Name: Çoklu Floresan Boyama ve Doku Temizleme Yaklaşımları Kullanarak Tüylü ve Glabrous Cilt İnnervasyonunu 3D Desende Göstermek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: Keşfedin, konfokal mikroskopi ve doku temizleme teknikleri kullanarak kalın deri kesitlerinde CGRP pozitif sinir liflerinin 3D ağ yapısını görüntüleme yöntemini. Bu teknik, tüylü ve glabrous deri innervasyonunu kapsamlı şekilde incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çin Tıp Bilimleri Akademisi İnovasyon Fonu (Proje Kodu no. CI2021A03404) ve Ulusal Geleneksel Çin Tıbbı Disiplinlerarası İnovasyon Fonu (Proje Kodu no. ZYYCXTD-D-202202).

Bu çalışma, Çin Çin Tıp Bilimleri Akademisi, Akupunktur ve Moxibustion Enstitüsü Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (referans numarası D2018-04-13-1). Tüm prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (National Academy Press, Washington, D.C., 1996) uyarınca gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada üç yetişkin erkek sıçan (Sprague-Dawley, ağırlık 230 ± 15 g) kullanılmıştır. Tüm hayvanlar, kontrollü sıcaklık ve nem ile 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde barındırıldı ve yiyecek ve suya serbest erişime izin verildi.
1. Perfüzyon ve numune hazırlama
<ol><li>Ötanazi indüklemek için sıçana intraperitoneal olarak 250 mg / kg tribromoetanol çözeltisi (bakınız Malzeme Tablosu) enjekte edin.</li>
	<li>Solunum durduktan sonra, sıçanın göğüs boşluğunu açmak için paslanmaz çelik cerrahi makas kullanın. Sol kardiyak ventrikül13 üzerinden 3 mL/dak oranında perfüze etmek için 20 G iğne kullanın ve 100 mL% 0.9 normal salin ve ardından 0.1 M fosfat tamponunda (PB, pH 7.4) 250-300 mL% 4 paraformaldehit kullanın (Şekil 1A, B).</li>
	<li>Perfüzyondan sonra, dorsum derisini ve tabanını arka pençeden çıkarmak için bir neşter kullanın.<ol>
<li>Dondurulmuş kesit gerektiren numuneler için, dokuları 2 saat boyunca 0.1 M PB'de% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin; daha sonra dokuları 0.1 M PB'de% 25 sakkarozda 4 ° C'de 24 saatten fazla bir süre kriyoprotect</li>
		<li>Doku temizliği gerektiren kalın kesitli numuneler için, dokuları 2 saat boyunca 1x fosfat tamponlu salin (1x PBS) içinde% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin; daha sonra dokuları 4 °C'de 1x PBS'de kriyoproteksiyon yapın (Şekil 1C-E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CGRP, faloidin ve LYVE1 ile üçlü floresan boyama ve ardından doku temizleme tedavisi
NOT: CGRP, faloidin ve LYVE1 ile üçlü floresan boyama, doku temizleme tedavisini takiben 300 μm kalınlığındaki doku kesitlerinde tüylü ve göz kamaştırıcı derideki sinir liflerini, kan damarlarını ve lenfatik damarları ortaya çıkarmak için uygulandı.
<ol><li>Agaroz çözünene kadar bir mikro fırında 2 dakika ısıtılarak 1x PBS'de% 2 agaroz hazırlayın (bkz.</li>
	<li>Yıkadıktan sonra, cilt dokularını 37 ° C'de% 2 agaroz içine gömün ve soğutma için buz kutusunun içine yerleştirin (Şekil 1F, G).</li>
	<li>Titreşimli mikrotom üzerine monte edilmiş dokuyu buzlu suyla sabitleyin ve enine yönde 500 μm kalınlığında dilimleyin. Titreşim dilimleyiciyi ayarlamak ve dilimlemeyi bitirmek için aşağıdaki parametreleri kullanın: hız, 0,50 mm/sn ve genlik, 1,5 mm (Şekil 1H-K).</li>
	<li>Dilimledikten sonra, agarozu bölümlerden çıkarın ve 1x PBS (pH 7.4) içeren altı delikli bir plakada saklayın (Şekil 1L).</li>
	<li>Doku kesitlerini 4 °C'de gece boyunca 1x PBS'de (TriX-PB) %2 Triton X-100 çözeltisi içinde inkübe edin. Aşağıdaki yordam için Şekil 2'ye bakın.</li>
	<li>Doku bölümlerini bloke edici tampona yerleştirin ve 4 ° C'de gece boyunca çalkalayıcı üzerinde 72 rpm'de döndürün. NOT: Bloke edici tampon bileşimi 1x PBS'de %10 normal eşek serumu, %1 Triton-X 100 ve %0,2 sodyum aziddir (bkz.</li>
	<li>Doku kesitlerini, mikrosantrifüj tüpündeki seyreltme tamponunda fare monoklonal anti-CGRP (1:500) ve koyun poliklonal anti-LYVE1 antikorunun (1:500) birincil antikorlarını içeren çözeltiye aktarın (bkz. NOT: Seyreltme tamponu bileşimi, 1x PBS'de% 1 normal eşek serumu,% 0.2 Triton-X 100 ve% 0.2 sodyum aziddir.</li>
	<li>Doku bölümlerini oda sıcaklığında yıkama tamponu ile iki kez yıkayın, ardından yıkama tamponunda 4 °C'de gece boyunca çalkalayıcıda tutun. NOT: Yıkama tamponu bileşimi 0,1 M PB'de (pH 7,4) %0,2 Triton-X 100'dür.</li>
	<li>Ertesi gün, doku kesitlerini eşek anti-fare IgG H & L Alexa-Flour488 (1:500) ve eşek anti-koyun IgG H & L Alexa-Flour405 (1:500) ve Alexa-Flour594 falloidin (1:1000) (bkz.</li>
	<li>Doku kesitlerini, oda sıcaklığında 1 saat, iki kez yıkama tamponu ile altı delikli bir plakada yıkayın. Doku bölümlerini çalkalayıcı üzerindeki yıkama tamponunda gece boyunca 4 ° C'de tutun.</li>
	<li>Doku kesitlerini doku temizleme reaktifine aktarın ( bakınız Malzeme Tablosu, hacmi numune hacminden beş kat daha fazlaydı) ve çalkalayıcı üzerinde 60 rpm'de oda sıcaklığında 1 saat boyunca yavaşça döndürün. NOT: Bu tedaviden sonra doku kesitleri netleşir (Şekil 2B).</li>
	<li>Temizlenmiş dokuları slayta monte edin, dokuları bir ara parça ile daire içine alın ve boşluğu taze doku temizleme reaktifi ve örtü kayması ile yapıştırın.</li>
</ol>3. Geleneksel yaklaşımı takiben CGRP, falloidin ve LYVE1 ile üçlü floresan boyama
NOT: Bir karşılaştırma olarak, aynı boyama geleneksel teknikler izlenerek 30 μm kalınlığında doku kesitlerinde de gerçekleştirilmiştir.
<ol><li>Doku kesitlerini enine yönde bir mikrotom üzerinde 30 μm'de dilimleyin ve slayta monte edin.</li>
	<li>0,1 M PB'de %3 normal eşek serumu ve %0,3 Triton X-100 içeren blokaj çözeltisi ekleyin ve bölümleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve fare monoklonal anti-CGRP (1:500) ve koyun poliklonal anti-LYVE1 antikorunun (1:500) birincil antikorlarını içeren çözelti ile bölümleri, 4 ° C'de gece boyunca seyreltme tamponunda inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, doku bölümlerini 0.1 M PB (pH 7.4) ile üç kez yıkayın, eşek anti-fare IgG H & L Alexa-Flour488 (1: 500) ve eşek anti-koyun IgG H & L Alexa-Flour405 (1: 500) ve Alexa-Flour594 falloidin (1: 1000) sekonder antikorlarını içeren karışık çözeltiyi ekler ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Mikroskobik gözlemden önce, bölümleri üç kez 0.1 M PB (pH 7.4) içinde yıkayın, ardından% 50 gliserin içindeki kapaklarla örtün.</li>
</ol>4. Görüntüleme ve analizler
<ol><li>Lekeli örnekleri floresan mikroskop altında gözlemleyin ve ardından konfokal mikroskop kullanarak görüntüleri alın.</li>
	<li>Her 300 μm kalınlığındaki bölümden her biri 10 μm karede 30 görüntü (Z-yığınları ) yakalayın ve konfokal mikroskopi sisteminin görüntü işlemcisini kullanarak tek bir odak içi görüntüyü entegre edin (bkz.<ol>
<li>Üç boyutlu (3B) analiz için konfokal kurulumun görüntü işleme yazılımında aşağıdaki adımları gerçekleştirin: Başlangıç Odak Düzlemini Ayarlama | Bitiş odak düzlemi | ayarlama Adım boyutu | ayarlama Derinlik Deseni | Seçin Görüntü Yakalama | Z serisi. NOT: Mavi floresan sinyallerinin uyarılması ve emisyon dalga boyları sırasıyla 401 nm ve 421 nm idi. Yeşil floresan sinyallerinin uyarılması ve emisyon dalga boyları sırasıyla 499 nm ve 519 nm idi. Kırmızı floresan sinyallerinin uyarılması ve emisyon dalga boyları sırasıyla 591 nm ve 618 nm idi. 152 μm, konfokal iğne deliğinin çapıdır (10x objektif lens, NA: 0,4). Görüntü yakalama çözünürlüğü 1024 × 1024 piksel idi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geleneksel numuneler için (adım 3), her 30 μm kalınlığındaki bölümden 1 μm karede 30 görüntü (Z-yığınları) yakalayın ve bu görüntüleri yukarıda belirtildiği gibi ele alın (adım 4.1-4.2).</li>
	<li>Görüntü işleme sistemi ile görüntüleri 3D rekonstrüksiyon deseninde gösterin.</li>
	<li>Z-yığını konfokal görüntüleri Imaris 9.0'a içe aktararak 3B rekonstrüksiyonlar gerçekleştirin (hücre görüntüleme yazılımı, bkz. Malzeme Tablosu) ve leke yoğunluklarına göre yüzey işlemeleri oluşturun: Yeni yüzeyler ekleyin | Kaynak Kanal | Surface Detail (Yüzeyler Ayrıntısı) | pürüzsüz seçeneğindeki parametreleri belirleyin Mutlak Yoğunluk |'nin eşik seçeneğindeki parametreleri belirleyin Yüzeyleri Sınıflandırma | Bitirin.</li>
	<li>Hücre görüntüleme yazılımı ile pozitif sinir liflerinin yüzey alanında veri elde edin. İşlenen görüntü | İstatistik | Detaylı | Belirli Değerler | Hacim.</li>
</ol>

<ol><li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677(2019).</li>
<li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181(2012).</li>
<li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Currents+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121(2021).</li>
<li>Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw%3A+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749(2014).</li>
<li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin%3A+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406(2018).</li>
<li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models%3A+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li>
<li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+whole+mount%3A+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick%2C+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106(2017).</li>
<li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li>
<li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731(2018).</li>
<li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742(2021).</li>
<li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+phallotoxin%2C+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li>
<li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LYVE-1%2C+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein%2C+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401(2016).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li>
<li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Dermato-Venereologica%22%5BJournal%5D)">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Histology%22%5BJournal%5D)">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li>
<li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li>
<li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+lymphatic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308(2019).</li>
<li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocol%22%5BJournal%5D)">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Bu çalışma, deri innervasyonunu daha iyi anlamak için daha kalın doku kesitlerinde immünofloresan ve 3D görünüm ile daha kalın doku kesitlerinde immünofloresan kullanılarak tüylü ve göz kamaştırıcı derideki kutanöz sinir liflerinin ayrıntılı bir gösterimini sunmaktadır. 1-2 güne kadar antikor inkübasyon süresi ve gece boyunca temizleme işlemi önemlidir. Bu iki önemli adım, kalın kesitlerin immünofloresan boyama etkisini doğrudan etkiler. Hepsi kalın kesitler için uygun olmayan antikorların seçiminden başka bir sorun daha...

Vücudun en büyük organı olan ve çevreye anahtar bir arayüz görevi gören deri, birçok sinir lifi tarafından yoğun bir şekilde innerve edilir 1,2,3. Deri innervasyonu daha önce tüm deri ve doku kesitlerinde boyama gibi çeşitli histolojik yöntemlerle yaygın olarak çalışılmasına rağmen, 4,5,6, kutanöz sinir liflerinin ayrıntılı etkili gösterimi hala bir zorluktur 7,8. Bu göz önüne alındığında, mevcut protokol, kalın doku bölümünde kutanöz sinir liflerini daha net sergilemek için benzersiz bir teknik geliştirmiştir.
Kesitlerin kalınlığına göre sınır nedeniyle, innerve deri sinir liflerinin gözlemlenmesi, elde edilen görüntü bilgisinden kalsitonin gen ile ilişkili peptid (CGRP) sinir lifleri ile lokal doku ve organlar arasındaki ilişkiyi doğru bir şekilde tasvir edecek kadar kesin değildir. 3D doku temizleme teknolojisinin ortaya çıkışı bu sorunu çözmek için uygulanabilir bir yöntem sağlar 9,10. Doku temizleme yaklaşımlarının hızla gelişmesi, son zamanlarda doku yapılarını, tüm organları, nöronal projeksiyonları ve bütün hayvanları incelemek için birçok araç sunmuştur11. Şeffaf cilt dokusu, kutanöz sinir liflerini görselleştirmek için veri elde etmek için konfokal mikroskopi ile çok daha kalın bir bölümde görüntülenebilir.
Bu çalışmada, bir sıçan arka ayağının plantar ve dorsal derisi, tüylü ve göz kamaştırıcı cildin iki hedef bölgesi olarak seçilmiştir 3,4,7. Kutanöz sinir liflerini daha uzun bir mesafede izlemek için, cilt dokusu immünohistokimyasal ve histokimyasal boyama için 300 μm kalınlığında dilimlendi ve ardından doku temizleme tedavisi uygulandı. CGRP, duyusal sinir liflerini12,13 olarak etiketlemek için kullanıldı. Ek olarak, doku arka planındaki kutanöz sinir liflerini vurgulamak için, sırasıyla 14,15 kan damarlarını ve lenfatik damarları etiketlemek için falloidin ve lenfatik damar endotelyal hyalurondan reseptör 1 (LYVE1) daha fazla kullanılmıştır.
Bu yaklaşımlar, kutanöz sinir liflerinin yüksek çözünürlüklü bir görünümünü göstermek ve ayrıca derideki sinir lifleri, kan damarları ve lenfatik damarlar arasındaki uzamsal korelasyonu görselleştirmek için uygulanabilecek basit bir yöntem sağladı; bu, normal cildin homeostazını ve patolojik koşullar altında kutanöz değişikliği anlamak için çok daha fazla bilgi sağlayabilir.

<table><tbody><tr><td>1x fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Solarbio Yaşam Bilimleri</td><td>P1020</td><td>pH 7.2-7.4, 0.01 Mol</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoetanol</td><td>Sigma Yaşam Bilimleri</td><td>T48402-5G</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal floresan mikroskobu</td><td>Olympus Corporation</td><td>Fluoview FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-fare IgG H & L Alexa-Flour488</td><td>Abcam plc.</td><td>ab150105</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-koyun IgG H & L Alexa-Flour405</td><td>Abcam plc.</td><td>ab175676</td><td></td></tr><tr><td>EP tüp</td><td>Wuxi NEST Biyoteknoloji A.Ş.</td><td>615001</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>Donma kademeli kayar mikrotom sistemi</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Oxford Instruments</td><td>v.9.0.1</td><td></td></tr><tr><td>IRIS standart makas</td><td>WPI (World Precision Instruments Inc.)</td><td></td><td></td>503242</tr><tr><td>iSpacer</td><td>SunJin Laboratuvarı co.</td><td>IS005</td><td></td></tr><tr><td>Mikro forseps-Str</td><td>RWD</td><td>F11020-11</td><td></td></tr><tr><td>Fare monoklonal anti-CGRP antikoru</td><td>Santa cruz biyoteknoloji, Inc.</td><td>sc-57053</td><td></td></tr><tr><td>Nötr tamponlu Formalin</td><td>Solarbio Yaşam Bilimleri</td><td>G2161</td><td>%10</td></tr> <tr><td>Normal eşek serumu</td><td>Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları</td><td>017-000-12</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Daha Uzun Hassas Pompa Co., Ltd</td><td>BT300-2J</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.52 çözüm</td><td>SunJin Lab co.</td><td>RC152001</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Düzenli agaroz</td><td>Gen Şirketi Limited</td><td>Şirketi G-10</td><td></td></tr><tr><td>SEMKEN 1 x 2 Diş Doku Forseps-Str</td><td>RWD</td><td>F13038-12</td><td></td></tr><tr><td>Koyun poliklonal anti-LYVE1 antikoru</td><td>R& D Sistemleri A.Ş.</td><td>AF7939</td><td></td></tr><tr><td>Altı kuyulu plaka</td><td>Corning Incorporated</td><td>3335</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma Life Science</td><td>S2002</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma Life Science</td><td>V900116</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Süper Yapıştırıcı</td><td>Henkel AG & Co.</td><td>Pattex 502</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Saplar</td><td>RWD</td><td>S32003-12</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio Yaşam Bilimleri</td><td>9002-93-1</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Üretan</td><td>Sigma Yaşam Bilimleri</td><td>U2500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>VANNAS yaylı makas</td><td>RWD</td><td>S1014-12</td><td></td></tr><tr><td>Titreşimli mikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

Çoklu floresan boyama ve doku temizleme yaklaşımları kullanarak tüylü ve glabrous cilt İnnervasyonunu 3d desende göstermek

Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

Deri innervasyonu periferik sinir sisteminin önemli bir parçasıdır. Kutanöz sinir liflerinin incelenmesi hızla ilerlemiş olsa da, dağılım ve kimyasal özelliklerinin anlaşılmasının çoğu, ince doku kesitlerinde geleneksel histokimyasal ve immünohistokimyasal boyamadan kaynaklanmaktadır. Doku temizleme tekniğinin gelişmesiyle birlikte daha kalın doku kesitlerinde kutanöz sinir liflerinin görüntülenmesi mümkün hale gelmiştir. Mevcut protokol, iki tipik kıllı ve göz kamaştırıcı cilt bölgesi olan sıçan arka ayağının plantar ve dorsal derisinden 300 μm kalınlığında doku kesitlerinde çoklu floresan boyamasını tanımlamaktadır. Burada, kalsitonin geni ile ilişkili peptid duyusal sinir liflerini etiketlerken, faloidin ve lenfatik damar endotelyal hyaluronan reseptörü 1 sırasıyla kan ve lenfatik damarları etiketler. Konfokal mikroskop altında, etiketli duyusal sinir lifleri tamamen daha uzun bir mesafeden takip edildi, derin kutanöz tabakada demetler halinde ve yüzeysel tabakada serbest stilde çalıştı. Bu sinir lifleri kan damarlarına paralel olarak koştu veya onları çevreledi ve lenfatik damarlar tüylü ve göz kamaştırıcı ciltte üç boyutlu (3D) bir ağ oluşturdu. Mevcut protokol, cilt innervasyonunu incelemek için metodoloji perspektifinden mevcut geleneksel yöntemlerden daha etkili bir yaklaşım sunmaktadır.

Üçlü floresan boyama işleminden sonra, sinir lifleri, kan damarları ve lenfatik damarlar, tüylü ve göz kamaştırıcı deride sırasıyla CGRP, faloidin ve LYVE1 ile açıkça etiketlendi (Şekil 3,4). Temizleme tedavisi ile, CGRP-pozitif sinir lifleri, faloidin-pozitif kan damarları ve LYVE1-pozitif lenfatik damarlar, cildin tüm yapısal bilgisini elde etmek için daha derin bir derinlikte görüntülenebilir (Şekil 3). Bu doku yapıları 3B bir düzende daha da...

Doku kesitlerinin kalınlığı deri innervasyonunun morfolojik çalışmasını sınırladı. Mevcut protokol, konfokal mikroskopi altında kalın 300 μm doku kesitlerinde kutanöz sinir liflerini görselleştirmek için benzersiz bir doku temizleme tekniğini tanımlamaktadır.

Çoklu Floresan Boyama ve Doku Temizleme Yaklaşımları Kullanarak Tüylü ve Glabrous Cilt İnnervasyonunu 3D Desende Göstermek

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

Protokolümüz, sinir liflerinin gözlemlenmesinde hassasiyet sağlayabilecek konfokal mikroskop kullanarak senkronizasyon bölümünü gözlemlemek için uygulanabilir bir yöntem sağladı. Basit ve kolay doku temizleme protokolü bu tekniğin temel avantajıdır. Doku temizleme işlemi verimlidir ve yaklaşık 30 dakika ila bir saat sürer.Metin el yazmasında belirtildiği gibi ötenazi sıçanı üzerinde perfüzyon yapın. Dorsum derisini ve tabanını arka pençeden çıkarmak için bir neşter kullanın. Dondurulmuş bir bölüm gerektiren örnekler için, dokuları iki saat boyunca 0.1 molar PB'de aldehitten% 4 oranında sabitleyin.Yıkadıktan sonra, cilt dokularını 37 santigrat derecede %2 agaroza gömün ve soğutmak için buz kutusunun içine yerleştirin. Titreşimli mikroton üzerine monte edilen dokuyu buzlu suyla sabitleyin ve enine yönde 500 mikrometre kalınlığında dilimleyin. Dilimledikten sonra, agarozu bölümlerden çıkarın ve 1x PBS ile altı kuyucuklu bir plakada saklayın.Doku kesitlerini, dört santigrat derecede gece boyunca 1x PBS'de% 2 triton X-100'lük bir çözelti içinde inkübe edin. Doku bölümlerini bloke edici tampona yerleştirin ve çalkalayıcıda gece boyunca dört santigrat derecede dakikada 72 rotasyonda döndürün. Doku kesitlerini, mikro santrifüj tüpündeki seyreltme tamponunda fare monoklonal anti-CGRP ve koyun poliklonal anti-LYVE-1 antikorunun birincil antikorlarını içeren çözeltiye aktarın.Daha sonra çalkalayıcı üzerinde iki gün boyunca dört santigrat derecede döndürün. Doku bölümlerini oda sıcaklığında yıkama tamponu ile iki kez yıkayın, ardından yıkama tamponunda dört santigrat derecede gece boyunca çalkalayıcıda tutun. Ertesi gün, doku bölümlerini bir mikro santrifüj tüpünde ikincil antikorları içeren karışık çözeltiye aktarın ve çalkalayıcı üzerinde dakikada 72 rotasyonda dört santigrat derecede beş saat boyunca döndürün.Doku kesitlerini, oda sıcaklığında bir saat boyunca iki kez yıkama tamponu ile altı kuyucuklu bir plakada yıkayın. Doku bölümlerini çalkalayıcı üzerindeki yıkama tamponunda gece boyunca dört santigrat derecede tutun. Doku kesitlerini doku temizleme reaktifine aktarın ve çalkalayıcı üzerinde dakikada 60 rotasyonda oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe döndürün.Şeffaf dokuları slayta monte edin, ardından dokuları bir ara parça ile daire içine alın ve boşluğu taze doku temizleme reaktifi ve kapak kayması ile yapıştırın. 3D patern, CGRP pozitif sinir liflerinin deri altı dokusundan ve dermisten epidermise geçtiğini gösterdi. Bu sinir lifleri, dermis içinde dallanmış deri altı dokusunda demetler halinde koştu ve epidermiste sonlandı.Buna karşılık, pozitif kan damarlarındaki faloidin ve LYVE-1 pozitif lenfatik damarlar deri altı dokusunda ve dermiste dağılır. Genellikle CGRP pozitif sinir lifleri, kıllı ve göz kamaştırıcı ciltte 3D bir ağ oluşturan kan damarlarına ve lenfatik damarlara paralel olarak koştu veya onları çevreledi. Konvansiyonel yaklaşımla, sinir lifleri kan damarları ve lenfatik damarlar ince kesitlerde CGRP faloidin ve LYVE-1 ile açıkça etiketlenmiş olmasına rağmen, bu yapıların gözlenmesi dilim kalınlığı ile sınırlıydı ve tam olarak gözlenemiyordu.30 mikrometre kalınlığa sahip kesitte CGRP pozitif sinir liflerinin yüzey alanında tüylü deri ile göz kamaştırıcı deri arasında fark yoktu. 300 mikrometre kalınlığındaki doku kesitlerinde, saçlı deri ile karşılaştırıldığında, göz kamaştırıcı cildin CGRP pozitif sinir liflerinin yüzey alanı önemli ölçüde artmıştır. Antikor inkübasyonundan sonra temizleme tamponunun yüksek ozmotik basınçla kullanılması önemlidir.Birkaç kez, immüno-floresan boyama için gereken temizleme süresi gereklidir. Bu prosedürü takiben, altı bölümde diğer doku ve organların boyanması ve gözlemlenmesi olasılığının da mevcut olduğuna inanıyoruz. Bu teknik, nörobilim araştırmacılarının yüzey alanı ve nöro liflerin durumuyla karşılaşmalarına yardımcı olabilir.Ayrıca doku ve organların inovasyonunu gözlemlememize yardımcı olur.

demonstrating-hairy-glabrous-skin-innervation-3d-pattern-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz bir bütün montaj immünohistokimya tanıtmak ve lazer fare embriyonik ekstremite cilt karmaşık damar ağı oluşumunu analiz etmek için birden fazla etiketleme ile konfokal mikroskopi tarama.

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Periferik duyusal sinir lifi alt tiplerinin İmmünositokimyasal kimlik (ve orada protein ekspresyonu tespit), periferik hissi altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için kilit öneme sahiptir. Burada periferik duyusal sinir lifleri belirli immün için, deri ve bacak kemikleri gibi periferik / visseral doku örnekleri, hazırlama yöntemleri açıklanmaktadır.

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Gibi nöromüsküler kavşaklar (NMJs) terminal Schwann hücreleri (SC'ler) gibi sık donatılı dokularda, tek tek hücrelerin Görselleştirme zordur. "Ardışık fotoğraf beyazlatma" bleaching sıralı time-lapse görüntüleme ile kombine edilebilir triangularis sternumun kas eksplant, elverişli bir sinir-kas preparatı,, örneğin tek bir terminal SC'ler, tasvir verir...

Sıralı Nöromusküler Kavşağı&#39;nda Tek Schwann Hücreleri belirginleştiren Photo-beyazlatma

Ağrılı nöropatiler (PN) olarak nosiseptif intraepidermal sinir lifleri (IENFs) değişiklikleri incelemek için, doğrudan nosiseptif IENFs gözlenen üç boyutlu morfolojik değişiklikleri incelemek olabilir protokolleri geliştirmiştir. IENFs üç boyutlu analiz PN İESL morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için bir potansiyele sahiptir.

İnsan Cilt Biyopsiler içinde Nosiseptif İntraepidermal Sinir Elyaf üç boyutlu görüntüleme

Bu tür saç folikülleri ve sinir uçları gibi - - mekansal organizasyon farklı desen sergileyen Memeli cilt yapıları çeşitli bir dizi içerir. Düz bir montaj olarak cilt analiz deri yapıları tam kalınlığı yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için bu doku 2-boyutlu geometri yararlanır.

Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz ​​Görüntüleme Dağı

Bu iletişim kuralı görselleştirmek ve sinir özgü mitokondri ölçmek için üç boyutlu (3D) görüntüleme ve çözümleme teknikleri kullanır. Teknikleri bir floresan sinyal başka bir floresan sinyalinden gelen verilerin bir alt kümesini yalıtmak için kullanıldığı diğer durumlar için geçerlidir.

Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi

Burada, stiril piridinyum boyalarla boyama ve lekelenme sırasında fare kulağı derisi kıl foliküllerini innerve eden palisade uçlarının canlı mızrak şeklinde duyusal terminallerini görüntülemek için yeni bir hazırlığı açıklıyoruz.

Saç Folikül hançer Endings Yaşam Sinir Terminal Etiketleme Optik İzleme<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Fare Kulak Cilt

Bu rapor tam kalınlıkta fare deri biyopsi açıklık ve 3D tek hücre çözünürlükte protein ekspresyonu, çoğalan hücreleri ve Sebositler görselleştirmek için bir KÜBİK protokol tanımlamaktadır. Bu yöntem cilt anatomi ve patoloji doğru değerlendirilmesini sağlar ve genetiği değiştirilmiş fare hatları anormal epidermal fenotipleri.

KÜBİK Protokol Tüm Dağı Cilt Hazırlıkları Tek Hücre çözünürlükte Protein Anlatım Görseller

Bu çalışma, konfokal görüntüleme yöntemlerinin tam olarak kullanılmasını sağlayan kalın, üç boyutlu doku kesiti analizi için yeni bir işleme ve görüntüleme protokolü sunmaktadır. Bu protokol antijenliği korur ve cilt histolojisini ve potansiyel olarak diğer doku tiplerini analiz etmek için sağlam bir sistemi temsil eder.

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Burada, bir hücre kültürü laboratuvarında rutin araştırmalar için çeşitli 3D cilt modellerini tanıtmak için ucuz ve basit prosedürler sunuyoruz. Araştırmacılar, ticari olarak mevcut modellere güvenmeden ihtiyaçlarına göre uyarlanmış modeller oluşturabilirler.

Çok Sayıda Uygulama için Cilt Modelleri Oluşturma - İki Boyutlu (2D) Monokültürden Üç Boyutlu (3D) Çoklu Kültüre

Bu çalışma, farelerin ön pençe derisindeki düşük eşikli mekanoreseptör (LTMR) akson terminallerinin görselleştirilmesi için in vivo iki fotonlu görüntüleme yaklaşımını sunmaktadır. Bireysel aksonların tekrarlanan, yüksek çözünürlüklü görüntülemesi kullanılarak, bu yöntem gelişim sırasında ve yetişkinlerde deri duyusal devresinin yapısı ve işlevini incelemek için yeni bir platform sağlar.

Fare Derisindeki Dokunma Duyusal Akson Morfolojisinin İntravital İki Fotonlu Görüntülemesi

Keşfedin, konfokal mikroskopi ve doku temizleme teknikleri kullanarak kalın deri kesitlerinde CGRP pozitif sinir liflerinin 3D ağ yapısını görüntüleme yöntemini. Bu teknik, tüylü ve glabrous deri innervasyonunu kapsamlı şekilde incelemeye olanak tanır.

Çoklu Floresan Boyama ve Doku Temizleme Yaklaşımları Kullanarak Tüylü ve Glabrous Cilt İnnervasyonunu 3D Desende Göstermek

Daha fazla video keşfet