Name: Fotorespiratuar Mutantlarda Fotosentetik Etkinliğin Klorofil Floresan Analizi ile Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T12:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Öğrenin, klorofil floresans analizi ile düşük CO2 maruziyetinde fotosentetik etkinlik değişikliklerini nasıl ölçebilirsiniz. Bu yüksek verimli tarama yöntemi, fotorespiratuvar mutantları hızla belirlemek için idealdir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Louisiana Regents Kurulu (AWD-AM210544) tarafından finanse edilmiştir.

1. Tohum hazırlama ve sterilizasyon
NOT: Tohum hazırlama, tohum imbibleme ve tohum sterilizasyonundan oluşur. Tüm bu adımların steril koşulları korumak için laminer bir akış davlumbazında gerçekleştirileceğine dikkat etmek önemlidir. Gerekli tüm malzemeler, reaktifler ve büyüme ortamları otoklavlanmalıdır ( bkz.
<ol><li>Tohum imbibasyonu ve tabakalaşması NOT: Kullanılan tohum hatları plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) ve wild tiptir (WT, Col-0).<ol><li>Tohumları 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine dağıtın. Tohumları steril suda laminer bir akış başlığına batırın ve 2 gün boyunca karanlıkta 4 ° C'de tabakalaştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Tohum sterilizasyonu<ol><li>Steril koşullar altında, 10 mL% 50 (v / v) ağartıcı çözeltisi hazırlayın ve yaklaşık 20 μL Ara 20 ekleyin. Tohum sterilizasyonu için, emilen tohumlardan suyu çıkarın, mikrosantrifüj tüplerine 1 mL çamaşır suyu çözeltisi ekleyin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.</li>
		<li>Ağartıcı çözeltisini bir pipetle çıkarın.</li>
		<li>Tohumları yeniden sulandırmak için 1 mL steril suda durulayın. Tohumlar dibe çöktükten sonra suyu çıkarın. Adım 1.6 ve adım 1.7'yi yedi kez yineleyin.</li>
		<li>Tohumları steril% 0.1 agaroz çözeltisinde yeniden askıya alın.</li>
	</ol></li>
	<li>Tohum kaplama<ol><li>500 mL damıtılmış suya 5.43 g toz ekleyerek vitaminlerle 1 L hacimli Murashige & Skoog Bazal Medium ve 1.0 g / L 2-(N-morfonio) etansülfonik asit (MS) yapın. Potasyum hidroksit (KOH) kullanarak pH'ı 5,6 ila 5,8 arasında ayarlayın. Damıtılmış su kullanarak 1 L'ye kadar doldurun.<ol><li>Sıvı çözeltiyi 500 mL'ye bölün ve her yarısını manyetik bir karıştırma çubuğu içeren 1 L'lik bir şişeye yerleştirin. Her şişe için% 1'lik bir agar w / v çözeltisi elde etmek için 5 g agar tozu ekleyin.</li>
			<li>121 °C'de otoklav ve 30 dakika boyunca 15 psi; daha sonra yavaşça karıştırırken oda sıcaklığına yerleştirin. Soğutulduğunda, kare bir Petri kabına 25 mL MS agar dökün. Katılaşmasına izin verin. NOT: Bu Murashige & Skoog Bazal Orta plakalar, test mutantlarının yetiştirilmesi için% 1 vitamin içeren MS ortamı ve% 1 agar içerir.</li>
		</ol></li>
		<li>200 μL'lik bir pipet ucunu tıraş bıçağı ile kesin. 200 μL mikropipet kullanarak kare MS plakasının (Şekil 1) her test mutantı veya genotipi (1 cm 2 kare) için belirlenen kare ızgaranın ortasına bir tohum yerleştirin. NOT: 1 cm x 1 cm kare ızgara, fideler arasında eşit bir mesafe bırakmaya ve üst üste binmeyi önlemeye yardımcı olur, bu da daha sonraki floresan görüntüleme ve analizinde önemli olacaktır.</li>
		<li>Tohumlar kaplandıktan sonra, sızdırmazlık sağlamak için kapağın etrafına cerrahi bantla sarın ve aşağıda açıklandığı gibi büyüme odasına yerleştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Bitki büyümesi ve düşük CO2 arıtımı
<ol><li>Bitkileri 7-9 gün boyunca 20 ° C'de 120 μmol · m − 2s − 1 ve 16 saat karanlık 18 ° C'de 8 saatlik bir ışık döngüsü altında büyütün. Görüntüleme için yeterince büyük olup olmadıklarını belirlemek için bitkileri 6. günde kontrol edin. Kaplamadan sonraki 8. günde, bitkileri düşük CO2'ye maruz bırakın.</li>
	<li>Düşük CO2 tedavisi<ol><li>7-9 gün sonra, ortam büyüme odası koşullarından sekiz plakadan dördünü 20 ° C'lik fotorespiratuar koşullara, 200 μmol · m − 2s − 1 sürekli ışık seviyelerine ve12 saat boyunca düşük CO 2'ye yerleştirin.</li>
		<li>Düşük CO2 koşulunu, kabın altına yerleştirilmiş 100 g soda kireci içeren hava geçirmez şeffaf bir kap kullanarak oluşturun. Kabı kontrol ile aynı büyüme odasına yerleştirin. Kontrol tesislerini 12 saat boyunca ortam CO 2'de 120μmol·m−2 s−1'in altında tutun.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Floresan görüntüleme sisteminin yapılandırılması
<ol><li>Floresan görüntüleme sisteminde kameranın altında ortalanmış bir test plakasını (bölüm 1 ve bölüm 2'ye göre hazırlanmış) sabit bir mesafeye yerleştirin.</li>
	<li>Cihazın yazılımında, Canlı Pencere'ye gidin ve aktinik olmayan ölçüm flaşlarını açmak için Yanıp Sönüyor kutusunu işaretleyin.</li>
	<li>Tam ve keskin bir görüntü görünene kadar Yakınlaştırma ve Odaklama araçlarına tıklayın. Bu amaçla, bitkiler ve kamera arasındaki mesafeyi ayarlamak için bir sahne veya raf kullanın. Tüm deneme boyunca yakınlaştırmayı, odağı ve kameradan uzaklığı sabit tutun.</li>
	<li>El. Deklanşör değerini 0 olarak ayarlayın ve 200-500 dijital ünite aralığında bir floresan sinyali almak için Hassasiyet'i ayarlayın. NOT: Daha düşük bir El. Deklanşör değeri (0-1), ölçüm flaşlarının aktinik olmamasını sağlarken, daha yüksek bir değer (2) görüntünün çözünürlüğünü artıracaktır.</li>
	<li>Bir ışık ölçeri fotoğraf makinesi ayarlarını yapmak için kullanılan konuma yerleştirin.</li>
	<li>Canlı Pencerede, 800 ms süren doygun bir nabız başlatmak için Süper kutusunu işaretleyin. Yeni bir nabız için her seferinde kutuyu işaretlemeyi unutmayın.</li>
	<li>Işık ölçer 6.000-8.000 μmol·m−2s−1 okuyana kadar Süper darbenin göreli güç yüzdesini ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın.</li>
</ol>4. Kuantum verim programını tasarlayın
<ol><li>Görüntüleme sistemi için standart işletim araçlarını içe aktarın. default.inc dosyasını dahil et light.inc dosyasını dahil edin NOT: Bu deneyde referans olarak kullanılan program sözdizimi bir FluorCam görüntüleme sistemi içindir.</li>
	<li>Yapılandırılan ışık ayarlarına göre aşağıdaki global değişkenleri tanımlayın: Deklanşör = 0 Hassasiyet = 40 Süper = 65</li>
	<li>Verileri günlüğe kaydetmek için zaman adımını ekleyin: TS = 20ms</li>
	<li>Fo ölçümünü, karanlık uyarlanmış bir durumda floresan örnekleyerek toplayın. F0duration = 2s; F0period = 200ms; NOT: F0duration , karanlığa uyarlanmış floresanın kaydedildiği zaman aralığını tanımlar. F0period , karanlığa uyarlanmış floresan ölçümünün tekrarlandığı zaman aralığını tanımlar.</li>
	<li>Fo ölçümlerini veri tablolarına kaydedin. <0,F0period.. F0duration>=>mfmsub <0'lar>->kontrol noktası,"startFo" <F0duration - F0period>=>checkpoint,"endFo"; Burada < , > zamana göre endekslenen floresan değerleri kümesini temsil eder; => ölçümleri bir sistem dosyasında depolar; mfmsub, deneme için tüm veri kümesini temsil eder; ve checkpoint, startFo gibi belirli ölçümlerin verileri için bir alt küme oluşturur.</li>
	<li>Doygun bir darbeden sonra floresan örnekleyerek Fm ölçümünü toplayın ve saklayın. PulseDuration=960ms; ## a1=F0duration + 40ms a2 = a1 + 480ms; <a1>=>SatPulse(PulseDuration); <a1 + 80ms, a1 + 160ms.a1 + PulseDuration>=>mfmsub <a1 + PulseDuration + 80ms>=>mfmsub; <a2>=>checkpoint,"startFm" <a1 + PulseDuration - 80ms>=>checkpoint,"endFm" <a2 + 80ms>=>checkpoint,"timeVisual"; A1 ve a2'nin örnekleme süresini doygunluk darbesiyle koordine etmek için değişkenler olduğu durumlarda; a1, Fm ölçümünün başlangıç zamanını temsil eder; ve a2, nabzın orta nokta zamanını temsil eder.</li>
</ol>5. İşlenmiş numunelerin kuantum veriminin ölçülmesi
<ol><li>İşlemden hemen sonra, karanlık adaptasyon için plakaları 15 dakika boyunca alüminyum folyo ile örtün. Fotosistem II'nin kuantum verimini nabız genliği modifiye edilmiş bir florometre ile ölçmek için folyoyu çıkarın. Ardından, fide plakasını doğrudan kameranın altına yerleştirin ve GitHub deposunda bulunan kuantum verim protokolünü çalıştırın.</li>
	<li>GitHub'dan quantum_yield protokolünü indirin (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) veya bölüm 4'ten benzer şekilde tasarlanmış bir program kullanın. Klasör simgesine tıklayıp dosya konumuna giderek program dosyasını açmak için florometrenin yazılımını kullanın.</li>
	<li>Kırmızı yıldırım simgesine tıklayarak kuantum verim programını çalıştırın.</li>
	<li>Protokol tamamlandıktan sonra, ön analiz penceresine gidin. Plaka görüntüsündeki her fide için tüm pikselleri vurgulamak üzere Seçim Araçları'nı kullanarak plakayı tek tek fidelere bölün. Vurgulanan arka plan piksellerini kaldırmak için Arka plan hariç tutma'yı tıklayın ve yalnızca fide alanını bırakın.</li>
	<li>Plaka görüntüsündeki her fide için floresan verileri oluşturmak üzere Analiz Et'e tıklayın. Tüm plakalar arasında tutarlı minimum ve maksimum değerleri görüntülemek için floresan değer aralığını manuel olarak ayarlayın.</li>
	<li>Deneme sekmesinden Sayısal-Ortalama seçeneğine tıklayın | İhracat | Sayısal. Tüm veriler ve sütuna göre seçeneğini belirleyin ve her fide için QY ölçümlerini içeren bir metin dosyası oluşturmak üzere Tamam'ı tıklatın.</li>
</ol>6. Veri dosyasını açma
<ol><li>Metin dosyasını analiz için bir e-tabloda açın. Alan numarasını, piksel boyutunu, Fm, Ft, Fq ve QY'yi gösteren başlıklardan, çekirdek genotip (WT veya test mutant) ve QYmax için alan numarasını tanımlayın. Önemi belirlemek için vahşi tipe göre çift yönlü bir t-testi yapın. Veriler, p-değerleri 0,05'in altında olduğunda önemli ölçüde farklı olarak yorumlanır.</li>
</ol>

<ol><li>Peterhansel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorespiration%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Photorespiration.</a> Arabidopsis Book. 8, 0130(2010).</li>
<li>Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-expression+analysis+as+tool+for+the+discovery+of+transport+proteins+in+photorespiration%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration.</a> Plant Biology. 15 (4), 686-693 (2013).</li>
<li>Eisenhut, M., Pick, T. R., Bordych, C., Weber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+closing+the+remaining+gaps+in+photorespiration--the+essential+but+unexplored+role+of+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards closing the remaining gaps in photorespiration--the essential but unexplored role of transport proteins.</a> Plant Biology. 15 (4), 676-685 (2013).</li>
<li>Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+costs+of+photorespiration+to+food+production+now+and+in+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The costs of photorespiration to food production now and in the future.</a> Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 107-129 (2016).</li>
<li>South, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acid+sodium+symporter+BASS6+can+transport+glycolate+and+is+involved+in+photorespiratory+metabolism+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Bile acid sodium symporter BASS6 can transport glycolate and is involved in photorespiratory metabolism in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell. 29 (4), 808-823 (2017).</li>
<li>Pick, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGG1%2C+a+plastidic+glycolate+glycerate+transporter%2C+is+required+for+photorespiration+and+defines+a+unique+class+of+metabolite+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PLGG1, a plastidic glycolate glycerate transporter, is required for photorespiration and defines a unique class of metabolite transporters.</a> Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 110 (8), 3185-3190 (2013).</li>
<li>Kuhnert, F., Schlüter, U., Linka, N., Eisenhut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+proteins+enabling+plant+photorespiratory+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Transport proteins enabling plant photorespiratory metabolism.</a> Plants. 10 (5), 880(2021).</li>
<li>Badger, M. R., Fallahi, H., Kaines, S., Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+fluorescence+screening+of+Arabidopsis+thaliana+for+CO2+sensitive+photorespiration+and+photoinhibition+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll fluorescence screening of Arabidopsis thaliana for CO2 sensitive photorespiration and photoinhibition mutants.</a> Funct Plant Biology. 36 (11), 867-873 (2009).</li>
<li>Ogawa, T., Sonoike, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+mutants+using+chlorophyll+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Screening of mutants using chlorophyll fluorescence.</a> Journal of Plant Research. 134 (4), 653-664 (2021).</li>
<li>Kleffmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana+chloroplast+proteome+reveals+pathway+abundance+and+novel+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions.</a> Current Biology. 14 (5), 354-362 (2004).</li>
<li>Hempel, J. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Molecular+characterization+of+the+plastid-localized+ABC+protein+TAP1+in+Arabidopsis+thaliana%22">Molecular characterization of the plastid-localized ABC protein TAP1 in Arabidopsis thaliana</a>. , University of Stavanger. Ph.D. thesis (2018).</li>
</ol>

Yazarların rakip finansal çıkarları veya çıkar çatışmaları yoktur.

Bu makalede özetlenen deneysel yöntemler bazı avantajlar ve sınırlamalarla birlikte gelir. Bir avantaj, bu yöntemin birçok bitki fidesini tarayabilmesidir, ancak kaplama ve yetiştirme işlemi sırasında bitki ortam plakasının kirlenmesini önlemek için bazı önlemler alınmalıdır. Bu nedenle, Arabidopsis plakalarını cerrahi bantla kapatmak çok önemlidir. Bu deneyin bir diğer avantajı, daha önceyayınlanan 8 çalışmasına kıyasla 12 saatlik daha kısa bir fotorespiratuar stres süresine sahip olmasıdır. Teda...

Çiftçi tarlalarında yaygın olarak görülen abiyotik stres koşulları, fotosentetik verimliliği azaltarak mahsul verimini olumsuz yönde etkileyebilir. Isı dalgaları, iklim değişikliği, kuraklık ve toprak tuzluluğu gibi zararlı çevresel koşullar, CO2 kullanılabilirliğini değiştiren ve bir bitkinin yüksek ışık stresine tepkisini azaltan abiyotik streslere neden olabilir. En büyük iki karasal karbon akışı, bitki büyümesi ve mahsul verimi için gerekli olan fotosentez ve fotoresolunumdur. Bu süreçlerde yer alan önemli proteinlerin ve enzimlerin birçoğu laboratuvar koşullarında karakterize edilmiş ve genetik seviye1'de tanımlanmıştır. Fotosentez ve fotorespirasyonun anlaşılmasında çok ilerleme kaydedilmesine rağmen, bitki organelleri arasındaki taşıma da dahil olmak üzere birçok adım karakterize edilmemiştir 2,3.
Fotosentezden sonra bitkilerdeki en büyük ikinci karbon akışı olan fotorespirasyon, Rubisco enziminin karbondioksit yerine oksijeni ribuloz 1,5 bisfosfata (RuBP) sabitleyerek inhibitör bileşik 2-fosfoglikolat (2PG) 1'i üretmesiyle başlar. 2PG'nin inhibitör etkilerini en aza indirmek ve daha önce sabitlenmiş karbonu geri dönüştürmek için, C3 bitkileri çok organellar fotorespirasyon sürecini geliştirmiştir. Fotorespirasyon, 2PG'nin iki molekülünü, C3 karbon fiksasyon döngüsü1'e tekrar girebilen bir 3-fosfogliserat (3PGA) molekülüne dönüştürür. Böylece, fotorespirasyon, daha önce sabitlenmiş karbonun sadece% 75'ini 2PG üretiminden dönüştürür ve süreçte ATP tüketir. Sonuç olarak, fotorespirasyon işlemi, su mevcudiyetine ve büyüme mevsimi sıcaklıklarına bağlı olarak, fotosentetik işlem üzerinde% 10 -% 50'lik önemli bir sürüklenmedir4.
Fotorespirasyonda yer alan enzimler on yıllardır araştırma odağı olmuştur, ancak en az 25 taşıma adımısürece dahil olmasına rağmen, genetik düzeyde sadece az sayıda taşıma proteini karakterize edilmiştir 5,6,7. Fotorespirasyon sürecinde üretilen karbonun hareketine doğrudan dahil olan iki taşıma proteini, her ikisi de kloroplast 5,6'dan glikolat ihracatında rol oynayan plastidik glikolat / gliserat taşıyıcı PLGG1 ve safra asidi sodyum simporter BASS6'dır.
Ortam [CO2] altında, Rubisco bir oksijen molekülünü RuBP'ye zamanın yaklaşık% 20'sinde sabitler1. Bitkiler düşük [CO 2] 'ye maruz kaldığında, fotorespirasyon oranları artar, bu da düşük [CO2] 'yi, yüksek fotorespirasyon stresi altında önemli olabilecek mutantları test etmek için ideal bir ortam haline getirir. 24 saat boyunca düşük CO2 altında ek varsayılan kloroplast taşıma proteini T-DNA hatlarının test edilmesi ve klorofil floresansındaki değişikliklerin ölçülmesi, fotorespirasyon mutant fenotip5'i gösteren bass6-1 bitki hatlarının tanımlanmasına yol açmıştır. Daha ileri karakterizasyon, BASS6'nın kloroplastın iç zarında bir glikolat taşıyıcı olduğunu göstermiştir.
Bu makale, başlangıçta BASS6'yı kloroplast zarı içinde bulunan varsayılan taşıma proteinlerinin bir listesinden gelen bir fotorespirasyon taşıyıcısı olarak tanımlamak için kullanılana benzer bir protokolü ayrıntılı olarak açıklamaktadır8 Bu protokol, Arabidopsis T-DNA mutantlarını veya EMS tarafından üretilen mutant bitkileri, ısı gibi bir dizi abiyotik stres altında fotosentetik verimliliği korumak için önemli olan genleri tanımlamanın bir yolu olarak karakterize eden yüksek verimli bir deneyde kullanılabilir. yüksek ışık stresi, kuraklık ve CO2 kullanılabilirliği. Klorofil floresansı kullanarak bitki mutantlarının taranması, geçmişte primer metabolizma için önemli olan genleri hızlı bir şekilde tanımlamak için kullanılmıştır9. Arabidopsis genomunun% 30'u bilinmeyen veya zayıf karakterize edilmiş fonksiyona sahip proteinleri kodlayan genleri içerdiğinden, fotosentetik verimliliğin strese bağlı analizi, mutant bitkilerde kontrollü koşullar altında gözlenmeyen moleküler fonksiyonlar hakkında fikir verebilir10. Bu yöntemin amacı, düşük CO2 taraması kullanarak fotorespiratuar yolun mutantlarını tanımlamaktır. Düşük CO2'ye maruz kaldıktan sonra fotorespirasyonu bozan mutantları tanımlamak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemin bir avantajı, nispeten kısa sürede yapılabilecek fideler için yüksek verimli bir tarama olmasıdır. Video protokolü bölümleri, tohum hazırlama ve sterilizasyonu, bitki büyümesi ve düşük CO2 arıtma, floresan görüntüleme sisteminin konfigürasyonu, işlenmiş numunelerin kuantum veriminin ölçülmesi, temsili sonuçlar ve sonuçlar hakkında ayrıntılı bilgi sağlar.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpü</td><td>VWR</td><td>10810-070</td><td>tohum sterilizasyonu için</td></tr><tr><td>kap</td><td>agaroz VWR</td><td>9012-36-6</td><td>kaplama kolaylığı için tohumları askıya almak için kullanılan kimyasal</td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana tohumlar (abcb26)</td><td>ABRC, TAIR aracılığıyla sipariş edilen www.arabidopsis.org</td><td>SALK_085232</td><td>arabidopsis tohumları deney grubu</td></tr> <tr><td>olarak kullanıldıArabidopsis thaliana tohumları (plgg1-1)</td><td>ABRC, TAIR www.arabidopsis.org aracılığıyla sipariş edilen SALK_053469C</td><td></td><td>ebeveyn arabidopsis tohumları&nbsp;</td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana tohumları (WT)</td><td>ABRC, TAIR aracılığıyla sipariş edilen www.arabidopsis.org</td><td>Col-0</td><td>arabidopsis yabani türü tohumlar kontrol grubu olarak kullanılır</td></tr><tr><td>&nbsp; çamaşır suyu&nbsp;</td><td>Clorox</td><td>Jenerik Çamaşır Suyu&nbsp;</td><td>Tohumları sterilize etmek için kullanılan kimyasal</td></tr><tr><td>Karbolime emici</td><td>Medline ürünleri</td><td>S232-104-001</td><td>CO2 emici</td></tr><tr><td>Kapalı FluorCam</td><td>Foton Sistemleri Enstrümanlar</td><td>FC 800-C</td><td>Floresan görüntüleyici</td></tr><tr><td>FluoroCam FC 800-C</td><td>Foton Sistemleri Aletleri</td><td>Kapalı FluorCam FC 800-C/1010-S</td><td>Floresan görüntüleyici</td></tr><tr><td>FluoroCam7</td><td>Foton Sistemleri Aletleri</td><td>Kapalı FluorCam FC 800-C/1010- S</td><td>Floresan görüntü analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Gelzan (bitki agar)</td><td>Phytotech labs</td><td>71010-52-1</td><td>MS ortamını plakalar halinde katılaştırmak için kullanılan kimyasal&nbsp;</td></tr><tr><td>cam şişe 1 L</td><td>Fisherbrand</td><td>FB5011000</td><td>kabı MS medya büyüme odası yapmak ve otoklavlamak için</td></tr><tr>kullanılır büyüme<td>odası</td><td>caron</td><td>7317-50-2</td><td>bitki yetiştirmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Bazal Ortam Vitaminler ve Vitaminler İçeren 1.0 g/L MES (MS)</td><td>Phytotech labs</td><td>M5531&nbsp;</td><td>Arabidopsis fidanları için büyüme ortamı&nbsp;</td></tr><tr><td>potasyum Hidroksit (KOH)</td><td>Phytotech labs</td><td>1310-58-3</td>, <td>ph ayarı örümcek ışıkları için 1 M'lik bir çözelti oluşturur</td></tr><tr><td></td> Işık tahlilinde kullanılan <td>Mean Well Enterprises</td><td>XLG-100-H-AB</td><td>ışıkları&nbsp;</td></tr><tr><td>Izgaralı Kare Petri Kabı, steril</td><td>Simport Scientific</td><td>D21016</td>, <td>arabidopsis fideleri için MS ortamını tutmak için kullanılır,</td></tr><tr><td>cerrahi bant</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td>bant, 20 biorad arası plakaları kapatmak için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td></td><td>; 9005-64-5</td><td>Tohum sterilizasyonuna yardımcı olmak için kullanılan yüzey aktif madde</td></tr></tbody></table>

fotorespiratuar mutantlarda fotosentetik etkinliğin klorofil floresan analizi ile değerlendirilmesi

Evaluation of Photosynthetic Efficiency in Photorespiratory Mutants by Chlorophyll Fluorescence Analysis

Fotosentez ve fotorespirasyon, bitki primer metabolizmasındaki en büyük karbon akışlarını temsil eder ve bitki hayatta kalması için gereklidir. Fotosentez ve fotorespirasyon için önemli olan enzimlerin ve genlerin birçoğu on yıllardır iyi çalışılmıştır, ancak bu biyokimyasal yolakların bazı yönleri ve bunların birkaç hücre altı süreçle olan etkileşimleri henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bitki metabolizmasında önemli olan genleri ve proteinleri tanımlayan çalışmaların çoğu, fotosentez ve fotorespirasyonun doğal ve tarım ortamlarında nasıl çalıştığını en iyi şekilde temsil etmeyebilecek oldukça kontrollü ortamlar altında gerçekleştirilmiştir. Abiyotik stresin fotosentetik verimliliğin bozulmasına neden olduğu göz önüne alındığında, hem abiyotik stresi hem de fotosentez üzerindeki etkisini izleyebilen yüksek verimli bir ekranın geliştirilmesi gereklidir.
Bu nedenle, klorofil floresan analizi ve düşük CO2 taraması kullanarak fotorespirasyonda rolleri olan karakterize edilmemiş genleri tanımlayabilen fotosentetik verimlilikte abiyotik strese bağlı değişiklikleri taramak için nispeten hızlı bir yöntem geliştirdik. Bu yazıda, Arabidopsis thaliana'da transfer edilen DNA (T-DNA) nakavt mutantlarında fotosentetik verimlilikteki değişiklikleri incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Aynı yöntem, etil metansülfonat (EMS) kaynaklı mutantların taranması veya baskılayıcı taramanın yapılması için de kullanılabilir. Bu yöntemin kullanılması, bitki primer metabolizması ve abiyotik stres yanıtlarında daha fazla çalışma için gen adaylarını belirleyebilir. Bu yöntemden elde edilen veriler, artan stres ortamlarına maruz kalana kadar tanınmayabilecek gen fonksiyonu hakkında fikir verebilir.

Sonuçlar, WT ve test mutantlarının ortam ve düşük CO2 taramasından ham ve floresan görüntülerin plaka görüntülerini göstermektedir. Her plantlet, QY olarak verilen karşılık gelen floresan okumaları ile alan numarası ile etiketlenir. Veriler metin dosyası olarak dışa aktarılır ve analiz için bir elektronik tabloda açılabilir (bkz. Ek Tablo S1). Fotorespiratuar stres ile ilişkili genlerin pozitif ve negatif tanımlanmasını göstermek için plgg1-1 ve abcb26 mutant hatları seçildi....

Klorofil floresansı kullanılarak düşük CO2 ile muamele edildikten sonra bitkilerde fotosentetik verimlilikteki değişiklikleri ölçmek için bir yaklaşım tanımladık.

Fotorespiratuar Mutantlarda Fotosentetik Etkinliğin Klorofil Floresan Analizi ile Değerlendirilmesi

Photosynthesis and photorespiration represent the largest carbon fluxes in plant primary metabolism and are necessary for plant survival. Many of the ...

Bu yöntemin amacı, düşük CO2 taraması kullanarak fotorespiratuar yoldaki mutantları tanımlamaktır. Düşük CO2'ye maruz kaldıktan sonra fotorespirasyonu bozan mutantları tanımlamak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemin bir avantajı, nispeten kısa sürede yapılabilecek fideler için yüksek verimli bir tarama olmasıdır.Aşağıdaki bölümlerde tohum hazırlama ve sterilizasyonu, bitki büyümesi ve düşük CO2 arıtımı hakkında ayrıntılı bilgi verilecek, floresan görüntüleme sistemi yapılandırılacak, işlenmiş numunelerin kuantum verimi ölçülecek, temsili sonuçlar ve sonuçlar elde edilecektir. Tohum hazırlama ve sterilizasyon. Tohum hazırlama, tohum emdirme ve tohum sterilizasyonundan oluşur.Tüm bu adımların steril koşulları korumak için laminer bir akış davlumbazında yapıldığına dikkat etmek önemlidir. Gerekli tüm malzemeler, reaktifler ve büyüme ortamı otoklavlanır. Kullanılan tohum hatları plgg1-1, abcb26 ve WT veya wild tipindedir.Tohumları laminer bir akış başlığında steril suda emilir, daha sonra iki gün boyunca karanlıkta dört santigrat derecede tabakalaşır. Steril koşullar altında, hacimsel ağartıcı çözeltisine 10 mililitre% 50 hacim hazırlayın ve yaklaşık 20 mikrolitre Ara 20 ekleyin. Emilmiş tohumlardan suyu çıkarın, ardından mikrosantrifüj tüpüne bir mililitre çamaşır suyu çözeltisi ekleyin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.Ağartıcı çözeltisini bir pipetle çıkarın. Tohumları yeniden asmak için bir mililitre steril suda durulayın. Tohumlar dibe çöktükten sonra suyu çıkarın.Tohumları steril% 0.1 agaroz çözeltisinde askıya alın. Tohum kaplaması için,% 1 MS vitamin içeren bazal orta plakalar ve% 1 agar test mutantlarının yetiştirilmesi için. 200 mikrolitrelik pipet ucunu tıraş bıçağı ile kesin.Bir pipet kullanarak, her test mutantı veya genotipi için belirlenen kare ızgaranın ortasına bir tohum yerleştirin. Burada, birer birer santimetre ızgaralı kare bir plaka kullanılır. Bu, her fide arasında eşit mesafeyi korumaya ve daha sonra floresan görüntüleme ve analizinde önemli olacak olan üst üste binmeyi önlemeye yardımcı olur.Tohumlar kaplandıktan sonra, sızdırmazlık sağlamak için kapağın etrafına cerrahi bant sarın, ardından büyüme odasına yerleştirin. Bitki büyümesi ve düşük CO2 arıtma. Bitkileri yedi ila dokuz gün boyunca 20 santigrat derecede sekiz saatlik bir ışık döngüsü altında saniyede metre kare başına 120 mikromol ve 18 santigrat derecede 16 saat karanlık altında yetiştirin.Görüntüleme için yeterince büyük olup olmadıklarını belirlemek için altıncı günde bitkileri kontrol edin. Kaplamadan sonraki sekizinci günde, bitkileri düşük CO2'ye maruz bırakın. Arıtma tesislerini, 12 saat boyunca saniyede metrekare başına 200 mikromol ışık yoğunluğuna sahip büyüme odasındaki kapalı bir kutuya yerleştirin.Düşük CO2 koşulu, kabın altına yerleştirilmiş 100 gram soda kireci bulunan hava geçirmez şeffaf bir kap kullanılarak inşa edilmiştir. Konteyner, kontrol ile aynı büyüme odasına yerleştirildi. Kontrol tesisleri, 12 saat boyunca ortam CO2'sinde saniyede metre kare başına 120 mikromolün altında kalacaktır.Floresan görüntüleme sistemini yapılandırın. Floresan görüntüleme sisteminde kameranın altında ortalanmış bir test plakasını sabit bir mesafeye yerleştirin. Cihaz yazılımında, canlı pencereye gidin ve aktinik olmayan ölçüm flaşlarını açmak için Yanıp sönüyor kutusunu işaretleyin.Tam ve keskin bir görüntü görene kadar yakınlaştırma ve odaklama araçlarına tıklayın. EL deklanşörünün değerini sıfıra ayarlayın ve 200 ila 500 dijital ünite aralığında bir floresan sinyali almak için hassasiyeti ayarlayın. Bir ışık ölçeri fotoğraf makinesi ayarlarını yapmak için kullanılan konuma yerleştirin.Canlı pencerede, 800 milisaniye süren doygun bir nabız başlatmak için Süper kutusunu işaretleyin. Işık ölçer saniyede metrekare başına 6.000 ila 8.000 mikromol okuyana kadar Süper darbenin göreceli güç yüzdesini ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın. İşlenmiş numunelerin kuantum verimini ölçün.İşlemden hemen sonra, karanlık adaptasyon için plakaları 15 dakika boyunca alüminyum folyo ile örtün. Darbe genliği modifiye edilmiş bir florometre ile fotosistem iki'nin kuantum verimini ölçmek için folyoyu çıkarın. Ardından fide plakasını doğrudan kameranın altına yerleştirin ve GitHub depomuzda bulunan kuantum verim protokolünü çalıştırın.GitHub'dan Quantum Yield Protokolü'nü indirin. Klasör simgesine tıklayarak ve dosya konumuna giderek program dosyasını açmak için bir florometre yazılımı kullanın. Kırmızı yıldırım simgesine tıklayarak kuantum verim protokolünü çalıştırın.Protokol tamamlandıktan sonra, analiz öncesi pencereye gidin. Plaka görüntüsündeki her fide için tüm pikselleri vurgulayarak plakayı ayrı fidelere bölün. Vurgulanan arka plan piksellerini kaldırmak için Arka Plan Hariç Tutma'yı tıklayın ve yalnızca fide alanını bırakın.Plaka görüntüsündeki her fide için floresan verileri oluşturmak üzere analiz et'i tıklayın. Tüm plakalar arasında tutarlı minimum ve maksimum değerleri görüntülemek için floresan değer aralığını manuel olarak ayarlayın. Deneme sekmesinde, Dışa Aktar'ı ve ardından Sayısal'ı tıklayın.Her fide için kuantum verimini içeren bir metin dosyası oluşturmak için Sayısal Ortalama'ya tıklayın. Metin dosyasını ve elektronik tabloyu analiz için açın. Hesap tablosu alan numarasını, piksellerin boyutunu, Fm, Ft, Fq ve QY'yi içerir. İlk olarak, alan numarasını karşılık gelen genotipe tanımlamamız gerekir, ister vahşi tip ister bir test mutantı olsun, Sonuçlar.İşte vahşi türlerin ve test mutantlarının ortam ve düşük CO2 taramasından ham ve floresan görüntülerin plaka resimleri. Her plaka, kuantum verimi veya QY olarak karşılık gelen floresan okumalarıyla alan numarasına göre etiketlenir. Veriler bir metin dosyası olarak dışa aktarılır ve analiz için bir elektronik tabloda açılabilir. Vahşi türlerin ve mutantların karanlık uyarlanmış Fv / Fm kuantum verim verimlilikleri, kutu ve bıyık grafikleri ile görselleştirilir.Vahşi tiplerin ve test mutantlarının istatistiksel farkını test etmek için, 0.05'ten düşük bir P değeri ile çift yönlü T-testi kullanılmıştır. Burada, tarama yöntemimizin verimliliğini kontrol etmek için azaltılmış kuantum verimi Fv / Fm ile fotorespiratuar mutant hattını bir test mutantı olarak kullanıyoruz. Sonuçlarımız, test mutantlarının vahşi türlere kıyasla önemli ölçüde daha düşük kuantum verim verimliliğine sahip olduğunu göstermektedir.Bu, tarama yöntemimizin düşük CO2 taraması kullanarak fotorespiratuar mutantları tanımlayabildiğini göstermektedir. Sonuç. Bu protokolü kullanırken hatırlanması gereken önemli bir şey, Arabidopsis fidelerinin floresanı ölçecek kadar büyük olduğundan, ancak görüntüleme sırasında bitkilerin üst üste bineceği kadar büyük olmadığından emin olmaktır. Yaprak boyutunu ve yaprak açılarını tek tip tutmaya çalışmak için fideleri ilk gerçek yapraklar olarak görüntülemek tercih edilir.Bu protokol, fideler için yüksek verimli bir tarama olarak kullanılabilir. Her plakanın görüntülenmesi nispeten hızlıdır ve günde 1.000'den fazla fideyi tarama potansiyeline sahiptir. Klorofil floresan analizi, fotorespirasyon verimliliğini korumak için önemli olan düşük CO2 taraması kullanarak fotorespiratuar mutantları tanımlamamızı sağladı.Bu protokol Arabidopsis ile sınırlı değildir ve abiyotik stres yanıtı deneyleri için potansiyel kullanıma sahiptir.

evaluation-photosynthetic-efficiency-photorespiratory-mutants

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, hafif hasat komplekslerinin in vitro olarak yeniden yapılandırılmasını detaylandırır. Bu entegre zar proteinleri, klorofilleri ve karotenoidleri koordine eder ve daha yüksek bitkilerde ve yeşil alglerde ışığın toplanmasından sorumludur.

Bitkiler ve Yeşil Alg Işık hasat Kompleksleri İn Vitro Sulandırma içinde

Burada, bitki büyüme davranış ve özellikle fenotipleri tekrarlanabilir bir şekilde eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Değişken ve aynı zaman istikrarlı ışık koşulları sağlamak için nasıl gösterir. Uygun analizleri yeterli örnek numaraları ve geçerli istatistiksel değerlendirme bağlıdır.

Farklı ışık nitelikleri Arabidopsis thaliana büyüme davranış analizi

Daha yüksek tesislerde fotosentetik tepkileri incelemek için yeni bir teknik  yaklaşım tanımlıyoruz. Arabidopsis'te aynı yaprak alanı.

Yaprak Reflektasyonu ve Klorofil Floresan Analizlerinin Eşzamanlı Ölçümleri ile Fotosentetik Davranışların Değerlendirilmesi

Hızlı tekrarlama hızı florometresi (FRRf), fotosistem II fotofizyolojisini ve birincil üretkenliği ölçmek için faydalı bir yöntemdir. Burada, küvet tipi FRRf kullanarak substrat zooplankton üzerindeki epizoik alglerin, Colacium sp.'nin PSII fotofizyolojisini ölçmek için bir protokol tarif ediyoruz.

Colacium sp.'nin Bağlı Aşamasının Fotofizyolojisinin Küvet Tipi Hızlı Tekrarlama Hızı Florometresi ile Ölçülmesi

Protokol, fotokimyasal olmayan söndürmenin gevşemesini darbe genliği modülasyonlu klorofil florometri ile ölçmek için yüksek verimli bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, tarlada yetiştirilen Glisin max'a uygulanır ve genetik çeşitliliği veya üreme popülasyonlarını taramak için diğer türlere uyarlanabilir.

Darbe Genliği Modülasyonlu Klorofil Florometrisi Kullanılarak Mahsullerde Fotokimyasal Olmayan Söndürmenin Yüksek Verimli Analizi

Çoğu yüzme fotoototrofik organizması, foto-kaynaklı davranış değişiklikleri (fotodavranış) gösterir. Mevcut protokol, Chlamydomonas reinhardtii model organizmasında söz konusu fotodavranışı gözlemlemektedir.

Chlamydomonas reinhardtii'de Fotodavranışın Gözlemlenmesi

Bu protokol, spektral analize dayalı olarak kırmızı alglerdeki fikobiliprotein değişikliklerinin adım adım otofloresan görüntülemesini ve değerlendirilmesini açıklamaktadır. Bu, yalnızca kıt materyalin mevcut olduğu ve hücrelerin laboratuvar koşullarında yavaş büyüdüğü veya hiç büyümediği aşırı habitatlara hücresel adaptasyonu değerlendirmek için etiketsiz ve tahribatsız bir yöntemdir.

Kırmızı Alg Fizyolojisini Değerlendirmek için Otofloresan Görüntüleme

Burada, Arabidopsis fide de-etiolasyonunun erken aşamalarında klorofil biyosentezinin izlenmesi için tasarlanmış gelişmiş bir aracı açıklıyoruz. Yeni metodoloji, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte non-invaziv gerçek zamanlı klorofil floresan görüntüleme sağlar.

Arabidopsis De-etiolasyonunun Erken Aşamalarında Klorofil Biyosentez Kinetiğinin Belirlenmesi için Non-İnvaziv Test

Bu el yazması, fotosistem II kuantum verimliliği, spektral yansıtma ve bitki mimarisinin otonom alan ölçümleri için yıkıcı olmayan, yüksek verimli bir yaklaşımı tanımlar; bu yaklaşım, agronomik ve ıslah saha denemelerinde büyük ölçekli örtülü fotosentez fenotipini mümkün kılar.

Otonom bir robot kullanılarak ürün bitkilerinde fotosentetik verimliliğin yüksek verimli ve sahada taraması

Yüksek frekanslı elektrik stimülasyonu, nöbet benzeri aktivite kullanma...

, Epilepsi Mutants Nöbetler Neurocircuit Tahliller Drosophila</em

Öğrenin, klorofil floresans analizi ile düşük CO2 maruziyetinde fotosentetik etkinlik değişikliklerini nasıl ölçebilirsiniz. Bu yüksek verimli tarama yöntemi, fotorespiratuvar mutantları hızla belirlemek için idealdir.

Fotorespiratuar Mutantlarda Fotosentetik Etkinliğin Klorofil Floresan Analizi ile Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet