Name: Doğal Öldürücü Hücreler ve Nosiseptör Nöronlar Arasındaki Etkileşimi Ortaya Çıkarmak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Keşfedin doğal öldürücü hücreler ve nosiseptör nöronlar arasındaki etkileşimleri fare modelinde ortaya çıkarma yöntemini. Bu ortak kültür tekniği, iltihaplanma ve tümör bağışıklığı araştırmalarında yeni terapötik stratejiler geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Araştırma Fonu'nda Yeni Sınırlar (NFRFE201901326), Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (162211, 461274, 461275), Kanada İnovasyon Vakfı (37439), Kanada Araştırma Başkanı programı (950-231859), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (RGPIN-2019-06824) ve Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380) tarafından desteklenmiştir.

Université de Montréal'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri (#22053, #22054) tüm hayvan prosedürlerini onayladı. Çözümlerin ve bileşimlerinin listesi için Tablo 1'e ve bu protokolde kullanılan malzemelerin, ekipmanların ve reaktiflerin listesi için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. NK hücre izolasyonu, kültürü ve stimülasyonu
<ol><li>Nosiseptör nöronu bozulmadan üretin (çöp arkadaşı kontrolü; TRPV1wt::D TA fl/wt) ve ablatlanmış (TRPV1 cre::D TA fl/wt) fareler, lox-stop-lox-difteri toksin farelerini (DTA fl/fl) TRPV1cre/wt fareleri ile geçerek geçer.</li>
	<li>CO2 inhalasyonunu kullanarak, naif bir çöp arkadaşı kontrolü (TRPV1 wt::D TAfl/wt) faresini ötenazileştirin.</li>
	<li>Dalağı, 500 μL steril fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.</li>
	<li>Dalağı bir havane kullanarak homojenize edin.</li>
	<li>Hücreleri 1 mL steril PBS ile seyreltin.</li>
	<li>Karışımı 50 μm'lik bir hücre süzgecinden 15 mL'lik bir konik tüpe süzün.</li>
	<li>Steril PBS ile ses seviyesini (10 mL) doldurun.</li>
	<li>10 μL toplayın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.</li>
	<li>Hücreleri santrifüj edin (500 × g, 5 dakika) ve süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>Hücreleri takviyeli RPMI 1640 ortamında 108 hücre / mL konsantrasyonunda yeniden askıya alın.</li>
	<li>Bir fare NK hücre izolasyon kiti kullanarak dalak NK hücrelerini manyetik olarak arındırmak için üreticinin talimatlarını izleyin. Akış sitometrisi11'i kullanarak NK hücre saflığını onaylayın.</li>
	<li>10 μL toplayın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.</li>
	<li>Hücreleri santrifüj edin (500 × g, 5 dakika) ve süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>NK hücrelerini takviyeli RPMI 1640 kültür ortamında (IL-2 ve IL-15 içeren) yeniden askıya alın.</li>
	<li>Kültür 2 ×96 kuyucuklu bir U-alt plakada 48 saat boyunca 10 6 NK hücresi / mL.</li>
</ol>2. DRG nöron izolasyonu ve kültürü
<ol><li>NK hücre stimülasyonunun bitiminden 24 saat önce (adım 1.15), 96 delikli bir plakayı 100 μL / laminin (1 ng / mL) ile kaplayın ve 45 dakika (37 ° C) boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, çözeltiyi çıkarın ve kuyucukların bir biyogüvenlik kabininde hava ile kurumasına izin verin.</li>
	<li>CO2 inhalasyonunu kullanarak, nosiseptör nöronu bozulmadan ötenazi yapın (çöp arkadaşı kontrolü; TRPV1wt::D TA fl/wt) veya ablatlanmış (TRPV1cre::D TAfl/wt) fareler. NOT: CO2 inhalasyonu, DRG'ye bağlı spinal sinirleri bozmaktan kaçındığı için servikal çıkığa tercih edilir.</li>
	<li>Fareyi tahtaya eğilimli bir pozisyonda sabitleyin, cildi kaldırın ve cildi sırt sütunu boyunca kesin. Ayrıntılı bir video için Perner ve ark.12.</li>
	<li>Lumbosakral eklemi kesin ve sakrumu bel omurgasından makasla ayırın.</li>
	<li>Omurganın tabanına ulaşılana kadar omurganın her iki tarafındaki kasları ve kaburgaları kafatası yönünde keserek omurgayı ayırın.</li>
	<li>Makas kullanarak, atlanto-oksipital eklemdeki omurgayı kesin.</li>
	<li>Kas ve yağ dokusunu omurgadan çıkarın.</li>
	<li>Omuriliği çıkarmak ve DRG'ye erişmek için vertebral kolonu sabitleyin ve açın. DRG'yi, dorsal kök yoluyla omuriliğe bağlı, ancak meninkslerden ayrılmış intervertebral foraminada arayın.</li>
	<li>DRG'leri, 10 mL buz gibi soğuk takviyeli DMEM ile doldurulmuş 15 mL konik bir tüpe hasat edin.</li>
	<li>Preparatı santrifüj edin (200 × g, 5 dakika, oda sıcaklığı) ve süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>Kollajenaz IV (1 mg/mL) ve Dispase II (2.4 U/mL) içeren 250 μL PBS ekleyin.</li>
	<li>DRG'yi Kollajenaz IV/Dispase II (C/D) çözeltisi (80 dk, 37 °C, hafif ajitasyon) ile inkübe edin. Birkaç fareden gangliyonları toplarken, ganglion başına 125 μL C / D çözeltisi oranını koruyun.</li>
	<li>Enzimleri inaktive etmek için, 5 mL takviyeli DMEM ortamı ekleyin.</li>
	<li>Çözeltiyi santrifüj edin (200 × g, 5 dakika) ve bir pipet kullanarak süpernatantı yavaşça çıkarın.</li>
	<li>İstenmeyen hücre kaybını önlemek için, süpernatanın ~ 100 μL'sini bırakın.</li>
	<li>1 mL takviyeli DMEM ortamı ekleyin.</li>
	<li>Bir pipet tabancası ve boyutları azalan üç cam Pasteur pipeti kullanarak, DRG'yi tek hücreli bir preparatta yavaşça tritüre edin (Pasteur pipet boyutu başına ~10 yukarı/aşağı).</li>
	<li>Bir biyogüvenlik kabininde, sığır serum albüminini (BSA) steril PBS'de% 15'lik bir son konsantrasyona kadar seyreltin. −20 °C'de 1 mL aliquots saklayın.</li>
	<li>2 mL steril PBS ekleyerek ve tüpün dibine yavaşça 1 mL% 15 BSA çözeltisi dağıtarak 15 mL'lik bir konik tüpte bir BSA gradyanı oluşturun. Pipetleri nazikçe çıkararak gradyanı bozmaktan kaçının.</li>
	<li>Bir P200 pipet kullanarak, tritüne gangliyon süspansiyonunu (nöronları içeren) yavaşça tüpün yan tarafına gradyana pipetleyin.</li>
	<li>Nöron içeren BSA gradyanını santrifüj edin (200 × g, 12 dk, oda sıcaklığı). Santrifüjün hızlanmasını ve yavaşlamasını minimum hıza ayarlayın. NOT: Santrifüjlemeden sonra, nöronlar tüpün dibinde olurken, hücre kalıntıları BSA gradyanında sıkışıp kalacaktır.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak tüm süpernatantı nazikçe çıkarın.</li>
	<li>Hücreleri 500 μL Nörobazal içinde yeniden askıya alın.</li>
	<li>Laminin kaplı, düz tabanlı 96 kuyucuklu bir plakada kuyu başına10 4 nöron (200 μL nörobazal / kuyu) Plaka. NOT: Ortalama olarak, bir araştırmacı fare başına ~ 8 kuyu doldurabilecektir.</li>
	<li>Bağlanmaya izin vermek için nöronları (gece boyunca 37 ° C) kültürleyin.</li>
</ol>3. Ko-kültür ve akım sitometrisi
<ol><li>Nörobazal'ı nöron kültüründen yavaşça çıkarın.</li>
	<li>IL-2 ve IL-15 ile 48 saatlik stimülasyondan sonra (bkz. adım 1.14-1.15), NK hücrelerini yeniden askıya alın ve nöron kültürüne 105 NK hücresi / kuyusu ekleyin (96 kuyucuklu düz alt plaka). NOT: Ortalama olarak, araştırmacı fare başına ~ 6 kuyu doldurabilecektir.</li>
	<li>Takviyeli nörobazal MX'teki hücrelerin ortak kültürü (37 ° C, 48 saat).</li>
	<li>Hücreleri toplayın, PBS (3x) ile yıkayın ve santrifüj (500 × g, 5 dakika, 4 °C).</li>
	<li>Süpernatantı atın ve hücreleri Viability Dpaint eFlour-780 (1:1.000, 15 dk, 4 °C) ile lekeleyin.</li>
	<li>Hücreleri toplayın, PBS (3x) ve santrifüj (500 × g, 5 dakika, 4 °C) ile yıkayın.</li>
	<li>CD16/32 (1:100, 15 dk, 4 °C) ile hücrelerdeki spesifik olmayan bölgeleri bloke edin.</li>
	<li>Hücreleri toplayın, PBS (3x) ve santrifüj (500 × g, 5 dakika, 4 °C) ile yıkayın.</li>
	<li>BV421 anti-NK-1.1 (1:100), floresein izotiyosiyanat (FITC) anti-NKp46 (1:100) ve fikoeritrin (PE) anti-GM-CSF (1:100) içeren hücreler leke (15 dk, 4 °C).</li>
	<li>Hücreleri toplayın, PBS (3x) ve santrifüj (500 × g, 5 dakika, 4 °C) ile yıkayın.</li>
	<li>Süpernatanı atın, FACS tamponundaki hücreleri (500 μL) yeniden askıya alın ve NK hücrelerini akış sitometrisi11 ile immünofenotipleyin. Geçit stratejisi için Şekil 1A'ya bakın.</li>
</ol>

<ol><li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li>
<li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li>
<li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li>
<li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li>
<li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li>
<li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li>
<li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li>
<li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+or+adaptive+immunity%3F+The+example+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li>
<li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li>
<li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333(2021).</li>
<li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li>
<li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li>
<li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Davies ve ark.11 , yaralı nöronların RAE1'i yukarı regüle ettiğini bulmuşlardır. Hücre-hücre teması yoluyla , NKG2D eksprese eden NK hücreleri daha sonra RAE1 + nöronlarını tanımlayabilir ve ortadan kaldırabilir ve bu da kronik ağrıyı sınırlayabilir11. NK hücrelerinin ayrıca çeşitli nöropeptit reseptörlerini de eksprese ettiği ve bu nöropeptitlerin immünomodülatör yetenekleri ile bilindiği göz önüne alındığında, NK hücreleri ve nosiseptör nöronlar arasın...

Duyusal nöronların hücre gövdeleri dorsal kök ganglionlarından (DRG) kaynaklanır. DRG, periferik sinir sisteminde (PNS), omuriliğin dorsal boynuzu ile periferik sinir terminalleri arasında bulunur. DRG nöronlarının psödo-unipolar doğası, hedef dokuyu innerve eden periferik daldan, somatosensoriyel bilgiyi omuriliğe taşıyan merkezi dala bilgi aktarımına izin verir1. Özel iyon kanalı reseptörleri kullanarak, birinci dereceden nöronlar patojenlerin, alerjenlerin ve kirleticilerinoluşturduğu tehditleri algılar 2, bu da katyonların akışına (Na +, Ca2 +) ve bir aksiyon potansiyelinin üretilmesine yol açar 3,4,5.
Bu nöronlar ayrıca, ilk tehlike algılamasının gerçekleştiği çevreye doğru antidromik etki potansiyeli gönderir ve bu da nöropeptitlerin lokal salınımına yol açar 1,4. Bu nedenle, nosiseptör nöronlar, konağı çevresel tehlikeye karşı uyaran koruyucu bir mekanizma görevi görür 4,5,6,7.
İkinci dereceden nöronlarla iletişim kurmak için, nosiseptörler çeşitli nörotransmiterleri (örneğin, glutamat) ve nöropeptitleri (örneğin, kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP), madde P (SP) ve vazoaktif bağırsak peptidi (VIP))6,7 serbest bırakır. Bu peptitler kılcal damarlara etki eder ve plazma ekstravazasyonunu, ödemi ve bağışıklık hücrelerinin lokal akışını ve modülasyonunu teşvik eder 2,4,7.
Somatosensoriyel ve bağışıklık sistemleri, sitokinler ve nöropeptitlerden ve bunların ilgili konyak reseptörlerinden oluşan ortak bir iletişim sistemi kullanır4. Bu çift yönlü iletişim, tehlikeden korunmaya ve homeostazı korumaya yardımcı olurken, aynı zamanda hastalık patofizyolojisine de katkıda bulunabilir4.
NK hücreleri doğuştan gelen lenfoid hücreler olarak sınıflandırılır ve viral olarak enfekte olmuş hücreleri ortadan kaldırmak için uzmanlaşmıştır. NK hücre fonksiyonu, aktive edici reseptör NKG2D8 de dahil olmak üzere uyarıcı ve inhibitör reseptörlerin bir dengesi tarafından yönetilir. NKG2D'nin endojen ligandı olan retinoik asit erken indüklenebilir1 (RAE1), tümörigenez ve enfeksiyon 8,9 gibi stres altındaki hücreler tarafından eksprese edilir.
Son zamanlarda yapılan araştırmalar, periferik sinir hasarının duyusal nöronları stathmin 2 (STMN2) ve RAE1 gibi uyumsuz molekülleri eksprese etmeye yönlendirdiğini göstermiştir. Böylece, hücre-hücre teması yoluyla, NKG2D eksprese eden NK hücreleri, RAE1 eksprese eden nöronlarla etkileşim yoluyla aktive edildi. Buna karşılık, NK hücreleri yaralı nosiseptör nöronları ve normalde sinir hasarı ile ilişkili künt ağrı aşırı duyarlılığını ortadan kaldırabildi10. NKG2D-RAE1 eksenine ek olarak, NK hücreleri çeşitli nosiseptör tarafından üretilen mediatörler için konyak reseptörlerini eksprese eder. Bu nedenle, bu mediatörlerin NK hücre aktivitesini modüle etmeleri mümkündür. Bu yazıda nosiseptör nöron-NK hücre etkileşiminin biyolojisini araştırmak için bir ko-kültür yöntemi sunulmaktadır. Bu yaklaşım, nosiseptör nöronların doğuştan gelen bağışıklık hücresi yanıtlarını yaralanmaya, enfeksiyona veya maligniteye nasıl modüle ettiğinin anlaşılmasına yardımcı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>Anti-fare CD16/32</td><td>Jackson Laboratuvarı Kedi</td><td>no: 017769</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>Kedi no: 009669</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA) kültür sınıfı</td><td>Dünya Hassas Aletler Kedi</td><td>no: 504167</td><td></td></tr><tr><td>BV421 anti-fare NK-1.1</td><td>Fisher Scientific Cat</td><td>no: 12430112</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci (50 & mu; m)</td> <td>Fisher Bilimsel</td><td>Kedi no: A3160702</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz IV</td><td>Fisher Bilimsel Kedi</td><td>no: 15140148</td><td></td></tr><tr><td>Difteria toksinifl/fl</td><td>Fisher Bilimsel Kedi</td><td>no: SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat no: 13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td> <td>Fisher Bilimsel</td><td>Kedi no: 07-200-95</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Fare NK Hücre İzolasyon Kiti</td><td>Sigma</td><td>Cat no: CLS2595</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Sigma</td><td>Cat no: C0130</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>Sigma Cat</td><td>no: 04942078001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Sigma</td><td>Cat no: 806552</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-fare NKp46</td><td>Sigma</td><td>Cat no: L2020</td><td></td></tr><tr><td>Düz tabanlı 96 oyuklu plaka</td><td>Sigma</td><td>Cat no: 03690</td><td></td></tr><tr><td>Cam Pasteur pipeti</td><td>Sigma</td><td>Cat no: 470236-274</td><td></td></tr><tr><td>Glial hücre hattından türetilmiş nörotrofik faktör (GDNF)</td><td>VWR</td><td>Cat no: 02-0131</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Cedarlane</td><td>Cat no: 03-50/31</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>Cat no: A14867-01</td><td></td></tr><tr><td>Fare rekombinant IL-15</td><td>Gibco</td><td>Cat no: 22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Fare rekombinant IL-2</td><td>Gibco</td><td>Cat no: 21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Sinir Büyüme Faktörü (NGF)</td><td>Life Technologies</td><td>Cat no: 13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal media</td><td>PeproTech</td><td>Cat no: 450-51-10</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-fare GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>Cat no: 212-12</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin ve Streptomisin</td><td>PeproTech</td><td>Cat no: 210-15</td><td></td></tr><tr><td>Havaneli</td><td>Kök Hücre Teknolojisi</td><td>Kedi no: 19855</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Biolegend</td><td>Kedi no: 108732</td><td>Klon PK136 RPMI</td></tr><tr><td>1640 medya</td><td>Biolegend</td><td>Kedi no: 137606</td><td>Klon 29A1.4</td></tr><tr><td>TRPV1Cre</td><td>Biolegend</td><td>Kedi no: 505406</td><td>Klon MP1-22E9</td></tr><tr><td>Cımbız ve diseksiyon aletleri.</td><td>Biolegend</td><td>Kedi no: 65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>U-Şekilli-dipli 96 oyuklu plaka</td><td>Biolegend</td><td>Kedi no: 101319</td><td></td></tr><tr><td>Canlılık Boyası eFlour-780</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

doğal Öldürücü hücreler ve nosiseptör nöronlar arasındaki etkileşimi ortaya Çıkarmak

Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

Somatosensoriyel nöronlar, zararlı uyaranları tespit etmek ve savunma reflekslerini aktive etmek için evrimleşmiştir. İletişim araçlarını paylaşarak, nosiseptör nöronlar ayrıca bağışıklık sisteminin aktivitesini kontrol ederek konakçı savunmasını da ayarlar. Bu sistemler arasındaki iletişim çoğunlukla adaptiftir, homeostazı korumaya yardımcı olur, ayrıca kronik hastalıkların başlangıcına yol açabilir veya teşvik edebilir. Her iki sistem de, birincil ve ikincil lenfoid dokularda ve mukozada bulunan bu tür lokal etkileşime izin vermek için birlikte evrimleşmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, nosiseptörlerin yabancı antijenleri, bağışıklık hücresi kaynaklı sitokinleri ve mikropları doğrudan tespit ettiğini ve bunlara yanıt verdiğini göstermiştir.
Nosiseptör aktivasyonu sadece ağrı aşırı duyarlılığı ve kaşıntı ile sonuçlanmaz, aynı zamanda nosiseptör ateşleme eşiğini düşürür ve nöropeptitlerin lokal salınımına yol açar. Nosiseptörlerin periferik terminalleri tarafından üretilen ve salınan peptitler, lenfositlerin kemotaksisini ve polarizasyonunu bloke edebilir, inflamasyonun lokalizasyonunu, süresini ve tipini kontrol edebilir. Son kanıtlar, duyusal nöronların doğuştan gelen bağışıklık hücreleriyle hücre-hücre teması yoluyla etkileşime girdiğini, örneğin doğal öldürücü (NK) hücreler üzerindeki grup 2D (NKG2D) reseptörlerini kullandığını göstermektedir.
NK hücrelerinin çeşitli nosiseptör tarafından üretilen mediatörler için konyak reseptörlerini eksprese ettiği göz önüne alındığında, nosiseptörlerin NK hücrelerinin aktivitesini kontrol etmek için nöropeptitler kullandıkları düşünülebilir. Burada, bir tabaktaki nosiseptör nöron-NK hücre etkileşimlerini incelemek için bir ko-kültür yöntemi geliştirdik. Bu yaklaşımı kullanarak, lomber nosiseptör nöronların NK hücre sitokin ekspresyonunu azalttığını bulduk. Genel olarak, böyle bir indirgemeci yöntem, tümör innerve edici nöronların NK hücrelerinin antikanser fonksiyonunu nasıl kontrol ettiğini ve NK hücrelerinin yaralı nöronların ortadan kaldırılmasını nasıl kontrol ettiğini incelemek için yararlı olabilir.

NK hücreleri, çöp arkadaşı kontrolünden (TRPV1 wt: :D TAfl / wt) farelerin plenositlerinden manyetik olarak saflaştırıldı ve IL-2 ve IL-15 ile uyarıldı (48 saat). NK hücreleri daha sonra tek başlarına kültürlendi veya nosiseptör nörondan sağlam bir şekilde toplanan DRG nöronları ile birlikte kültürlendi (çöp arkadaşı kontrolü; TRPV1wt::D TA fl/wt) veya ablatlanmış (TRPV1cre::D TAfl/wt) fareler. Hücreler daha sonra TRPV1 agonisti kapsaisin (1 μM) veya aracı...

Nosiseptör nöronlar ve NK hücreleri aktif olarak enflamatuar bir bağlamda etkileşime girer. Bir ortak kültür yaklaşımı, bu etkileşimi incelemeyi sağlar.

Doğal Öldürücü Hücreler ve Nosiseptör Nöronlar Arasındaki Etkileşimi Ortaya Çıkarmak

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

Nosiseptör nöronun çeşitli nöropeptitler salgıladığı ve NK hücresinin bu nöropeptitler için reseptörü ifade ettiği göz önüne alındığında, NK hücresi ve nosiseptör nöronlar arasındaki etkileşimi incelemek için bir ko-kültür yöntemi geliştirmeye karar verdik. Böyle bir indirgemeci yöntem, nosiseptör nöronun NK hücresinin anti-tümör fonksiyonunu nasıl kontrol ettiğini incelemek için yararlı olabilir ve NK hücresinin yaralı nöronların eliminasyonunu nasıl kontrol ettiğini incelemek de ilginç olabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan eski bir yüksek lisans öğrencisi olan Ali Ahmedi olacak.Doğal katil veya NK hücre izolasyonuna ve kültürüne başlamak için, fare dalağını 500 mikrolitre steril PBS içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın, ardından bir havane kullanarak dalağı homojenleştirin. Daha sonra, hücreleri bir mililitre steril PBS ile seyreltin ve karışımı 50 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir konik tüpe süzün. Steril PBS kullanarak filtrelenmiş homojenat hacmini 10 mililitreye yükseltin.Bir hemositometre kullanarak seyreltilmiş homojenatın 10 mikrolitresindeki hücreleri sayın. Kalan hücreleri 500 G'de beş dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra hücreleri 10'da mililitre başına sekizinci hücrelere takviye edilmiş RPMI 1640 ortamında yeniden askıya alın.Bir fare NK hücre izolasyon kiti kullanarak dalak NK hücrelerini manyetik olarak saflaştırın ve akış sitometrisini kullanarak NK hücresinin saflığını onaylayın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın, ardından 500 G'de beş dakikada santrifüjleme yapın, ardından süpernatanı çıkarın. Peletlenmiş NK hücrelerini uyarmak için, bu hücreleri IL-2 ve IL-15 takviyeli RPMI 1640 kültür ortamında yeniden askıya alın.48 saat boyunca 96 kuyucuklu bir U alt plakasında mililitre başına altıncı NK hücrelerine iki kez 10 kez kültür yapın. NK hücresi stimülasyonundan 24 saat önce, 96 delikli plakayı kuyucuk başına 100 mikrolitre laminin ile kaplayın ve 37 santigrat derecede 45 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, çözeltiyi çıkarın ve kuyucukların biyogüvenlik kabininde hava ile kurumasına izin verin.Ardından, ötenazi faresini tahtaya eğilimli bir konumda sabitleyin. Cildi kaldırın ve cildi sırt sütunu boyunca kesin. Lumbosakral eklemi kesin ve sakrumu bel omurgasından makasla ayırın.Daha sonra kafatasının tabanına ulaşılana kadar her iki taraftaki kasları ve kaburgaları kafatası yönünde keserek omurgayı ayırın. Atlantioksipital eklemdeki omurgayı kesmek için makas kullanın. Ardından, kas ve yağ dokusunu omurgadan çıkarın.Dorsal kök yoluyla omuriliğe bağlı intervertebral foraminadaki dorsal kök ganglionuna veya DRG'ye erişmeden önce omuriliği çıkarmak için vertebral kolonu sabitleyin ve açın. Daha sonra, DRG'leri 10 mililitre buz gibi soğuk takviyeli DMEM ile doldurulmuş 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Daha sonra hazırlığı oda sıcaklığında 200 G'de beş dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın.Mililitre kollajenaz IV başına bir miligram ve mililitre dispase II başına 2.4 birim içeren 250 mikrolitre PBS ekleyin.Bu DRG'yi hafif ajitasyonla 80 dakika boyunca kollajenaz-dispaz çözeltisi ile inkübe edin. Enzimleri inaktive etmek için, beş mililitre takviyeli DMEM ortamı ekleyin ve çözeltiyi 200 G'de santrifüj edin.Beş dakika sonra, bir pipet kullanarak süpernatantı yavaşça çıkarın ve istenmeyen hücre kaybını önlemek için süpernatantın yaklaşık 100 mikrolitresini bırakın. Daha sonra, hücrelere bir mililitre takviyeli DMEM ortamı ekleyin ve DRG'yi tek bir hücre preparatına nazikçe tritüre etmek için bir pipet tabancası ve azalan boyutlarda üç cam Pasteur pipeti kullanın.Bir biyogüvenlik kabininde çalışırken, sığır serum albümini veya BSA'yı steril PBS'de% 15'lik bir son konsantrasyona kadar seyreltin ve eksi 20 santigrat derecede bir mililitre alikot saklayın. 15 mililitrelik konik bir tüpte bir BSA gradyanı oluşturmak için, iki mililitre steril PBS ekleyin ve ardından tüpün dibine bir mililitre% 15 BSA çözeltisi yavaşça dağıtın. Pipetleri nazikçe çıkararak gradyanı bozmaktan kaçının.Bir P200 pipet kullanarak, nöronları içeren üçlü gangliyon süspansiyonunu tüpün yan tarafına gradyana ekleyin. Daha sonra, BSA gradyanını içeren nöronu 200 G'de 12 dakika boyunca santrifüj etmek için hızlanmayı ve yavaşlamayı minimuma ayarlayın.Santrifüjlemeyi takiben, bir pipet kullanarak tüm süpernatantı çıkarın ve hücreleri 500 mikrolitre Neurobazal'da yeniden askıya alın. Laminin kaplı düz tabanlı 96 kuyucuklu bir plakada kuyucuk başına 10.000 nöron plakası.Nöronların bağlanmasına izin vermek için, 96 kuyucuklu plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Birlikte kültürlemeye başlamak için, nörobazal'ı nöron kültüründen yavaşça çıkarın. IL-2 ve IL-15 ile 48 saatlik stimülasyondan sonra, NK hücrelerini yeniden askıya alın ve nöron kültürüne kuyu başına beşinci NK hücrelerine 10 ekleyin.Takviyeli Neurobazal MX'teki hücreleri 37 santigrat derecede birlikte kültüre alın. 48 saat sonra, hücreleri PBS ile üç kez toplayın ve yıkayın ve dört santigrat derecede 500 G'de beş dakika boyunca santrifüj yapın. Hücreleri bir ila 1.000 seyreltilmiş canlılık boyası eFluor 780 ile dört santigrat derecede 15 dakika boyamadan önce süpernatantı atın.Hücreleri gösterildiği gibi yıkayın ve santrifüj yapın, ardından hücreler üzerindeki spesifik olmayan bölgeleri bloke etmek için dört santigrat derecede 15 dakika boyunca CD 1632 ile muamele edin, ardından hücreleri PBS ile üç kez toplayın ve yıkayın. Bir sonraki yıkama ve santrifüjleme döngüsünden sonra, hücreleri BV421, anti-NK-1.1, floresein izotiyosiyanat anti-NKp46 ve fikoeritrin anti-GM-CSF ile 15 dakika boyunca lekeleyin. Bir kez daha, hücreleri PBS ile üç kez toplayın ve yıkayın, onları santrifüj edin ve süpernatanı atın, ardından hücreleri 500 mikrolitre FACS tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometrisini kullanarak NK hücrelerini immünofenotipleyin.Tek başına kültürlendiğinde, NK hücreleri bazal granülosit makrofaj kolonisi uyarıcı faktör veya GM-CSF ve NKp46 seviyelerini eksprese etti. Nosiseptör sağlam farelerden toplanan DRG nöronları ile birlikte kültürlendiğinde, kapsaisin stimülasyonu GM-CSF'nin NK hücrelerinin ekspresyonunu azalttı. Kapsaisin, nosiseptör ablatlı farelerden toplanan DRG nöronları ile birlikte kültürlendiğinde NK hücre aktivasyonları üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır.NKp46 seviyesi etkilenmedi. Bu protokoldeki temel adımlar DRG ayrışması ve yalıtımıdır. Buradaki fikir, kabarcık yapmaktan kaçınarak ve doğru boyutta pipet kullanarak maksimum nöronal canlılığı korumaktır.Protokolden sonra, araştırmacı FACS saflaştırılmış hücrelerdeki transkript değişimini ölçmek için RNA dizilimini veya qPCR'yi kullanabilir veya sitokin veya nöropeptitlerin salgılanmasını ölçmek için ELISA'yı kullanabilir. Bu tür bir etkileşim, NK hücre fonksiyonunun muhtemelen nosiseptör nöron tarafından ayarlandığını ortaya koymaktadır. Ve bu çapraz konuşma, sinir hasarından, bakteriyel ve viral enfeksiyondan, malignitelere kadar uzanan biyolojik süreçlerde önemli olabilir.

teasing-out-interplay-between-natural-killer-cells-nociceptor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Doğal Öldürücü T hücreleri (NKT), kanser, autioimmunity düzenlenmesi, temizlenmesi enfeksiyon, ve artheriosclerotic plakların gelişimi bağışıklık yanıtı kritik belirleyicileri. Bu röportajda, Mitch Kronenberg NKT hücreleri glikolipid antijenler tarafından aktive edildiği mekanizmasını anlamak için onun laboratuar çabaları tartışıyor.

CD1d glikolipid Antijen Tanıtım ve NKT hücre Etkinleştirme Terapötik Potansiyeli: Röportaj

Periferik duyusal sinir lifi alt tiplerinin İmmünositokimyasal kimlik (ve orada protein ekspresyonu tespit), periferik hissi altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için kilit öneme sahiptir. Burada periferik duyusal sinir lifleri belirli immün için, deri ve bacak kemikleri gibi periferik / visseral doku örnekleri, hazırlama yöntemleri açıklanmaktadır.

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Bu video, DRG nöronlarının enzimatik sindirim, mekanik ayrışma ve gradyan santrifüjleme yoluyla izolasyonunu açıklar. DRG hücreleri, bağışıklık hücreleri ve duyusal nöronlar arasındaki etkileşimi incelemek için hücre dışı bir matris üzerinde doğal öldürücü hücrelerle birlikte kültürlenir.

Duyusal Nöronların İzole Edilmesi ve Doğal Öldürücü Hücrelerle Birlikte Kültürlenme

Ağrılı nöropatiler (PN) olarak nosiseptif intraepidermal sinir lifleri (IENFs) değişiklikleri incelemek için, doğrudan nosiseptif IENFs gözlenen üç boyutlu morfolojik değişiklikleri incelemek olabilir protokolleri geliştirmiştir. IENFs üç boyutlu analiz PN İESL morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için bir potansiyele sahiptir.

İnsan Cilt Biyopsiler içinde Nosiseptif İntraepidermal Sinir Elyaf üç boyutlu görüntüleme

Soğuk Plantar Testi (CPA), 30 °C ile 5 °C arasındaki soğuğa tepkiyi ölçer ve ayrıca soğuk adaptasyonunu da ölçebilir. Bu protokol, farelerde soğuk aşırı duyarlılığı, analjezi ve adaptasyonu ölçmek için CPA'nın nasıl kullanılacağını açıklar.

Fareler Soğuk Hassasiyeti ve Uyum belirlenmesi için Basit ve ucuz Yöntem

Kanser hücreleri tarafından doğal katil (NK) hücre aracılı eradikasyon kaçırma kanser inisiyasyonu ve ilerlemesi için önemlidir. Burada, hepatik tümör hücrelerine doğru NK hücre aracılı sitotoksisitesini değerlendirmek için radyoaktivite ye dayalı olmayan iki protokol siyoruz. Ayrıca, NK hücre geçişini çözümlemek için üçüncü bir protokol sunulur.

Hepatik Tümör Hücreleri Bağlamında Doğal Öldürücü Hücre Aracılı Sitotoksisite ve GöçÖlçümü

APTrack, gerçek zamanlı veri görselleştirme ve nöronal aksiyon potansiyellerinin kapalı döngü elektriksel eşik takibini sağlayan Open Ephys platformu için geliştirilmiş bir yazılım eklentisidir. Bunu mikronörografide insan C-fiber nosiseptörleri ve fare C-fiber ve Aδ-fiber nosiseptörleri için başarıyla kullandık.

Translasyonel ağrı araştırması için açık kaynaklı gerçek zamanlı kapalı döngü elektrik eşiği izleme

Nöronal membran proteazomu (NMP) yakın zamanda somatosensoriyel nöronların bir alt kümesinde dokunma, ağrı ve kaşıntı algısının önemli bir düzenleyicisi olarak tanımlandı. Bu makale, hücre sınıflandırması, transkriptom profili oluşturma ve kültür bazlı immünofloresan analizleri kullanarak hücre tipine özgü NMP ekspresyonunu ve fonksiyonunu analiz etmek için sağlam bir iş akışı sunmaktadır.

Somatosensoriyel Nöronlarda Nöronal Membran Proteazomunun Hücre Alt Tipine Özgü Analizi

Biz uzun bir süre boyunca floresan mikroskobu ile yaşam nöronlar mitokondri görüntüleme sağlayan bir protokol açıklar. Uzun süre üzerinden Görüntüleme mitochondrially hedef floresan protein ve laboratuvarımızda tasarlanmış ve inşa edilmiştir ucuz bir sahne top inkübatör kullanımı lentivirüs aracılı ifade aracılığıyla gerçekleştirilir.

Nöromodülasyon ve Mitokondrial Ulaştırma: Uzun Süreleri içinde Hipokampal Nöronlar Canlı Görüntüleme

Bu video, canlı hücre görüntüleme asimetrik sağlam duyu organı progenitör hücreleri ve epidermal hücrelerin bölünmesi için bir metodu...

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Keşfedin doğal öldürücü hücreler ve nosiseptör nöronlar arasındaki etkileşimleri fare modelinde ortaya çıkarma yöntemini. Bu ortak kültür tekniği, iltihaplanma ve tümör bağışıklığı araştırmalarında yeni terapötik stratejiler geliştirmeye yardımcı olur.

Doğal Öldürücü Hücreler ve Nosiseptör Nöronlar Arasındaki Etkileşimi Ortaya Çıkarmak

Daha fazla video keşfet