresyonu sergiledi. Daha sonra embriyoid cisimlerdeki üç germ katmanına farklılaşarak pluripotentliği değerlendirdik (Şekil 5 ve Şekil 6). Her iki yöntem kullanılarak 20 geçişten sonra elde edilen hESC'lerden veya hiPSC'lerden üretilen embriyoid cisimler, ektoderm, mezoderm ve endoderm için yaygın olarak değerlendirilen belirteçleri eksprese eden bir hücre karışımı içeriyordu.
Son olarak, qPCR tabanlı genetik analiz kullanarak her bir yöntemle geçirilen hESC'lerde ve hiPSC'lerde genomik anormalliklerin insidansını değerlendirdik (bkz. Her iki hasat yöntemi kullanılarak 20 geçişten sonra elde edilen koloniler, bir referans diploid kromozomal modelden bazı mütevazı sapma örnekleri sergiledi (değerlendirilen anormallikler, genellikle hiPSC'lerin yeniden programlanmasıyla ilişkili olanlardı, ancak hESC'lerde de elde edilebilir) (Şekil 7). Bununla birlikte, bu sapmaların paterni, her iki hasat yönteminden sonra elde edilen kolonilerde esasen aynıydı ve bu da hasat yöntemiyle bağlantılı olmadıklarını gösteriyordu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig01.jpg"> Şekil 1: EDTA bazlı veya mekanik hasadı takiben koloni morfolojisi ve hücre yoğunluğu. (AF) (A-F) EDTA bazlı veya (D-F) mekanik hasat kullanılarak 20 geçişten sonra 5 gün boyunca besleyicisiz kültürde kurulan H9 hESC kolonilerinin temsili parlak alan görüntüleri. (G,H) (G) EDTA bazlı veya (H) mekanik hasat kullanılarak 20 geçişten sonra oluşturulan H9 hESC kolonilerindeki hücre yoğunluğunun temsili floresan görüntüleri. Hücre çekirdekleri DAPI ile boyanır. (I,J) (I) EDTA bazlı veya (J) mekanik hasat kullanılarak 20 geçişten sonra kurulan H9 hESC kolonilerinin temsili parlak alan görüntüleri. Mekanik olarak hasat edilen kolonideki nekrotik merkezi bölgeye dikkat edin (J'deki ok). Tüm görüntüler 20. geçişten 5 gün sonra elde edildi. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: hESC = insan embriyonik kök hücresi; EDTA = etilendiamintetraasetik asit; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig02.jpg"> Şekil 2: EDTA bazlı veya mekanik hasattan sonra üretilen iki hESC hattında (H9 ve HS429) köklülük belirteci mRNA'nın ekspresyonu. H9 (üst panel) ve HS429 (alt panel) hESC'lerde belirtilen belirteçlerin kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu, mekanik hasat kullanılarak tek bir geçişten sonra, mekanik hasat kullanılarak 20 geçişten sonra ve EDTA bazlı hasat (1:5 seyreltme) kullanılarak 20 geçişten sonra. Ekspresyon seviyesi, temizlik geni ACCB'ninkine (beta-aktin) görecelidir. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Kısaltmalar: hESC = insan embriyonik kök hücresi; EDTA = etilendiamintetraasetik asit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig03.jpg"> Şekil 3: Farklı hasat koşullarından sonra H9 hESC hattındaki saplılık işaretleyici proteinlerin ekspresyonu. Daha fazla geçişten önce mekanik olarak (AE), mekanik hasat kullanılarak 20 geçişten sonra (FJ) ve EDTA bazlı hasat kullanılarak 20 geçişten sonra (KO) hasat edilen H9 hESC kolonilerinin temsili immünofloresan boyama. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: hESC = insan embriyonik kök hücresi; EDTA = etilendiamintetraasetik asit; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig04.jpg"> Şekil 4: Farklı hasat koşullarından sonra HS429 hESC hattındaki saplılık işaretleyici proteinlerin ekspresyonu. HS429 hESC kolonilerinin temsili immünofloresan boyaması, daha fazla pasajdan önce mekanik olarak (AE), mekanik hasat kullanılarak 20 geçişten sonra (FJ) ve EDTA bazlı hasat kullanılarak 20 geçişten sonra (KO). Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: hESC = insan embriyonik kök hücresi; EDTA = etilendiamintetraasetik asit; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig05.jpg"> Şekil 5: Mekanik veya EDTA bazlı hasadı takiben H9 hESC hattından üretilen embriyoid cisimlerdeki üç germ tabakası için belirteçlerin ekspresyonu. (A ve D sıraları) ektoderm (ECTO, TUJI), (B ve E sıraları) endoderm (ENDO, AFP) ve (C ve F sıraları) mezoderm (MESO, SMA) için belirteçlerin temsili immünofloresan boyama. EB'ler, 20 mekanik hasat geçişinden sonra (AC) veya 20 EDTA bazlı hasattan sonra (DF) üretilir. Ölçek çubukları = 40 μm. Kısaltmalar: hESC = insan embriyonik kök hücresi; EDTA = etilendiamintetraasetik asit; EB'ler = embriyoid cisimler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig06.jpg"> Şekil 6: Mekanik veya EDTA bazlı hasadı takiben HS429 hESC hattından üretilen embriyoid cisimlerdeki üç germ tabakası için belirteçlerin ekspresyonu. (A ve D sıraları) ektoderm (ECTO, TUJI), (B ve E sıraları) endoderm (ENDO, AFP) ve (C ve F sıraları) mezoderm (MESO, SMA) için belirteçlerin temsili immünofloresan boyama. 20 pasajlık mekanik hasattan sonra (A-C) veya 20 pasajlı EDTA bazlı hasattan sonra (D-F) üretilen EB'ler. Ölçek çubukları = 40 μm. Kısaltmalar: hESC = insan embriyonik kök hücresi; EDTA = etilendiamintetraasetik asit; EB'ler = embriyoid cisimler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig07.jpg"> Şekil 7: Mekanik veya EDTA bazlı hasat kullanılarak 20 geçişi takip eden HS9 ve HS429 ESC hatlarında ve NCS002 iPSC hattında yaygın genomik anormalliklerin qPCR tabanlı genetik analizi. 2 değerindeki taban çizgisi, tüm kromozomal belirteçlerde normal diploidi temsil eder. 1 veya 3 değeri, tüm hücrelerde belirtilen kromozomal markörün sırasıyla kaybını veya kazancını temsil eder. 1 ile 2 arasındaki veya 2 ile 3 arasındaki ara değerler, hücrelerin bir kısmında belirtilen işaretleyicinin bir kaybının veya kazancının varlığını gösterir. Sapma modelinin iki hasat koşulunda benzer olduğuna dikkat edin. Kısaltmalar: ESC = embriyonik kök hücre; EDTA = etilendiamintetraasetik asit; iPSC = indüklenmiş pluripotent kök hücre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Hücre yoğunluğu (hücre/mm2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>H9 Serisi</td>
			<td>demek</td>
			<td>stdev</td>
		</tr><tr><td>Daha fazla geçişten önce mekanik hasat</td>
			<td>3918</td>
			<td>263.3</td>
		</tr><tr><td>Mekanik hasat 20 kez</td>
			<td>3868</td>
			<td>197.7</td>
		</tr><tr><td>EDTA hasadı 20 kez</td>
			<td>4080</td>
			<td>127.8</td>
		</tr><tr><td>HS429 Serisi</td>
			<td>demek</td>
			<td>stdev</td>
		</tr><tr><td>Daha fazla geçişten önce mekanik hasat</td>
			<td>5249</td>
			<td>565.4</td>
		</tr><tr><td>Mekanik hasat 20 kez</td>
			<td>5247</td>
			<td>726.3</td>
		</tr><tr><td>EDTA hasadı 20 kez</td>
			<td>4963</td>
			<td>448.8</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: EDTA bazlı veya mekanik hasattan sonra üretilen iki hESC hattından (H9 ve HS429) kolonilerdeki hücre yoğunluklarının karşılaştırılması. Hücre yoğunlukları, mekanik hasat kullanılarak tek bir geçişten sonra, mekanik hasat kullanılarak 20 geçişten sonra veya EDTA bazlı hasat kullanılarak 20 geçişten sonra (1: 5 seyreltmede) değerlendirildi. Her durumda, n = 5 koloni.

Besleyici hücrelerde kültürlenen insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) enzimatik veya mekanik geçişiyle ilişkili sınırlamalardan kaçınmak için, EDTA aracılı yapışma bozukluğu kullanılarak insan sünnet derisi fibroblastlarının besleyici hücre tabakasında tutulan hESC veya hiPSC kolonilerinin toplanması için hızlı, etkili, uygun maliyetli, yüksek verimli bir yöntem oluşturduk.

Human pluripotent stem cells (human embryonic stem cells, hESCs, and human induced pluripotent stem cells, hiPSCs) were originally cultured on different ...

Bu protokol, besleyici hücreler üzerinde kültürlenen insan pluripotent kök hücrelerinin enzimsiz geçişi için hızlı, uygun maliyetli bir yöntem sağlar. Bu protokolün avantajı, maliyetli besleyici içermeyen kültür ortamı ve büyüme substratları gerektirmemesi, enzimler tarafından tam ayrışma riskini ortadan kaldırması ve kök hücrelerin hazır duruma geçme riskini azaltmasıdır. Prosedürü gösteren, insan pluripotent kök hücreleri için Norveç çekirdek tesisinin günlük yöneticisi Hege Brincker Fjerdingstad olacak.Tohum 0.5'e 10'a başlamak için, bundan sonra besleyici hücre ortamı olarak anılacak olan,% 10 FBS içeren 20 mililitre IMDM içeren bir T 75 kültür şişesinde, bundan sonra besleyici hücreler olarak anılacak olan 6 insan fibroblastını güce yükseltti. Besleyici hücreler% 90 birleşmeye ulaştığında, ortamı çıkarın ve ortamdaki faktörler tarafından tripsinin inhibisyonunu önlemek için hücreleri 10 mililitre DPBS ile üç kez yıkayın. Şişeye iki mililitre tripsin EDTA ekleyin ve besleyici hücrelerin ayrılmasını çıplak gözle gözlemlerken yaklaşık beş dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.Ayrılma başladıktan sonra, tüm agregaların tek hücrelere ayrıştığından emin olmak için hücrelerin ayrışmasını mikroskop altında gözlemlemeye devam edin. Ardından, Tripsin-EDTA'yı etkisiz hale getirmek için şişeye beş mililitre taze, önceden ısıtılmış besleyici hücre ortamı ekleyin ve besleyici hücreleri pipetleyerek nazikçe askıya alın. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın, ardından tüpü kapatın ve 5 dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin.Peleti bozmadan doyumu dikkatlice çıkarın ve dört mililitre taze besleyici hücre ortamında yeniden süspanse edin. Besleyici hücrelerin tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olduktan sonra, bunları bir hücre sayma odası kullanarak sayın ve 35 milimetrelik doku kültürü kaplarında HSC'leri ve HI PSC'leri kültürlemek için gereken hücre sayısını hesaplayın. Gama ışınlaması ile mitotik tutuklama gerçekleştirmenin ardından, uygun sayıda besleyici hücreyi 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve besleyici hücre ortamını toplam beş mililitre hacme ekleyin.Hemen oda sıcaklığında bir gama ışınlama makinesine taşıyın ve hücreleri mitotik olarak tutuklamak için ışınlayın. Besleyici hücreler bir doku kültürü başlığı altında mitotik olarak tutuklandıktan sonra, mililitre başına 5 gücüne yükseltilmiş 1.5 x 10'luk bir hücre konsantrasyonu elde etmek için besleyici hücre ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın. 35 milimetrelik bir tabağa 2 mililitre besleyici hücre süspansiyonu ekleyin ve tabağı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörüne aktarın.Hücrelerin eşit dağılımı için, kabı inkübatör rafında ileri ve geri yavaşça ama sıkıca hareket ettirin. Ardından, inkübatör kapağını kapatmadan önce duraklatın ve aynı işlemi soldan sağa gerçekleştirin. 24 saat sonra, besleyici hücre ortamını% 10 serum replasmanı içeren IMDM ile değiştirin.Mitotik olarak tutuklanmış besleyici hücreler içeren kültür kabından, kolonilerin transferinden 30 dakika önce% 10 serum replasman ortamı içeren IMDM'yi, bazik fiberblast büyüme faktörü veya BFGF içeren 1.2 mililitre önceden ısıtılmış HESC ortamı ile değiştirin. Daha sonra, ortamı HSC'ler veya HI PSC'ler içeren bir kültür kabından çıkarın ve bağlanmamış hücreleri ve hücre kalıntılarını gidermek için kolonileri bir mililitre DPBS ile yıkayın. Bir mililitre 0.5 milimolar EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede bir dakika inkübe edin.Daha sonra bir mililitrelik pipet kullanarak, EDTA çözeltisini BFGF içeren bir mililitre HESC ortamıyla değiştirin. Kolonileri besleyici hücre katmanından serbest bırakmak için, katman gevşeyene ve ayrı bir küme halinde kendi üzerine katlanana kadar aynı pipetle hafifçe ezin. Besleyici hücre katmanını bir pipet ucuyla kültür kuyusunun kenarına itin.Yeni bir mililitrelik pipet kullanarak, asılı kolonileri, besleyici hücreler ve BFGF içeren HESC ortamı içeren yeni bir kültür kabına aktarın ve bir ila beş oranında bölün. Çanağı bir inkübatöre aktarın ve kolonilerin eşit dağılımını kolaylaştırmak için yavaşça bir yandan diğer yana hareket ettirin. EDTA kullanılarak hasat edilen HESC kolonileri, mekanik olarak hasat edilenlere göre boyut ve şekil olarak daha homojendi.Hasat edilen ve yeniden kaplanan kolonilerdeki hücre yoğunluğu, EDTA bazlı hasat ve mekanik hasat için benzerdi. Mekanik olarak hasat edilen koloniler, orta bölgelerinde nekroz geliştirme eğilimi daha yüksekken, EDTA kullanılarak hasat edilen koloniler, farklı kenarlara sahip yarı saydam bir görünüm sergiledi. QPCR analizi, mekanik veya EDTA bazlı hasat kullanılarak 20 geçişten sonra elde edilen koloniler için mRNA'da stabil bir saplılık belirteci ekspresyonu gösterdi.Mekanik veya EDTA bazlı hasat kullanılarak 20 geçişten sonra elde edilen koloniler için protein seviyelerinde immünokimyasal boyama ile benzer gözlemler yapılmıştır. Her iki yöntem kullanılarak 20 geçişten sonra elde edilen HSC'lerden üretilen embriyoid cisimler, ektoderm, mezoderm ve endoderm için yaygın olarak değerlendirilen belirteçleri eksprese eden bir hücre karışımı içeriyordu. Ayrıca, yaygın genomik anormalliklerin QPCR tabanlı genetik analizi, referans bir diploid kromozomal modelden mütevazı bir sapma sergiledi.EDTA'ya maruz kalmayı bir dakika ile sınırlamak önemlidir. Daha uzun süre maruz kalmak çok fazla ayrışmaya neden olabilir. Besleyici hücre katmanını bir kenara çekmek de önemlidir, böylece insan embriyonik kök hücrelerini veya insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri yeni bir kültür kabına aktarırken engel olmaz.EDTA'nın patojen için yaygın olarak kullanıldığı kültüre ve yemsiz koşullara geçiş basittir ve hücrelerin nasıl tedavi edildiğine dair hiçbir değişiklik yoktur.

rapid-cost-efficient-enzyme-free-passaging-human-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video laboratuarımızda rutin tripsin tonlar insan embriyonik kök hücre hatları geçişleri nasıl göstermektedir.

Tripsin ile Pasajlanması tonlar İnsan Embriyonik Kök Hücre hatları

Bu video, besleyici, hücre koşullarda ve ne kadar besleyici sürekli geçit hESC hücre koşulları, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümesini nasıl koruyacağınızı gösteriyor. HESC, Onay pluripotency immünofloresan mikroskobu ile besleyici, hücre koşullarda yetiştirilen da gösterilmiştir. 3 Bölüm...

Matrigel MEFS Matrigel 3: Matrigel üzerine gelen Pasajlanması hESC

Geçiş kültürlere besleyici-özgür koşullarda devam eden çabalarına rağmen, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve türetme ve kültürü fare embriyonik besleyiciler (MEFS) ile işbirliği kültürler büyük oranda bağımlı kalır. Burada, biz hızla öncesi deneylere hESC kültürlerden besleyiciler kaldırmak için yeni bir metodoloji göstermektedir.

Yüksek Yoğunluklu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürleri gelen Rapid Fibroblast Kaldırma

Bu video, insan pluripotent kök hücrelerinde (hPSC'ler) çinko parmak nükleaz tabanlı genom düzenleme tekniğini göstermektedir. hPSC'ler potansiyel olarak çeşitli hücre tiplerine ayrılabildiğinden, bu teknoloji hastaya özgü bir şekilde in vitro patolojik ve farmakolojik çalışmalar için yararlıdır.

Çinko Parmak Nükleaz Tabanlı Genom Düzenleme: İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde Çift Sarmallı Homoloji Bağımlı Onarım Mekanizması ile Genomu Değiştirme Tekniği

Lentiviral temelli, yeniden programlanmış ve karakterize edilmiş, faktörsüz insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin türetilmesi ve varsayılan klinik dereceli koşullara dönüştürülmesi için bir protokol tanımlıyoruz.

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Güvenli liman AAVS1 lokusunda TALEN aracılı gen düzenleme, insan iPSC'lerinde yüksek verimli transgen ilavesi sağlar. Bu protokol, raportör hatları oluşturmak için bir GFP geninin hedeflenen entegrasyonunu sağlamak için TALEN ve donör vektör iletimi için iPSC'lerin hazırlanması, iPSC'lerin transfekte edilmesi ve iPSC klonlarının seçilmesi ve izole edilmesi prosedürlerini açıklar.

Transfeksiyon, Seçim ve İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Colony-toplama AAVS1 Safe Harbor içine GFP geninin ile TALEN-hedefli

Burada daha önce tarif edilen sistemler geliştirir insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) arasında AAVS1 lokusunda RMCE göre hızlı ve etkili bir gen düzenleme yöntemi sunulmaktadır. Bu tekniği kullanarak, izogenik hatları hızlı ve güvenilir hPSCs ile transgenesis aracılı araştırma kolaylaştıran, uygun karşılaştırmalı çalışmalar için oluşturulabilir.

içinde Recombinase aracılı Kaset Borsası tarafından Rekombinant insan pluripotent kök hücreleri hızlı ve verimli Nesil<em&gt; AAVS1</em&gt; Odağı

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) pluripotent durumlarının korunmasını belirlemek için düzenli karakterizasyonu, bu hücrelerin diğer uygulamalar için kullanılmadan önce önemli bir adımdır. Burada, immünositokimya yoluyla kolay ve rutin karakterizasyonlarını sağlamak için özel olarak tasarlanmış insan iPSC'lerinin küçük ölçekli yayılımı için bir yöntem açıklıyoruz.

Rutin İmmünositokimyasal Karakterizasyonu için serum serbest şartlar İnsan iPSCs küçük ölçekli Yayılım

Bu iletişim kuralı birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal kök hücrelerin içine İndüklenmiş pluripotent kök hücreler tamamen kimyasal olarak tanımlanan koşullarda bir sigara entegre episomal yaklaşım kullanarak yeniden programlama açıklar. Yordamlar, ayıklama, kültür, yeniden programlama ve elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler sıkı yöntemlerle karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Burada biz insan birincil fibroblastlar değiştirilmiş mRNA'ların programlama faktörler kodlama kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre yeniden programlamak için klinik, yüksek verimli, besleyici-Alerjik bir yöntemi açıklamak ve olgun mikroRNA-367/302 taklit eder. Ayrıca programlama verimlilik, değerlendirmek için yöntem klonal IPSC kolonileri genişletin ve pluripotency işaretin TRA-1-60 ifade onaylamak bulunmaktadır.

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Mevcut protokol, insan ve insan olmayan primat idrar türevi hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) izole etmek, genişletmek ve yeniden programlamak için bir yöntemin yanı sıra yeni üretilen iPSC'lerin besleyicisiz bakımı için talimatları açıklamaktadır.

İdrardan Elde Edilen Primat Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Üretimi ve Bakımı

Öğrenin, besleyici hücreler üzerinde EDTA aracılı yapışma ile insan pluripotent kök hücrelerinin hızlı ve uygun maliyetli enzimsiz geçiş yöntemini. Bu teknik hücre hasarını azaltır ve pluripotensiyi korur.

İnsan pluripotent kök hücrelerinin besleyici hücreler üzerinde etilendiamintetraasetik asit aracılı yapışma ile hızlı, uygun maliyetli, enzimsiz geçişi (Video) | JoVE Journal

İnsan pluripotent kök hücrelerinin besleyici hücreler üzerinde etilendiamintetraasetik asit aracılı yapışma ile hızlı, uygun maliyetli, enzimsiz geçişi

Daha fazla video keşfet