Name: Fosfoprotein fosfatazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisine dayalı bir yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Keşfedin PIB-MS yöntemiyle hücre ve dokulardan endojen fosfoprotein fosfatazları ve etkileşimlerini zenginleştirme tekniğini. Kütle spektrometrisi tabanlı proteomik analizlerle proteinleri tanımlayın ve nicelendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.N.K., NIH R33 CA225458 ve R35 GM119455'in desteğini kabul eder. Kettenbach ve Gerber laboratuvarlarına yararlı tartışmaları için teşekkür ederiz.

<ol><li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li>
<li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Ser%2FThr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li>
<li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+serine%2Fthreonine+phosphatases%3A+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li>
<li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A%3A+A+highly+regulated+family+of+serine%2Fthreonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li>
<li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+promiscuity+to+precision%3A+protein+phosphatases+get+a+makeover%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li>
<li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extended+PP1+toolkit%3A+designed+to+create+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li>
<li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D-networking+by+mitotic+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li>
<li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PP1+binding+code%3A+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li>
<li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li>
<li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li>
<li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li>
<li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li>
<li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755(2013).</li>
<li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li>
<li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li>
<li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+ser%2Fthr+protein+phosphatases%3A+specificity%2C+use+and+common+forms+of+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li>
<li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li>
<li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li>
<li>Hughes, C. S., Moggridge, S., Müller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-pot%2C+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMT+labeling+for+the+masses%3A+A+robust+and+cost-efficient%2C+in-solution+labeling+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li>
<li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li>
<li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet%3A+an+open-source+MS%2FMS+sequence+database+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri ve çıkar çatışmaları yoktur.

PIB-MS, PPPome'u çeşitli numune kaynaklarından tek bir analizde kantitatif olarak profillemek için kullanılan kimyasal bir proteomik yaklaşımdır. Kinomu incelemek için kinaz inhibitörü boncukları kullanarak ve kanser ve diğer hastalık durumlarında nasıl değiştiğini incelemek için çok fazla çalışma yapılmıştır10,11,12,13. Yine de, PPPome çalışması geride kalıyor. Bu yaklaşımın bu boşluğu doldura...

Protein fosforilasyonu, DNA hasarına verilen yanıt, büyüme faktörü sinyallemesi ve mitoz 1,2,3'ten geçiş dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çoğu hücresel süreci kontrol eder. Memeli hücrelerinde, proteinlerin çoğunluğu bir veya daha fazla serin, treonin veya tirozin kalıntısında fosforile edilir, fosfoserlerin ve fosfotreoninler tüm fosforilasyon bölgelerinin yaklaşık% 98'ini oluşturur 2,3. Kinazlar hücresel sinyalizasyonda kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, PPP'lerin dinamik hücresel süreçlerin düzenlenmesindeki rolü hala ortaya çıkmaktadır.
Fosforilasyon dinamikleri, kinazlar ve fosfatazlar arasındaki dinamik etkileşim ile kontrol edilir. Memeli hücrelerinde, serin / treonin fosforilasyonunu katalize eden 400'den fazla protein kinaz vardır. Bu bölgelerin% 90'ından fazlası, PP1, PP2A, PP2B, PP4-7,PPT ve PPZ 2,3'ten oluşan küçük bir enzim ailesi olan fosfoprotein fosfatazlar (PPP'ler) tarafından defosforile edilir. PP1 ve PP2A, bir hücre 2,3,4 içindeki fosfoserin ve fosfotreonin defosforilasyonunun çoğundan sorumludur. Kinazlar ve fosfatazlar arasındaki kayda değer sayı farkı ve PPP katalitik alt birimlerinin in vitro özgüllüğünün olmaması, kinazların fosforilasyonun ana belirleyicisi olduğu inancına yol açmıştır 2,3. Bununla birlikte, birçok çalışma, fosfatazların multimerik holoenzimlerinoluşumu yoluyla substrat özgüllüğünü oluşturduğunu göstermiştir 5,6,7,8,9. Örneğin, PP1, katalitik bir alt birimden ve belirli bir zamanda, 150'den fazla düzenleyici alt birim 6,7,8'den birinden oluşan bir heterodimerdir. Tersine, PP2A, bir iskele (A), bir düzenleyici (B) ve bir katalitik (C) alt birimi 2,3,9'dan oluşan bir heterotrimerdir. PP2A düzenleyici alt birimlerinin (B55, B56, PR72 ve striatin) dört ayrı ailesi vardır, her biri birden fazla gen, ekleme varyantı ve lokalizasyon paternleri 2,3,9'dur. PPP'lerin multimerik doğası, kinazların ve PPP katalitik alt birimlerinin sayısındaki boşluğu doldurur. Bununla birlikte, PPP sinyallemesini incelemek için analitik zorluklar yaratır. PPP sinyalini kapsamlı bir şekilde analiz etmek için, bir hücre veya doku içindeki çeşitli holoenzimleri araştırmak çok önemlidir. İnsan kinomunun incelenmesinde, multipleks inhibitör boncuklar veya kinoboncuklar olarak adlandırılan kinaz inhibitörü boncukların kullanılmasında, kinaz inhibitörlerinin boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirildiği ve zenginleştirilmiş kinazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisinin kullanıldığı kimyasal bir proteomik strateji kullanılarak büyük ilerlemeler kaydedilmiştir10,11,12,13.
PPP biyolojisini incelemek için benzer bir yaklaşım oluşturduk. Bu teknik, fosfataz inhibitörü boncuklar (PIB'ler) olarak adlandırılan mikrosistin-LR (MCLR) adı verilen hareketsiz, seçici olmayan bir PPP inhibitörü ile boncuklar kullanılarak PPP katalitik alt birimlerinin afinite yakalamasını içerir14,15. Protein aktivitesini veya lokalizasyonunu değiştirebilecek eksojen PPP alt birimlerinin endojen etiketlemesini veya ekspresyonunu gerektiren diğer yöntemlerden farklı olarak, PIB-MS, endojen PPP katalitik alt birimlerinin, bunlarla ilişkili düzenleyici ve iskele alt birimlerinin ve belirli bir zaman noktasında veya belirli tedavi koşulları altında hücrelerden ve dokulardan etkileşime giren proteinlerin (PPPome olarak adlandırılır) zenginleştirilmesine izin verir. MCLR, nanomolar konsantrasyonlarda PP1, PP2A, PP4-6, PPT ve PPZ'yi inhibe ederek PIB'leri PPPome16 için zenginleştirmede oldukça etkili hale getirir. Bu yöntem, hücrelerden klinik örneklere kadar herhangi bir başlangıç materyalinde kullanılmak üzere ölçeklendirilebilir. Burada, endojen PPPome ve modifikasyon durumlarını verimli bir şekilde yakalamak, tanımlamak ve ölçmek için PIB'lerin ve kütle spektrometresinin (PIB-MS) kullanımını ayrıntılı olarak açıklıyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> Şekil 1: PIB-MS protokolünün görsel özeti. Bir PIB-MS deneyinde, hücrelerden tümörlere kadar çeşitli şekillerde örnekler elde edilebilir. Numune, PPP zenginleştirmeden önce toplanır, lize edilir ve homojenize edilir. PPP'ler için zenginleştirmek için, lizat, MCLR gibi bir PPP inhibitörü olan veya olmayan PIB'lerle inkübe edilir. PIB'ler daha sonra yıkanır ve PPP'ler denatüre koşullarında salınır. Numuneler, SP3 protein zenginleştirme, triptik sindirim ve tuzdan arındırma yoluyla deterjanların uzaklaştırılması yoluyla kütle spektrometresi analizi için hazırlanır. Numuneler daha sonra kütle spektrometresi analizinden önce isteğe bağlı olarak TMT etiketli olabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
PIB-MS, hücrelerin veya dokuların lizisini ve berraklaştırılmasını, lizatın PIB'lerle inkübasyonunu, elüsyonu ve batı lekelenmesi veya kütle spektrometrisine dayalı yaklaşımlarla elüatın analizini içerir (Şekil 1). Serbest MCLR'nin eklenmesi, spesifik PIB bağlayıcılarını spesifik olmayan interaktörlerden ayırt etmek için bir kontrol olarak kullanılabilir. Çoğu uygulama için, elüatlardaki proteinleri doğrudan tanımlamak için etiketsiz bir yaklaşım kullanılabilir. Nicelemede veya düşük bolluktaki türlerin tanımlanmasında daha fazla hassasiyetin gerekli olduğu durumlarda, kapsama alanını artırmak ve girişi azaltmak için tandem kütle etiketi (TMT) etiketleme ile daha fazla işlem kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Asetonitril (ACN)</td><td>Honeywell</td><td>AH015-4</td><td>DİKKAT: ACN yanıcı ve zehirlidir; eldiven giyin ve kimyasal davlumbazda çalışın.</td></tr><tr><td>Susuz Asetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-100ML DİKKAT</td><td>: ACN yanıcı ve zehirlidir; eldiven giyin ve kimyasal davlumbazda çalışın.</td></tr><tr><td>Tezgah üstü santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>model no. 5424</td><td></td></tr><tr><td>Beta-gliserofosforik asit, disodyum tuzu pentahidrat</td><td>Acros Organics</td><td>410991000</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>model no. 5810 R 15 amp versiyonu</td><td></td></tr><tr><td>Damıtılmış su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Dounce doku öğütücü</td><td>Fisherbrand Pelet Havaneli</td><td>12-141-363</td><td></td></tr><tr><td>Empore katı faz ekstraksiyon diski, C18</td><td>CDS Analitik</td><td>76333-132</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tüpleri, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td>KRİTİK : Diğer tüpler polimeri numuneye sızdırarak analizi kirletebilir.</td></tr><tr><td>Eppendorf tüpleri, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>KRİTİK : Diğer tüpler polimeri numuneye sızdırarak analizi kirletebilir.</td></tr><tr><td>Ekstraksiyon plakası</td><td>manifoldu Sular</td><td>WAT097944</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tüpleri, 50 mL</td><td>VWR</td><td>21008</td><td></td></tr><tr><td>Jenerik künt uçlu iğne ve piston</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jenerik manyetik ayırma rafı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen klorür (HCl)VWR</td> <td>Kimyasalları BDH</td><td>BDH3028</td><td>DİKKAT: HCl aşındırıcıdır; Eldiven giyin ve kimyasal davlumbazda çalışın.</td></tr><tr><td>Hidroksilamin çözeltisi %50 (ağırlık/hacim)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>467804</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör, 65 derece; C</td><td>VWR</td><td>model no. 1380FM</td><td></td></tr><tr><td>Koptec Saf Etanol, HPLC</td> (MeOH) için 200 Korumalı <td>Decon Labs</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-4L R:</td><td>DİKKAT: MeOH yanıcı ve toksiktir; eldiven giyin ve kimyasal davlumbazda çalışın.</td></tr><tr><td>Mikrosistin LR (MCLR)</td><td>Cayman Chemical</td><td>10007188</td><td>DİKKAT: MCLR toksiktir; tutarken eldiven giyin ve cilt temasından kaçının.</td></tr><tr><td>PBS, 1 kez; kalsiyum ve magnezyum olmadan, pH 7.4 & plusmn; 0.1</td><td>Corning</td><td>; 21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma MColorpHast pH test şeritleri ve gösterge kağıtları gibi pH test şeritleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>M1095310001</td><td></td></tr><tr><td>PIB'lerin</td><td></td><td></td><td>üretilmesine ilişkin protokol için bakınız Moorhead ve diğerleri, 2007.</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test</td><td>Kiti Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları, 10 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>22491504</td><td>KRİTİK : Diğer uçlar polimeri numunelere sızdırarak analizi kirletebilir.</td></tr><tr><td>Pipet uçları, 1000 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>22491555</td><td>KRİTİK : Diğer uçlar polimeri numunelere sızdırarak analizi kirletebilir.</td></tr><tr><td>Pipet uçları, 200 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>22491539</td><td>KRİTİK : Diğer uçlar polimeri numunelere sızdırarak analizi kirletebilir.</td></tr><tr><td>plastik şırınga, 10 mL</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli III</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>P50700-1</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hibrit Dört Kutuplu Orbitrap Kütle Spektrometresi, Oribtrap Füzyonu, Orbitrap Füzyon Lumonları veya Orbitrap Eclipse Tribrid Kütle Spektrometresi&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Soğutmalı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tezgah üstü santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>model no. 5424 R</td><td></td></tr><tr><td>Döndürücü (Labquake Çalkalayıcı Döner Çeviri)</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-687-12Q</td><td>8 rpm dönüş</td></tr><tr><td>Numune toplama plakası, 96 kuyu, 1 mL</td><td>Sular</td><td>WAT058957</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1311-1</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama sınıfı modifiye tripsin</td><td>Promega</td><td>V511C</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>EMD Kimyasalları</td><td>SX0299-1</td><td>DİKKAT: Sodyum azit patlayıcı ve toksiktir; eldiven giyin, kimyasal davlumbazda çalışın ve metallerle temastan kaçının.</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td> <td>Fisher Chemical</td><td>S27110</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Branson dijital sonifier)</td><td></td> <td>model no. SFX 250</td><td></td></tr><tr><td>SPE C18 tuz giderme plakası</td><td>Sular</td><td>186001828BA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedBeads manyetik karboksilat modifiye parçacıklar (SP3 boncuklar)</td><td>Cytiva</td><td>6.51521E+13</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>model no. 5350</td><td></td></tr><tr><td>TMT10plex İzobarik Etiket Reaktif Seti artı TMT11-131C Etiket Reaktifi, 3 > Etiket başına 0,8 mg</td><td>ThermoFisher</td><td>A37725</td><td></td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit (TFA)</td><td>Honeywell</td><td>T6508-25ML</td><td>DİKKAT: TFA aşındırıcıdır ve temas halinde cildi tahriş eder. Eldiven ve göz koruması giyin ve kimyasal davlumbazda çalışın.</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Research Products International</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Vakum santrifüjü ve buhar kapanı</td><td>Thermo Scientific</td><td>model nos. SpeedVac SPD120 ve RVT5105</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td><td>Bilimsel Endüstriler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Su LC-MS</td><td>Honeywell</td><td>LC365-4</td><td></td></tr></tbody></table>

fosfoprotein fosfatazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisine dayalı bir yaklaşım

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Çoğu hücresel süreç dinamik protein fosforilasyonu ile düzenlenir. Proteinlerin dörtte üçünden fazlası fosforile edilir ve fosfoprotein fosfatazlar (PPP'ler) tüm hücresel serin / treonin defosforilasyonunun% 90'ından fazlasını koordine eder. Protein fosforilasyonunun serbestleştirilmesi, kanser ve nörodejenerasyon dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların patofizyolojisinde rol oynamıştır. Yaygın aktivitelerine rağmen, PPP'leri kontrol eden moleküler mekanizmalar ve PPP'ler tarafından kontrol edilenler zayıf karakterizedir. Burada, fosfataz inhibitörü boncukları ve kütle spektrometresi (PIB-MS) olarak adlandırılan proteomik bir yaklaşım, PPP'leri, posttranslasyonel modifikasyonlarını ve interaktörlerini herhangi bir hücre hattı veya dokusunu kullanarak 12 saat kadar kısa bir sürede tanımlamak ve ölçmek için tanımlanmıştır. PIB-MS, endojen PPP'leri ve bunlarla ilişkili proteinleri (PPPome olarak adlandırılır) yakalamak ve zenginleştirmek için sefaroz boncukları üzerinde hareketsiz hale getirilmiş, seçici olmayan bir PPP inhibitörü olan mikrosistin-LR (MCLR) kullanır. Bu yöntem, PPP'lerin etiketli versiyonlarının eksojen ekspresyonunu veya spesifik antikorların kullanılmasını gerektirmez. PIB-MS, evrimsel olarak korunmuş PPP'leri incelemek ve mevcut defosforilasyon sinyalizasyonu anlayışımızı genişletmek için yenilikçi bir yol sunmaktadır.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> Şekil 2: Spesifik PIB bağlayıcılarının tanımlanması . (A) PIB-MS ile çeşitli doku tipleri veya hücreler analiz edilebilir. Biyolojik üçlüdeki HeLa hücreleri DMSO veya PPP inhibitörü MCLR ile tedavi edildi, PIB'lerle inkübe edildi ve LC-MS / MS ile analiz edildi. (B) DMSO ve MCLR ile tedavi edil...

Burada, endojen fosfoprotein fosfatazların ve bunların hücre ve dokulardan etkileşen proteinlerinin zenginleştirilmesi ve kütle spektrometrisine dayalı proteomiklerle tanımlanması ve nicelleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz.

Fosfoprotein fosfatazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisine dayalı bir yaklaşım

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MS, endojen fosforprotein fosfatazları zenginleştirmek için kullanılan yeni bir tekniktir ve hücrelerden ve dokulardan proteinlerle etkileşime girerler. Kütle spektrometrisine dayalı proteomikler kullanılarak bu proteinlerin tanımlanması ve nicelleştirilmesini içerir. Bu teknik, protein aktivitesini veya lokalizasyonunu değiştirebilecek fosforprotein fosfatazların etiketli versiyonlarının eksojen ekspresyonunu gerektirmez.Ayrıca, spesifik olmayan veya spesifik izoformlar arasında ayrım yapamayan antikorlar kullanmaz. PPPM'yi araştırmak için kullanılan bu yöntem, hücrelerden klinik örneklere kadar her şeyde kullanılmak üzere ölçeklendirilebilir. Başlamak için, oda sıcaklığında iki dakika boyunca 277 kez g'de santrifüjleme yoluyla hücre peleti toplayın.Ortamları çıkarın ve hücreleri beş mililitre PBS ile yıkayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi lizis tamponunu hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Numunelere bir mililitre soğutulmuş lizis tamponu ekleyin, ardından numuneleri sonifikasyon ile homojenize edin ve hücreleri darbeler arasında buz üzerinde tutun.Lisatları taze 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Sonikleştirilmiş numuneyi 21, 130 kez g'de 15 dakika boyunca 4 santigrat derecede santrifüj edin. Bir biskinkoninik asit testi kullanarak toplam protein konsantrasyonunu ölçmek için lizatın bir alikotunu kullanın.Bu adım, her numunede eşit protein konsantrasyonu sağlamak için gereklidir. Bir fosfoprotein fosfataz inhibitörü kontrolü için, her numune için eşit protein konsantrasyonunda iki alikot hazırlayın. Lizis tamponu, numuneleri seyreltmek için kullanılabilir, böylece her tüp eşit protein konsantrasyonuna sahip olur.Bir alikot'a bir mikromolar serbest mikrosistin-LR ve diğerine eşit miktarda DMSO ekleyin. Numuneleri vorteks edin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Fosfataz inhibitörü boncukların hazırlanması, önceden veya numune hazırlama bölümünde açıklanan inkübasyon adımları sırasında yapılmalıdır.Bir miligram protein için 10 mikrolitre katı fosfataz inhibitörü boncuk veya PIB reçinesi kullanın ve bunları 1.5 mililitrelik bir tüpe ekleyin. PIB'leri vorteksleme ile 0,5 mililitre lizis tamponu ile üç kez yıkayın, ardından oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 376 kez g'de santrifüjleme yapın. Yıkanmış PIB'lere uygun miktarda lizis tamponu ekleyerek hacimce %50 PIB tampon çözeltisi elde edin.Pipetleme yaparak hafifçe karıştırın ve PIB'leri yeniden askıya almak için pipet ucunu ve bulamacı döndürün. Bulamacın 20 mikrolitresini, 0,5 mililitre lizis tamponu içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpleri 30 saniye boyunca 376 kez g'de döndürün.Her tüp içinde eşit miktarda PIB içerir. Her tüpte sadece katı reçine ve 50 mikrolitreye kadar lizis tamponu bırakırken süpernatantı atın. Lisatları, PIB'leri içeren uygun şekilde etiketlenmiş tüplere aktarın.Lisatı PIB'lerle 4 santigrat derecede bir saat boyunca 8 rpm'de dönme ile inkübe edin. Lisat ile inkübasyondan sonra, PIB'leri 4 santigrat derecede 30 saniye boyunca 376 kez g'de santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Boncukları 0,5 mililitre lizis tamponu ekleyerek ve tüpleri ters çevirerek yıkayın Boncukları santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı çıkarın.Toplam üç yıkama için bu adımı tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, PIB'leri pipetlemeden lizis tamponunu mümkün olduğunca çıkarın. % 2 SDS içeren elüsyon tamponunu hazırlayın ve elüsyon tamponunu PIB'lerin hacminin dört ila beş katı kadar ekleyin.Fosfoprotein fosfatazları boncuklardan çıkarmak için bir saat boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Tüpleri oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 376 kez g'de santrifüj yapın. Elüatı ayrı bir tüpe toplayın ve kütle spektrometresi analizleri veya batı lekelenmesi için devam edin.PIB'leri yeniden oluşturmak için, oda sıcaklığında bir saat boyunca 8 rpm'de dönerek %2 SDS çözeltisinde inkübe edin. Boncukları 25 milimolar Tris-HCl pH 7.5'te üç ila beş kez, yıkama başına 30 dakika döndürerek yıkayın. PIB'leri sodyum azid ile 25 milimolar Tris HCL pH 7.5'te saklayın.Kütle spektrometresi analizi için, veri filtreleme ve analiz yöntemleri değişir ve araştırmacı veya çekirdek bir tesis tarafından gerçekleştirilebilir. Ham verileri türe özgü bir proteom veritabanında aradıktan sonra, arama sonuçlarını filtreleyin ve bir Microsoft Excel çalışma sayfası olarak dışa aktarın. Verileri üçlü olarak analiz edin.Etiketsiz niceleme için, verileri ölçmek üzere MS1 tepe alanı ölçümlerini kullanın. PPP alt birimlerini ve bunların interaktörleri de novo'yu tanımlamak için, mikrosistin-LR ile inhibe edilmiş ve DMSO ile muamele edilmiş örneklerin biyolojik üçlüslerini karşılaştırın. Verileri, DMSO kontrolüyle tedavi edilen üç numunenin en az ikisinde yalnızca toplam peptid sayısı birden fazla olan proteinlerin mevcut olması için filtreleyin.Reçineye spesifik olarak bağlanmayan proteinleri filtrelemek için, mikrosistin-LR ile tedavi edilen durumdaki toplam peptid sayısının herhangi bir PPP katalitik alt biriminden daha yüksek olduğu proteinleri çıkarın. Keratin, kollajen, ribozomal proteinler ve heterojen nükleer ribonükleoproteinler gibi yaygın kirleticileri analizden hariç tutun. Verileri Perseus'a aktarmak için bir CSV dosyası gereklidir.Yük bölümünde Genel matris yükleme'yi tıklayarak filtrelenmiş verileri Perseus'a aktarın. Temel Dönüşüm'e giderek, verileri seçerek ve dönüştürme işlevini x'in günlük tabanı 2 olarak belirterek verileri dönüştürün. Atama, Normal dağılımdaki eksik değerleri değiştir, verileri seçerek ve hesaplama için genişliği ve vites küçültmeyi belirterek normal bir dağılımdaki eksik değerleri ima et.Normalleştir, Kantil normalleştirme'ye giderek kantil normalleştirme gerçekleştirin. Not satırlarına, Kategorik ek açıklama satırlarına giderek verilere açıklama ekleyin. Testlere, İki örneklemli testlere giderek, grupları, gerçekleştirilecek testi ve kesme için kullanılan çoklu hipotez testi düzeltme yöntemini seçerek öğrencinin T testini gerçekleştirin.Bu işlev aynı zamanda log 2 oranlarını da hesaplar. Fosfoprotein fosfotatlar ve bunların interaktörleri, bir PIB pull-down deneyi kullanılarak HeLa hücrelerinde tanımlandı, ardından DMSO ile tedavi edilen ve mikrosistin-LR ile muamele edilen örneklerde protein bolluğunun etiketsiz nicelleştirilmesi izlendi. Kütle spektrometrisi analizinin volkan grafiği, kırmızı, mavi renkte katalitik alt birimler ve beyaz renkte yeni aday PPP alt birimleri veya etkileşime giren proteinlerle gösterilen spesifik PIB bağlayıcılarını tanımladı.Spesifik olmayan bağlayıcılar gri renkte gösterildi. DMSO ile muamele edilen HeLa hücre lizatından log2 alanının dağılım grafiği, bollukların yüksek oranda ilişkili olduğunu ve verilerin tekrarlanabilirliğini gösterdiğini göstermiştir. Tüm fosforprotein fosfataz alt birimlerinin ve etkileşen proteinlerin ağ analizi, bu proteinlerin PIB pull-down'daki spesifik interaktörler olduğunu göstermiştir.Küresel proteomik analizler yapılabilir ve sonuçlar, PPPome kompozisyonunun PPP bolluğu tarafından yönlendirilip yönlendirilmediğini veya çeviri sonrası mekanizmalar tarafından düzenlenip düzenlenmediğini belirlemek için PIB analizi ile karşılaştırılabilir. PIB-MS, interfaz ve mitotik örnekler veya kanser hücre hatları arasındaki farklılıklar gibi çeşitli koşullar altında PPP ekspresyon modellerindeki farklılıkları tanımlamamızı sağlayan geniş çapta uygulanabilir bir araçtır.

a-mass-spectrometry-based-approach-to-identify-phosphoprotein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Cryolysis, üre solubilziation, HILIC fraksiyonasyon ve fosforile peptidlerin IMAC zenginleştirme kullanarak kantitatif fosforilasyon prosedürü açıklaması.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

Burada bitki protein komplekslerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklar. Biz bir kompleks içinde bir tek proteini imüno tarafından, bu yüzden onun translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşim ortakları belirlemek olduğunu göstermektedir.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Protein fosforilasyonu, hücrelerin hücre dışı ortamlarındaki bilgileri nasıl yorumladığının ve ona nasıl yanıt verdiğinin merkezi bir özelliğidir. Burada, ilgilenilen bir substratı (substratları) fosforile eden kinazları hızlı bir şekilde tanımlamak için memeli hücrelerinden saflaştırılmış kinazları kullanan yüksek verimli bir tarama protokolü sunuyoruz.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik

Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Bu iletişim kuralı ayıklamak ve prostat kanseri hücre hatlarından veya doku phosphoproteome ile kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizi için phosphopeptides zenginleştirmek için bir yordam açıklanır.

Prostat kanserinde Phosphoproteome araştırmak için etiket içermeyen nicel kütle spektrometresi ile birleştiğinde Phosphopeptide zenginleştirme

Burada, co-immunoprecipitation ve plazma membran reseptörleri enzim işe alım ve enzim aktivitesi belirli protein etki katkısını aynı anda çalışmaya bir boncuk üzerinde enzimatik aktivite tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Reseptörleri ve enzimler arasındaki işlevsel etkileşimler çalışmak için Co-immunoprecipitation tahlil

Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [32P] ATP etiketleme kullanarak Blot.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Bu protokol, inositol fosfatlar veya fosfoinositidler bağlayan proteinlerin tanımlanması üzerinde duruluyor. Bu etanol veya manyetik boncuklar için streptavidin üzerinden immobilize olan biyotinlenmiş inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile benzeşme Kromatografi kullanır. Inositol fosfat veya fosfoinositide bağlayıcı proteinler Batı lekesi veya kütle spektrometresi ile tanımlanır.

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Mevcut protokol, geliştirilmiş bir tek moleküllü pull-down (SiMPull) testi kullanarak protein fosforilasyonunu ölçmek için numune hazırlama ve veri analizini açıklamaktadır.

Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi

Post-translasyonel modifikasyonlar (PTM'ler) protein yapılarını ve fonksiyonlarını değiştirir. Birden fazla PTM tipinin aynı anda zenginleştirilmesi yöntemleri, analizlerde kapsama alanını en üst düzeye çıkarabilir. Çift fonksiyonlu Ti(IV)-immobilize metal afinite kromatografisini ve ardından pankreas dokularında protein N-glikozilasyon ve fosforilasyonun eşzamanlı zenginleştirilmesi ve analizi için kütle spektrometresini kullanan bir protokol sunuyoruz.

İnsan pankreas dokularından N-glikopeptitler ve fosfopeptitlerin eşzamanlı analizi için spin-tip zenginleştirme stratejisi

Keşfedin PIB-MS yöntemiyle hücre ve dokulardan endojen fosfoprotein fosfatazları ve etkileşimlerini zenginleştirme tekniğini. Kütle spektrometrisi tabanlı proteomik analizlerle proteinleri tanımlayın ve nicelendirin.

Fosfoprotein fosfatazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisine dayalı bir yaklaşım

Daha fazla video keşfet