Fosfoprotein fosfatazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisine dayalı bir yaklaşım

PIB-MS, endojen fosforprotein fosfatazları zenginleştirmek için kullanılan yeni bir tekniktir ve hücrelerden ve dokulardan proteinlerle etkileşime girerler. Kütle spektrometrisine dayalı proteomikler kullanılarak bu proteinlerin tanımlanması ve nicelleştirilmesini içerir. Bu teknik, protein aktivitesini veya lokalizasyonunu değiştirebilecek fosforprotein fosfatazların etiketli versiyonlarının eksojen ekspresyonunu gerektirmez.

Ayrıca, spesifik olmayan veya spesifik izoformlar arasında ayrım yapamayan antikorlar kullanmaz. PPPM'yi araştırmak için kullanılan bu yöntem, hücrelerden klinik örneklere kadar her şeyde kullanılmak üzere ölçeklendirilebilir. Başlamak için, oda sıcaklığında iki dakika boyunca 277 kez g'de santrifüjleme yoluyla hücre peleti toplayın.

Ortamları çıkarın ve hücreleri beş mililitre PBS ile yıkayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi lizis tamponunu hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Numunelere bir mililitre soğutulmuş lizis tamponu ekleyin, ardından numuneleri sonifikasyon ile homojenize edin ve hücreleri darbeler arasında buz üzerinde tutun.

Lisatları taze 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Sonikleştirilmiş numuneyi 21, 130 kez g'de 15 dakika boyunca 4 santigrat derecede santrifüj edin. Bir biskinkoninik asit testi kullanarak toplam protein konsantrasyonunu ölçmek için lizatın bir alikotunu kullanın.

Bu adım, her numunede eşit protein konsantrasyonu sağlamak için gereklidir. Bir fosfoprotein fosfataz inhibitörü kontrolü için, her numune için eşit protein konsantrasyonunda iki alikot hazırlayın. Lizis tamponu, numuneleri seyreltmek için kullanılabilir, böylece her tüp eşit protein konsantrasyonuna sahip olur.

Bir alikot'a bir mikromolar serbest mikrosistin-LR ve diğerine eşit miktarda DMSO ekleyin. Numuneleri vorteks edin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Fosfataz inhibitörü boncukların hazırlanması, önceden veya numune hazırlama bölümünde açıklanan inkübasyon adımları sırasında yapılmalıdır.

Bir miligram protein için 10 mikrolitre katı fosfataz inhibitörü boncuk veya PIB reçinesi kullanın ve bunları 1.5 mililitrelik bir tüpe ekleyin. PIB'leri vorteksleme ile 0,5 mililitre lizis tamponu ile üç kez yıkayın, ardından oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 376 kez g'de santrifüjleme yapın. Yıkanmış PIB'lere uygun miktarda lizis tamponu ekleyerek hacimce %50 PIB tampon çözeltisi elde edin.

Pipetleme yaparak hafifçe karıştırın ve PIB'leri yeniden askıya almak için pipet ucunu ve bulamacı döndürün. Bulamacın 20 mikrolitresini, 0,5 mililitre lizis tamponu içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpleri 30 saniye boyunca 376 kez g'de döndürün.

Her tüp içinde eşit miktarda PIB içerir. Her tüpte sadece katı reçine ve 50 mikrolitreye kadar lizis tamponu bırakırken süpernatantı atın. Lisatları, PIB'leri içeren uygun şekilde etiketlenmiş tüplere aktarın.

Lisatı PIB'lerle 4 santigrat derecede bir saat boyunca 8 rpm'de dönme ile inkübe edin. Lisat ile inkübasyondan sonra, PIB'leri 4 santigrat derecede 30 saniye boyunca 376 kez g'de santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Boncukları 0,5 mililitre lizis tamponu ekleyerek ve tüpleri ters çevirerek yıkayın Boncukları santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı çıkarın.

Toplam üç yıkama için bu adımı tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, PIB'leri pipetlemeden lizis tamponunu mümkün olduğunca çıkarın. % 2 SDS içeren elüsyon tamponunu hazırlayın ve elüsyon tamponunu PIB'lerin hacminin dört ila beş katı kadar ekleyin.

Fosfoprotein fosfatazları boncuklardan çıkarmak için bir saat boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Tüpleri oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 376 kez g'de santrifüj yapın. Elüatı ayrı bir tüpe toplayın ve kütle spektrometresi analizleri veya batı lekelenmesi için devam edin.

PIB'leri yeniden oluşturmak için, oda sıcaklığında bir saat boyunca 8 rpm'de dönerek %2 SDS çözeltisinde inkübe edin. Boncukları 25 milimolar Tris-HCl pH 7.5'te üç ila beş kez, yıkama başına 30 dakika döndürerek yıkayın. PIB'leri sodyum azid ile 25 milimolar Tris HCL pH 7.5'te saklayın.

Kütle spektrometresi analizi için, veri filtreleme ve analiz yöntemleri değişir ve araştırmacı veya çekirdek bir tesis tarafından gerçekleştirilebilir. Ham verileri türe özgü bir proteom veritabanında aradıktan sonra, arama sonuçlarını filtreleyin ve bir Microsoft Excel çalışma sayfası olarak dışa aktarın. Verileri üçlü olarak analiz edin.

Etiketsiz niceleme için, verileri ölçmek üzere MS1 tepe alanı ölçümlerini kullanın. PPP alt birimlerini ve bunların interaktörleri de novo'yu tanımlamak için, mikrosistin-LR ile inhibe edilmiş ve DMSO ile muamele edilmiş örneklerin biyolojik üçlüslerini karşılaştırın. Verileri, DMSO kontrolüyle tedavi edilen üç numunenin en az ikisinde yalnızca toplam peptid sayısı birden fazla olan proteinlerin mevcut olması için filtreleyin.

Reçineye spesifik olarak bağlanmayan proteinleri filtrelemek için, mikrosistin-LR ile tedavi edilen durumdaki toplam peptid sayısının herhangi bir PPP katalitik alt biriminden daha yüksek olduğu proteinleri çıkarın. Keratin, kollajen, ribozomal proteinler ve heterojen nükleer ribonükleoproteinler gibi yaygın kirleticileri analizden hariç tutun. Verileri Perseus'a aktarmak için bir CSV dosyası gereklidir.

Yük bölümünde Genel matris yükleme'yi tıklayarak filtrelenmiş verileri Perseus'a aktarın. Temel Dönüşüm'e giderek, verileri seçerek ve dönüştürme işlevini x'in günlük tabanı 2 olarak belirterek verileri dönüştürün. Atama, Normal dağılımdaki eksik değerleri değiştir, verileri seçerek ve hesaplama için genişliği ve vites küçültmeyi belirterek normal bir dağılımdaki eksik değerleri ima et.

Normalleştir, Kantil normalleştirme'ye giderek kantil normalleştirme gerçekleştirin. Not satırlarına, Kategorik ek açıklama satırlarına giderek verilere açıklama ekleyin. Testlere, İki örneklemli testlere giderek, grupları, gerçekleştirilecek testi ve kesme için kullanılan çoklu hipotez testi düzeltme yöntemini seçerek öğrencinin T testini gerçekleştirin.

Bu işlev aynı zamanda log 2 oranlarını da hesaplar. Fosfoprotein fosfotatlar ve bunların interaktörleri, bir PIB pull-down deneyi kullanılarak HeLa hücrelerinde tanımlandı, ardından DMSO ile tedavi edilen ve mikrosistin-LR ile muamele edilen örneklerde protein bolluğunun etiketsiz nicelleştirilmesi izlendi. Kütle spektrometrisi analizinin volkan grafiği, kırmızı, mavi renkte katalitik alt birimler ve beyaz renkte yeni aday PPP alt birimleri veya etkileşime giren proteinlerle gösterilen spesifik PIB bağlayıcılarını tanımladı.

Spesifik olmayan bağlayıcılar gri renkte gösterildi. DMSO ile muamele edilen HeLa hücre lizatından log2 alanının dağılım grafiği, bollukların yüksek oranda ilişkili olduğunu ve verilerin tekrarlanabilirliğini gösterdiğini göstermiştir. Tüm fosforprotein fosfataz alt birimlerinin ve etkileşen proteinlerin ağ analizi, bu proteinlerin PIB pull-down'daki spesifik interaktörler olduğunu göstermiştir.

Küresel proteomik analizler yapılabilir ve sonuçlar, PPPome kompozisyonunun PPP bolluğu tarafından yönlendirilip yönlendirilmediğini veya çeviri sonrası mekanizmalar tarafından düzenlenip düzenlenmediğini belirlemek için PIB analizi ile karşılaştırılabilir. PIB-MS, interfaz ve mitotik örnekler veya kanser hücre hatları arasındaki farklılıklar gibi çeşitli koşullar altında PPP ekspresyon modellerindeki farklılıkları tanımlamamızı sağlayan geniş çapta uygulanabilir bir araçtır.