Name: Etiket Tutma Genişletme Mikroskobu (LR-ExM), Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Yüksek Verimli Etiketleme Sağlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Keşfedin etiket tutma genişletme mikroskobu (LR-ExM) ile süper çözünürlüklü hücresel görüntüleme. Bu yöntem, trifonksiyonel bağlayıcılar kullanarak geleneksel yöntemlere göre 6 kat daha yüksek floresans sinyali sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (R00 GM126136 - X.S.), ABD Ulusal Bilim Vakfı (DMS1763272 - S.P.) ve Simons Vakfı (594598 S.P.) tarafından desteklenmiştir.

1. Hücre kültürü
<ol><li>McCoy'un 5A ortamında kültürlenmiş U2OS hücrelerini,% 5 CO2'de% 10 FBS ile 37 ° C'de% 5 ile desteklenmiş olarak kullanın.</li>
	<li>Kullanım kolaylığı için 16 adet iyi çıkarılabilir odacıklı kapak camı (kültür alanı 0,4cm2) üzerine kültür hücreleri.</li>
</ol>2. Fiksasyon ve geçirgenlik
NOT: Fiksasyon ve geçirgenlik koşulları, optimize edilmiş immün boyama protokollerine bağlıdır. Aşağıdakiler, ko-immünostain mikrotübül ve klatrin kaplı çukurlara (CCP'ler) bir fiksasyon ve geçirgenlik protokolüdür.
<ol><li>Hücre sayıları ~0.04 x 10 6'ya ulaştığında, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PEM tamponunda (100 mM PIPES, 1 mM EGTA ve 1 mM MgCl 2, pH6.9) 100 μL%3.2 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin (Tablo 1). NOT: PFA kullanılarak sabitleme, sertifikalı bir güvenlik başlığında gerçekleştirilir.</li>
	<li>Hücreleri her biri 5 dakika boyunca üç kez 200 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 100 μL geçirgenlik tamponu ile hücreleri 15 dakika boyunca geçirgenleştirin (Tablo 1). NOT: Hedef protein, RNA veya DNA bozulmasını önlemek ve en uygun sonucu elde etmek için mümkün olan en kısa sürede etiketlemeye devam edin. Bununla birlikte, ihtiyaç duyulursa, sabit numuneler 4 ° C'de bir PBS tamponunda uzun bir süre (bir aya kadar) saklanabilir. Buharlaşmış PBS'leri değiştirin ve numuneyi fotobeyazlatmaya karşı koruyun.</li>
</ol>3. Endojen streptavidin ve biyotin blokajı
<ol><li>Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir hücre bloke edici tamponda (100 μL) seyreltilmiş streptavidin çözeltisi ile hücreleri inkübe edin (Tablo 1).</li>
	<li>200 μL hücre bloke edici tampon ile kısaca durulayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir hücre bloke edici tamponda seyreltilmiş 100 μL biyotin çözeltisi içeren hücreleri inkübe edin. NOT: SNAP- veya CLIP- etiketlerini kullanmak gibi kendi kendini etiketleme yaklaşımı kullanırken, adım 4'ü atlayın ve adım 5.1: kendinden etiketleme etiketleme yaklaşımına geçin.</li>
</ol>4. Primer antikor boyama
<ol><li>Sıçan anti-α-tübülin antikoru (1:500 seyreltme) ve tavşan anti-klatrin ağır zincirli antikoru (1:100 seyreltme) içeren hücreleri, 4 ° C'de 16 saat veya oda sıcaklığında 1 saat boyunca 100 μL hücre bloke edici tamponda inkübe edin. Doku örnekleri için kuluçka süresini iki katına çıkarın.</li>
	<li>Numuneleri her biri 5 dakika boyunca 200 μL PBS ile dört kez yıkayın.</li>
</ol>5. LR-ExM'e özgü sekonder antikor boyama
<ol><li>IgG antikorlarını N-hidroksisüksinamid (NHS) - metakrilatid (MA) -Biotin veya NHS-MA-Digoxigenin (Dig) gibi üç fonksiyonlu bağlayıcılarla birleştirin (Şekil 1B). Trifonksiyonel çapaların sentezi ve sekonder antikorların konjugasyonu daha önce Shi ve ark.1'de tanıtılmıştır. Kendi kendini etiketleme yaklaşımı: IgG antikorlarını MA- benzilguanin (BG)-Biotin veya MA- benzilsitozin (BC)-Dig gibi üç fonksiyonlu bağlayıcılarla birleştirin (Şekil 1B). Üç fonksiyonlu çapaların sentezi ve ikincil antikorların konjugasyonu daha önce Shi ve ark.1'de tanıtılmıştır.</li>
	<li>Hücreleri eşek anti-tavşan-Dig-MA (1:100 seyreltme) ve eşek anti-sıçan-biotin-MA (1:100 seyreltme) sekonder antikorları ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca 100 μL hücre bloke edici tamponda inkübe edin. Doku örnekleri için bu kuluçka süresini iki katına çıkarın.</li>
	<li>Numuneleri her biri 5 dakika boyunca 200 μL PBS'de dört kez yıkayın.</li>
</ol>6. Ek ankraj
<ol><li>Proteinleri hidrojel üzerine sabitlemek için hücreleri PBS'de (100 μL) 15 dakika boyunca oda sıcaklığında % 0.25 glutaraldehit (GA) ile inkübe edin. Alternatif olarak, ankraj için 25 mM metakrilik asit N-hidroksisüksinamid ester (MA-NHS) kullanın. Oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon teşvik edilir.</li>
	<li>Numuneleri PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.</li>
</ol>7. Jelleşme
NOT: Genleşme hızı, tuz ve suyun jelin dışına veya içine difüzyon süresi ile belirlenir; böylece ince jellerin dökümü genleşme süresini hızlandırır.
<ol><li>16 delikli jel plakanın üst yapısını çıkarın. Buz üzerindeki hücreleri koşullandırmak için her bir kuyucuğa 40 μL monomer çözeltisi ekleyin. 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.<ol><li>Bir monomer çözeltisi hazırlamak için bkz: Tablo 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Jelasyon çözeltisini buz üzerinde hazırlayın. Monomer çözeltisine çift damıtılmış su ve% 10 N,N, N′,N′ Tetrametilenidiamin (TEMED) hızlandırıcı ekleyin (%10 TEMED: monomer çözeltisi = 1:47); başlatıcıyı henüz eklemeyin (Tablo 3).</li>
	<li>0.4cm2'lik bir alana sahip bir hücre kültürü odası için, yaklaşık 40 μL'lik bir jelasyon çözeltisi hacmi kullanın.</li>
	<li>Jelasyon çözeltisine% 10 amonyum persülfat (APS) ekleyin, buz üzerinde inkübe edin ve hemen buz üzerindeki her silikon contaya 40 μL jelasyon çözeltisi pipetin. 3 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin (%10 APS:%10 TEMED:monomer çözeltisi = 1:1:47).</li>
	<li>Numuneyi ışıktan koruyun ve 10 cm'lik Petri kabındaki kapak camını jelasyon için 1,5 saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre taşıyın. 37 ° C inkübasyon sırasında jelin nemini korumak için, Petri kabını kapakla örtün ve Petri kabına birkaç damla su koyun.</li>
</ol>8. Sindirim
<ol><li>Jelleşmeden sonra, jeli ayırmak için camı çıkarın ve jeli 6 kuyucuklu plakaya aktarın. Gömülü hücreleri 2 mL sindirim tamponu (Tablo 1) ile oda sıcaklığında gece boyunca veya 37 °C'de 4 saat sindirin. En az 10 kat fazla hacimli sindirim tamponu kullanın.</li>
	<li>Jelleri, son jel hacminden en az 10 kat fazla su hacmiyle yıkayın. Yıkama adımını her seferinde 20 ila 30 dakika boyunca dört kez tekrarlayın. Jel her boyutta yaklaşık iki kat genişler. NOT: Jel numuneleri, 4 °C'de PBS tamponunda 1 aya kadar saklanabilir. Kurumasını önlemek için buharlaşan suyu değiştirin ve depolama sırasında numuneyi ışıktan koruyun. Üç fonksiyonlu ankrajların bozulmasını önlemek için, numuneler sindirim ve yıkamadan sonra mümkün olan en kısa sürede lekelenmelidir.</li>
</ol>9. Sindirim sonrası floresan boyama
<ol><li>Jelleri, oda sıcaklığında 24 saat boyunca 2 ila 5 μM STV-boya ve/veya anti-DIG-boya ile 2 mL hacimli streptavidin (STV)/digoxigenin (DIG) boyama tamponunda inkübe edin. Örnekleri karanlıkta tutun.</li>
</ol>10. Genişleme
<ol><li>Jeli her seferinde 30 dakika ila 1 saat arasında aşırı suyla (2-3 mL) dört kez yıkayın ve genişletin.</li>
	<li>Floresan mikroskopi altındaki hücrelerin daha kolay görselleştirilmesi için, beş yıkamanın üçüncüsü sırasında hücreleri DAPI ile lekeleyin. DAPI stok konsantrasyonunu (5 mg/mL, 4 °C'de depolanır) yıkama suyunda 1:5.000 seyreltmede seyreltin. Jeli 30 dakika ila 1 saat boyunca bir DAPI-su çözeltisi (2 mL) ile inkübe edin.</li>
	<li>3 mL su ile iki kez daha yıkayın.</li>
	<li>Numuneleri içerecek kadar büyük olan herhangi bir düz tabakta jelleri genişletin. 0,4cm2 alan kapak camı üzerine hazırlanan genişletilmiş jeller, cam tabanlı 6 delikli bir plakaya güzel bir şekilde oturur. NOT: Genleşme sonrası lekeli numuneler, 4°C'de PBS tamponunda 4 aya kadar saklanabilir. kurumasını önlemek ve numuneyi fotobeyazlatmaya karşı korumak için yeterli su ekleyin. Görüntülemeden önce genişletme ve DAPI boyama adımını tekrarlayın. Florofor bozulması riskini önlemek için, numunelerin mümkün olan en kısa sürede görüntülenmesi gerekir.</li>
</ol>11. Görüntüleme
<ol><li>Jel numunelerini hareketsiz hale getirmek için 6 delikli cam tabanlı görüntüleme odasını %0,01 poli-L-lizin (her biri 3 mL) ile kaplayın.</li>
	<li>Jel numunelerini kaplanmış görüntüleme odasına aktarın.</li>
	<li>Numuneleri istenen floresan kapsamlarıyla görüntüleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-retention+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Label-retention expansion microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067(2021).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+expansion+microscopy+with+structured+illumination+microscopy+for+analyzing+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes.</a> Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li>
<li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+scalable+super+resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size+adjustable+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li>
<li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+protein+tag+for+multiprotein+labeling+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.</a> Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).</li>
<li>Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+fusion+proteins+with+synthetic+fluorophores+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super+resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy.</a> Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (19), 45836(2018).</li>
<li>Damstra, H. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cellular+and+tissue+ultrastructure+using+Ten-fold+Robust+Expansion+Microscopy+%28TREx%29%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx).</a> eLife. 11, 73775(2021).</li>
<li>M'Saad, O., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+of+proteins+in+their+ultrastructural+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Light microscopy of proteins in their ultrastructural context.</a> Nature Communications. 11 (1), 3850(2020).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

LR-ExM'in temel yeniliği, hedef proteinleri etkili bir şekilde etiketlemek ve görüntü kalitesini artırmak için üç fonksiyonlu ankrajlar kullanmaktır. Bu yöntem, araştırmacılar için çok kolay bulunmayan üç işlevli çapalarla sınırlıdır. Bununla birlikte, trifonksiyonel çapalar talep üzerine diğer araştırmacılarla paylaşılabilir ve Chrometa'nın ExM probları gibi benzer ürünler artık ticari olarak da temin edilebilir.
Bu protokolde primer ve sekonder antikor boyama basamakları için oda sıcaklığınd...

Genleşme mikroskobu (ExM), epifloresan ve konfokal mikroskoplargibi geleneksel mikroskoplarla süper çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için uygun bir yaklaşım olarak ilk kez tanıtıldığından beri araştırmacılar tarafından kullanılmaktadır 1,2,3,4,5,6,7 . ExM kullanarak, düzenli konfokal mikroskoplarla bile ~ 70 nm yanal çözünürlük elde etmek mümkündür. ExM, süper çözünürlüklü görüntüleme ile birleştirildiğinde, çözünürlük daha da geliştirilir. Örneğin, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) ile kabaca 30 nm çözünürlüğe ve stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) 1,5 ile kabaca 4 nm çözünürlüğe ulaşılabilir.
Bununla birlikte, düşük etiketleme verimliliği, standart ExM yöntemleriyle ilgili kritik bir konudur. Floresan kaybı, floresan gruplarının türüne ve sindirim süresine bağlı olarak değişebilir. Bununla birlikte, ortalama olarak, ExM'nin polimerizasyonundan ve protein sindirim adımlarından sonra floroforların% 50'sinden fazlasının kaybolduğu ve bunun görüntüleme kalitesine zarar verdiği bildirilmiştir 3,4.
Böylece, etiketleri verimli bir şekilde tutabilen ve sinyal kaybını azaltabilen etiket tutma genleşme mikroskobu (LR-ExM) geliştirilmiştir1. LR-ExM'in temel yeniliği, ilgilenilen proteinleri boyamak için standart ExM prosedüründe olduğu gibi sadece floresan boyalar kullanmak yerine bir dizi üç fonksiyonlu ankrajın kullanılmasıdır. Bu üç fonksiyonlu bağlayıcılar üç bölümden oluşur: (1) antikora bağlanmak için konektör (örneğin, N-hidroksisüksinamid (NHS)), (2) proteinleri polimere sabitlemek için çapa (örneğin, metakrilamit (MA)) ve (3) organik bir boyaya konjuge etmek için muhabir (örneğin, biyotin veya digoxigenin (DIG)). Üç fonksiyonlu ankrajlar polimerizasyon ve protein sindirim adımlarında hayatta kalır ve bu nedenle florofor kaybını önler.
Ayrıca, bu yöntem SNAP veya CLIP gibi kendi kendini etiketleyen enzimatik etiketlerle uyumlu olduğu için büyük bir potansiyele sahiptir. Enzimatik etiket yaklaşımlarının immün boyama yaklaşımına göre yüksek özgüllük ve etiketleme verimliliğiaçısından bazı faydaları vardır 8,9,10.
Bu yazıda LR-ExM'in ayrıntılı bir prosedürü gösterilmiştir. LR-ExM, gelişmiş etiketleme verimliliği ile yüksek uzamsal çözünürlük elde etmek için son derece etkili ve esnek bir yöntemdir.

<table><tbody><tr><td>Akrilamid&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9099&nbsp;</td><td>ExM Jel</td></tr><tr><td>AffiniPure Eşek Anti-Tavşan IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>H + L, 711&ndash; 005-152</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>AffiniPure Eşek Anti-Sıçan IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>H + L, 712&ndash; 005-153</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-Streptavidin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-540-084</td><td>Floresan problar&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Streptavidin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-580-084</td><td>Floresan problar&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Streptavidin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-600-084</td><td>Floresan problar&nbsp;</td></tr><tr><td>Amonyum Persülfat&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A3678&nbsp;</td><td>ExM Jel</td></tr><tr><td>anti-H3K4me3</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>anti-H3K9me3</td><td>Abcam</td><td>ab176916</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>DAPI dilaketat</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D3571</td><td>Floresan problar&nbsp;</td></tr><tr><td>DyLight 488 Etiketli Anti-Digoksigenin/Digoksin (DIG)</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>DI-7488</td><td>Floresan problar&nbsp;</td></tr><tr><td>DyLight 594 Etiketli Anti-Digoksigenin/Digoksin (DIG)</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>DI-7594</td><td>Floresan problar&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>EMD Millipore A.Ş.</td><td>324626-25GM</td><td>Fiksasyon tamponu</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>EDTA</td><td>Sindirim tamponu</td></tr><tr><td>Glutaraldehit% 10 EM Sınıfı Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>50-262-13</td><td>Ankraj</td></tr><tr><td>Grace Bio-Labs Cultureİyi çıkarılabilir odacıklı kapak camı</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>GBL112358-8EA</td><td>Hücre kültürü odası</td></tr><tr><td>Grace Bio-Labs CultureWell temizleme aracı</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>GBL103259</td><td>Çıkarma aracı</td></tr><tr><td>Guanidin HCl&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G3272&nbsp;</td><td>Sindirim tamponu</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma</td><td>M8266-1KG</td><td>Fiksasyon tamponu</td></tr><tr><td>McCoy's 5a</td><td>ATCC</td><td>30 &ndash; 2007</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Metakrilik asit N-hidroksisüksinamid ester,% 98 & nbsp; (Yüksek Lisans-NHS)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>730300-1G</td><td>Ankraj</td></tr><tr><td>monoklonal fare anti-Nup153 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab24700</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>N, N ve prime; Metilenbisakrilamid ve nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M7279&nbsp;</td><td>ExM Jel</td></tr><tr><td>N, N, N & asal; , N & asal; Tetrametiletilendiamin&nbsp; (TEMED)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T7024&nbsp;</td><td>ExM Jel</td></tr><tr><td>% 16 Paraformaldehit Sulu</td><td>Çözeltiler Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>50-980-487</td><td>Fiksasyon tamponu</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757-25G</td><td>Fiksasyon tamponu</td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin</td><td>Sigma</td><td>P8920-100ML</td><td>Oda kaplaması</td></tr><tr><td>Proteinaz K&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4850-5ML</td><td>Sindirim tamponu</td></tr><tr><td>Tavşan anti-klatrin ağır zincirli antikor</td><td>Abcam</td><td>ab21679</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>sıçan anti&ndash; &alfa;-tubulin antikoru, tirozinlenmiş, klon YL1/2</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB1864-I</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>Sodyum Akrilat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>408220</td><td>ExM Jel</td></tr><tr><td>Streptavidin / Biotin bloke edici kit</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>SP-2002</td><td>Blokaj tamponu</td></tr><tr><td>Tris-HCl&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>AM9855&nbsp;</td><td>Sindirim tamponu</td></tr><tr><td>U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>Hücre hattı</td></tr><tr><td>6 kuyulu cam alt plakalar</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td>Görüntüleme plakası</td></tr></tbody></table>

etiket tutma genişletme mikroskobu (lr-exm), süper Çözünürlüklü görüntüleme ve yüksek verimli etiketleme sağlar

Label-Retention Expansion Microscopy (LR-ExM) Enables Super-Resolution Imaging and High-Efficiency Labeling

Genleşme mikroskobu (ExM), çözünürlüğü artırmak için çoğu ışık mikroskobu yöntemiyle birleştirilebilen bir numune hazırlama tekniğidir. Hücreleri veya dokuları şişirilebilir hidrojele gömdükten sonra, numuneler orijinal boyuta kıyasla fiziksel olarak üç ila on altı kat (doğrusal boyut) genişletilebilir. Bu nedenle, herhangi bir mikroskobun etkili çözünürlüğü genişleme faktörü ile arttırılır. Daha önce tanıtılan ExM'nin önemli bir sınırlaması, polimerizasyon ve sindirim prosedüründen sonra floresanın azaltılmasıdır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, sinyal kaybını önleyen ve bir dizi yeni üç işlevli ankraj kullanarak etiketleme verimliliğini büyük ölçüde artıran etiket tutma genleşme mikroskobu (LR-ExM) geliştirilmiştir. Bu teknik, nanometrik ölçekte hücresel veya hücre altı yapıları araştırırken minimum floresan sinyal kaybı ile daha yüksek çözünürlük elde edilmesini sağlar. LR-ExM sadece immünofloresan etiketleme için değil, aynı zamanda SNAP ve CLIP etiketleri gibi kendinden etiketli protein etiketleriyle de kullanılabilir, böylece daha yüksek etiketleme verimliliği elde edilir. Bu çalışma, bu immün boyama temelli yaklaşım için prosedür ve sorun gidermenin yanı sıra LR-ExM'nin kendi kendini etiketleme yaklaşımlarının alternatif olarak tartışılmasını sunmaktadır.

Klatrin kaplı çukurlar (CCP'ler) üç fonksiyonlu ankrajlar (Şekil 1B) kullanılarak immünoboyalıdır ve LR-ExM, Şekil 1A'da açıklandığı gibi gerçekleştirilir. LR-ExM (Şekil 2C, E), protein tutma genleşme mikroskobu (proExM, Şekil 2A) veya biotin-ExM'ye (Şekil 2B) kıyasla çok daha yüksek floresan yoğunluğu gösterir; LR-ExM sinyali proExM'den yaklaşık altı kat d...

Bir etiket tutma genişletme mikroskobu protokolü (LR-ExM) gösterilmiştir. LR-ExM, daha önce tanıtılan genleşme mikroskopilerine kıyasla daha iyi etiketleme verimliliği sağlayan yeni bir üç işlevli ankraj seti kullanır.

Etiket Tutma Genişletme Mikroskobu (LR-ExM), Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Yüksek Verimli Etiketleme Sağlar

Expansion microscopy (ExM) is a sample preparation technique that can be combined with most light microscopy methods to increase the resolution. After ...

Genleşme mikroskobunun en önemli sınırlamalarından biri, polimerizasyon ve sindirimden sonra floresan yavaşlamasıdır. LR-ExM dediğimiz etiket tutma genleşme mikroskobu, polimerizasyon ve sindirim için üç fonksiyonlu ankrajlar kullanır. Tri fonksiyonlu ankrajı kullandıktan sonra, genleşme adımından sonra floresan kullanıyoruz.Bu nedenle, yüksek çözünürlüğe sahipken iyi sinyal-gürültü oranını koruyoruz. Etiket tutma genleşme mikroskobu, daha önce tanıtılan diğer genişleme mikroskopileri ve ayrıca floresan mikroskopileri ile birleştirilebilir. Çok yönlü yöntemde çok sağlamdır.Ve yüksek regülasyonlu görüntüleme için, gelişmiş bir sinyale sahip olmak gerçekten önemlidir. Başlamak için, 37 santigrat derecede tam ortama ve% 5 karbondioksite sahip 16 iyi çıkarılabilir odacıklı bir kapak camı üzerindeki kültür hücreleri. Hücre sayıları yaklaşık 40.000'e ulaştığında, PEM tamponunda 100 mikrolitre% 3.2 PFA içeren hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin.Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 100 mikrolitre permeablizasyon tamponu ile 15 dakika boyunca geçirgenleştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir hücre bloke edici tamponda seyreltilmiş streptavidin çözeltisi ile hücreleri inkübe edin ve ardından 200 mikrolitre hücre bloke edici tampon ile kısa bir süre durulayın. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir hücre bloke edici tamponda seyreltilmiş 100 mikrolitre biyotin çözeltisi ile inkübe edin.Daha sonra, sıçan anti alfa tübülin antikoru ve tavşan anti klatrin ağır zincir antikoru içeren 100 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ile hücreleri, dört santigrat derecede 16 saat veya oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra hücreleri üç fonksiyonel çapa, eşek anti tavşan kazma MA ve eşek anti sıçan biyotin MA içeren 100 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Proteinleri hidrojel üzerine sabitlemek için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 100 mikrolitre% 0.25 Glutaraldehit ile hücreleri inkübe edin.16 kuyucuklu plakanın üst yapısını tıraş bıçağı veya tercih ettiğiniz herhangi bir çıkarma aleti ile çıkarın ve alt kapak camını saklayın. Kapak camını bir Petri kabına yerleştirin ve buzun üzerine yerleştirin. Hücreleri koşullandırmak için her bir kuyucuğa 45 mikrolitre bir monomer çözeltisi ekleyin.Beş dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Jelasyon çözeltisini yapmak için 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpü hazırlayın. Monomer, çift damıtılmış su ve% 10T med karıştırın.Sülfat başına amonyum henüz eklemeyin. Bu arada, jelasyon çözeltisi tüpünü buzun üzerinde tutun. Jelasyon çözeltisine% 10 amonyum persülfat ekleyin.Hemen 40 mikrolitre jelasyon çözeltisini buz üzerinde bir jelasyon çözeltisi saklarken her bir kuyucuğun üzerine pipet yerleştirin. Kuyu plakasını üç dakika daha buzun üzerine yerleştirin. 37 santigrat derece inkübasyon sırasında jelin nemini korumak için, Petri kabını kapakla kaplayın ve Petri kabına birkaç damla su koyun.Numuneyi ışıktan korurken, kapak camını ve 10 santimetrelik Petri kabını, jelasyon için 1,5 saat boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre taşıyın. Jelleşmeden sonra, her jeli ayırmak için kapak camını kesin. Jelleri altı kuyucuk plakasına aktarın.Her bir oyuğa iki mililitre sindirim tamponu ekleyin. Numuneleri gece boyunca oda sıcaklığında veya dört saat boyunca 37 santigrat derecede bırakın. Daha sonra, jelleri son jel hacminden en az 10 kat fazla su hacmiyle yıkayın, yıkama adımını her seferinde 20 ila 30 dakika boyunca dört kez tekrarlayın ve jel her boyutta yaklaşık dört kat genişler.Numuneleri karanlıkta tutarken jelleri oda sıcaklığında 24 saat boyunca iki ila beş mikromolar streptavidin boya ve / veya anti digoxigenin boya ile iki mililitre hacimli streptavidin digoxigenin boyama tamponunda inkübe edin. Daha sonra jeli aşırı suyla iki ila dört kez yıkayın ve genişletin. Her yıkama yaklaşık 30 dakika ila bir saat sürer.Floresan mikroskopi altında hücrelerin daha kolay görselleştirilmesi için, üçüncü yıkama sırasında hücreleri DAPI ile lekeleyin. DAPI stoğunu yıkama suyunda bir ila 5.000 sanrıda seyreltin. Jeli bir DAPI çözeltisi ile 30 dakika ila bir saat boyunca inkübe edin.Daha sonra üç mililitre su ile iki kez daha yıkayın. Jel numunelerini hareketsiz hale getirmek için altı kuyucuklu cam taban görüntüleme odasını üç mililitre% 0.01 polilizin ile kaplayın. Daha sonra jel numunelerini kodlanmış görüntüleme odasına aktarın ve numuneleri istenen floresan kapsamlarıyla görüntüleyin.Etiket tutma genleşme mikroskobu, protein tutma genleşme mikroskobu veya biyotin genleşme mikroskobu örneklerine kıyasla gelişmiş floresan etiketleme gösterir. Etiket tutma genleşme mikroskobu, protein tutma genleşme mikroskobuna kıyasla yaklaşık altı kat daha yüksek floresan sinyali gösterir. LR-ExM, alt kırılma sınırı çözünürlüğüne sahip klatrin kaplı çukurlar gibi küçük yapıları etkili bir şekilde yakalayabilir.Mikrotübüller ve klatrin kaplı çukurlar, fonksiyonel ankrajlar, NHS MA dig ve NHS MA biyotin kullanılarak ko-immün boyalardı. Benzer şekilde, klatrin kaplı çukurlar ve mitokondri, BG MA biyotin ve BC MA kazma gibi üç fonksiyonel ankrajlı enzimatik bir protein etiketi yaklaşımı kullanılarak etiketlendi. Ayrıca, immün boyama temelli yaklaşım ve enzimatik protein etiketi yaklaşımı, lamin klima ve nükleopore kompleksinin yapısını göstermek için birleştirilmiştir.Etiket tutma genişleme mikroskobu, fare beyin dokusunda, presinaptik belirteç, Fagot ve postsinaptik belirteç, Homer 1'i boyayan ko-immün boya ile gerçekleştirildi. İki etiket net ve iyi ayrılmıştı, bu da yüksek çözünürlüğü ve etiketleme verimliliğini destekliyordu. Emek tutma genleşme mikroskobu, daha önce tanıtılan diğer genleşme mikroskopileriyle birleştirilebilen çok yönlü ve sağlam bir yöntemdir.Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için, moleküler ölçek yapısını daha iyi yakalamak için iyi bir etiketleme verimliliği elde etmek önemlidir. İşgücü tutma genleşme mikroskobu, sinyali geliştirmek için etkili ve sağlam bir yöntemdir.

label-retention-expansion-microscopy-lr-exm-enables-super-resolution

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Fare kulağı derisi kıl foliküllerini innerve eden palisade uçlarının mızrak şeklinde terminallerinin mekanik stimülasyonuna bağlı afferent deşarjı kaydetmek için basit ve yeni bir teknik sunulmuştur.

Fare Saç Folikül hançer Endings de Mekanik Uyarılmış Afferent Çıkışı ve Sinir Terminali Etiketleme Kombine Kaydı

Bu el yazması ile DNA probları fluorescently etiketli tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar etiketleme yöntemi açıklar. smFISH eş zamanlı algılama, Yerelleştirme ve miktar tek mRNA molekülleri sabit tek tek hücreleri içinde izin veren bir görselleştirme yöntemidir.

Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

Burada geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı süper kararlılık düşsel ve çok renkli tek molekül algılama birleştiren, bir tümleşik mikroskobu sistem inşaat pratik bir rehber mevcut de dahil olmak üzere tek molekül floresans rezonans enerji görüntüleme, maliyet-etkin bir şekilde bir set-up içine aktarın.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Süper çözünürlüklü mikroskopi, mayozdaki sinaptonemal kompleks içindeki bileşenlerin organizasyonu hakkında ayrıntılı bir fikir verebilir. Burada, Caenorhabditis elegans synaptonemal kompleksinin bireysel proteinlerini çözmek için bir protokol gösteriyoruz.

Caenorhabditis elegans Germline İçindeki Sinaptonemal Kompleksin Süper Rezolüsyonlu Mikroskopisi

Burada, konvansiyonel lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılarak süper çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için erken Drosophila embriyolarında genişleme mikroskobunun uygulanması için bir protokol sunulmaktadır.

Süper Çözünürlüklü Görüntüleme için Tam Montajlı Drosophila Embriyolarını Fiziksel Olarak Büyütmek için Genişleme Mikroskobunun Kullanılması

Burada, 11 kata kadar genişleme için modifiye edilmiş, kapsamlı bir biyomolekül sınıfı dizisini koruyan ve çok çeşitli doku tipleriyle uyumlu olan genişleme mikroskobunun (ExM) yeni bir versiyonu olan Magnify sunulmaktadır. Konvansiyonel kırınım sınırlı mikroskoplar kullanılarak biyomoleküllerin nano ölçekli konfigürasyonunun sorgulanmasını sağlar.

11 Katlı Genişleme Mikroskobu ile Üniversal Moleküler Retansiyon

Burada, rutin mikroskopi ekipmanı kullanarak hücre içi sialillenmiş N-glikoproteinlerin biyogörüntülemesine izin veren metabolik oligosakkarit mühendisliği, tıklama kimyası ve genleşme mikroskobunu birleştiren basit bir protokol öneriyoruz.

Click Kimyası ve Genleşme Mikroskobu ile Hücre İçi Sialilasyonun Görselleştirilmesi

Burada, kriyofiksasyon ve genleşme mikroskopisi yöntemlerini (Cryo-ExM) birleştiren ayrıntılı bir protokol sunuyoruz; bu protokol, çeşitli biyolojik örneklere uyarlanmış yapısal koruma ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme imkanı sağlıyor. Biyolojik örnekler donduruluyor, şişirilebilir bir polimere gömülüyor, denatüre edilir, genişletilir ve immünoetiketlenerek standart ışık mikroskoplarıyla süper çözünürlüklü görüntüleme yapılmasını sağlar.

Genişleme Mikroskopisi: Konvansiyonel Mikroskopla Yüksek Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme

Bu protokol, optik foton yeniden atamalı olan dönen disk konfokal mikroskobu kullanarak derin, tam hücre tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) uygulanma prosedürünü özetler; böylece özel optik veya karmaşık aydınlatmaya ihtiyaç olmadan DNA-PAINT görüntüleme mümkün olur.

Optik foton yeniden atamalı dönen disk konfokal üzerinde DNA-PAINT ile tüm hücre süper çözünürlüklü görüntüleme

Biz bakteriyel FtsZ-ring yapısal organizasyonu, hücre bölünmesi için gerekli bir aparat soruşturma için görüntüleme yöntemi bir süper-çözünürlük tarif. Bu yöntem, fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) kantitatif görüntü analizi dayanır ve diğer bakteri sitoskeletal proteinleri ile uygulanabilir.

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Keşfedin etiket tutma genişletme mikroskobu (LR-ExM) ile süper çözünürlüklü hücresel görüntüleme. Bu yöntem, trifonksiyonel bağlayıcılar kullanarak geleneksel yöntemlere göre 6 kat daha yüksek floresans sinyali sağlar.

Etiket Tutma Genişletme Mikroskobu (LR-ExM), Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Yüksek Verimli Etiketleme Sağlar

Daha fazla video keşfet