İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Üretilen İzojenik Böbrek Glomerulus Çipi

İzojenik glomerulus çipi, hastaya özgü hastalık modellemesi ve nefrotoksisite testi ve gelişmiş hassas tıp uygulamalarına olanak sağlayacaktır. Glomerüler epitel ve endotel, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin veya IPSC'lerin tek bir popülasyonundan türetilir. IPSC'ler sınırsız kendini yenilemeye sahiptir ve hemen hemen her hücre tipine farklılaşabilir.

Bu teknik, patolojik hücresel fenotipleri ve hastalıkları değerlendirmek için kullanılabilir. Hastaya özgü organ çipi, ilaç taraması ve mekanik çalışmalar için bir platform olarak da hizmet edebilir. Bu model, belirli bir hastaya kişiselleştirilmiş bir çip sistemi üzerinde bir vücudun geliştirilmesine uygulanabilir.

Bu sistem, klinik testlerden önce hastaya özgü yanıtları tahmin etme potansiyeline sahiptir. İdrar kanalına nazikçe 25 mikrolitre bazal membran matris 2 çözeltisi ve çipin kılcal kanalına 20 mikrolitre ekleyerek başlayın. İki steril 15 mililitrelik konik tüp kapağı alın ve 500 mikrolitre steril damıtılmış su ile doldurun.

Kurumasını önlemek için kapağı Petri kabına yerleştirin ve kapağı kabın üzerine yerleştirin. Gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İlerlemede, ortamı% 90 akıcılıkta 15 günlük bir vasküler endotel hücresi kültürü içeren T75 şişelerinden aspire edin.

Beş mililitre hücre ayrılma tamponu ekleyin ve beş ila yedi dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra hücreleri 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın ve beş mililitre DMEM / F-12 ekleyin. Beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüj.

Süpernatantı çıkarın ve hücreleri 300 mikrolitre endotel bakım ortamında yeniden askıya alın. Yaklaşık 2 milyon hücre elde etmek için hücreleri hemositometre ile sayın. Bir P200 bariyer ucu kullanarak, mikroakışkan çipin hem üst hem de alt kanallarını 200 mikrolitre DMEM / F-12 ile yıkayın ve aynı anda çıkışın çevresinden aspire edin.

Aspiratöre bağlı P200 bariyer ucu ile çipi alt kanalın çıkışından uzakta sıkıca tutun. Vasküler endotel hücre süspansiyonunun 20 mikrolitresini çipin kılcal kanalına sıkıca enjekte edin ve ortamı çıkışın çevresinden dikkatlice aspire edin. Mikroskop altında kabarcıklar veya düzensiz bir tohumlama yoğunluğu olup olmadığını kontrol edin.

Çipi yavaşça ters çevirin, böylece hücreler esnek PDMS membranının bazal tarafına yapışabilir. Çipi tutucu kartuşa yerleştirin ve membranın kurumasını önlemek için kartuşa üç mililitre PBS ekleyin. Çipi üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Mikroskop altındaki alt kanalda, esnek PDMS membranına bağlı bir birleşik hücre tabakası olup olmadığını kontrol edin. Kılcal kanal çıkışının çevresinden aspire olurken alt kanalın girişine 200 mikrolitre endotel bakım ortamı ekleyerek bağlanmamış hücreleri yıkayın. Çipi tekrar tutucu kartuşa yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, kılcal kanalı 200 mikrolitre endotel bakım ortamı ile hafifçe yıkayın. İdrar kanalını 200 mikrolitre DMEM/F-12 ile yıkayın ve giriş ve çıkış portlarına 50 mikrolitre DMEM/F-12 bırakın. Ara mezoderm hücrelerini ilerleterek, 12 kuyucuk plakasının her bir kuyucuğundan ara mezoderm indüksiyon ortamını bir mililitre Tripsin EDTA ile değiştirin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Bir hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri nazikçe kazıyın ve pipetleme kullanarak hücreleri ayırın. Her bir oyuğa iki mililitre Tripsin nötralizasyon çözeltisi ekleyin ve hücreleri 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın. DMEM / F-12 ile hücre süspansiyonunun hacmini 50 mililitreye kadar yapın ve beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüj yapın.

Süpernatantı aspire edin ve yaklaşık 3 milyon hücre elde etmek için hücreleri 500 mikrolitre ara mezoderm indüksiyon ortamında yeniden askıya alın. Hücreleri bir hemositometre ile sayın. Çipi tutun ve ortamı prizin çevresinden dikkatlice aspire ederken çipin idrar kanalına 25 mikrolitre hücre süspansiyonunu sıkıca enjekte edin.

Kabarcıklar veya düzensiz hücre tohumlama yoğunluğu olup olmadığını kontrol edin. Talaş tutucu kartuşuna üç mililitre PBS ekleyin ve üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, her iki kanalı da kendi hücre kültürü ortamlarından 200 mikrolitre ile yıkayın.

Boş P200 bariyer uçlarını idrar ve kılcal kanalların her iki çıkışına da takın. Pipet 200 mikrolitre endotel bakım maddesi ve yarısını kılcal kanal girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içine, kanalın hem girişi hem de çıkışı ortamla doldurulmuş pipet uçlarına tutturulacak şekilde serbest bırakın.

İdrar kanalı girişi için bu prosedürü 200 mikrolitre ara mezoderm bakım ortamı ile tekrarlayın. Cipsleri gece boyunca 37 santigrat dereceye gömülü uçlarla inkübe edin. Çipleri organ çipi biyoreaktörüne bağlamak için, önce kanallardan P200 uçlarını çıkarın.

Kurumayı önlemek için idrar ve kılcal kanalların giriş ve çıkışına ilgili ortamın damlacıklarını ekleyin. İdrar giriş rezervuarına üç mililitre sıcak podosit indüksiyon ortamı ve kılcal giriş rezervuarına üç mililitre sıcak endotel bakım ortamı ekleyin. İlgili ortamın 300 mikrolitresini doğrudan çıkış portu üzerinden çıkış rezervuarlarına ekleyin.

Baklaları tepsiye ve organ çipi biyoreaktörüne kaydırın. İki dakika boyunca prime döngüsünü seçmek ve başlatmak için döner kadranı kullanın. Bölmenin alt tarafında, dört akışkan bağlantı noktasının tümünde küçük damlacıklar olup olmadığını görsel olarak kontrol edin.

Bölmenin alt tarafı ile mikroakışkan çip bağlantı noktaları arasında sıvıdan sıvıya temas sağlamak için, çip taşıyıcısını yavaşça bölmenin içine kaydırın. Çip taşıyıcı tırnağını yavaşça içeri ve yukarı doğru bastırın. Çipin yüzeyinden fazla ortamı aspire edin.

Organ çipi biyoreaktör akış hızını saatte 60 mikrolitreye ayarlayın. Döngüsel gerinimi 0,4 hertz'de %10'a ayarlayın. Düzenleme döngüsünü seçmek ve iki saat boyunca çalıştırmak için organ çipi biyoreaktörü üzerindeki döner kadranı kullanın.

Çıkış rezervuarlarını ortam seviyesinde bir artış olup olmadığını görsel olarak inceleyin. Düzenleme döngüsünü seçmek için organ çipi biyoreaktörü üzerindeki döner kadranı kullanın. Kültürün 17. gününden sonra, günlük olarak idrar kanalı çıkış rezervuarlarından ortamı limandan çapraz olarak uzaklaştırın, ancak rezervuarda bir miktar ortam tutun.

İdrar kanalı giriş rezervuarını beş gün boyunca her iki günde bir üç mililitreye kadar podosit indüksiyon ortamı ile doldurun. Beş gün sonra, ortamı idrar kanalından aspire edin, ancak rezervuarda bir miktar ortam tutun. İdrar kanalı giriş haznesini günlük olarak üç mililitre podosit bakım ortamı ile doldurun.

Benzer şekilde, ortamı kılcal kanal çıkışından aspire edin ve giriş rezervuarlarını günlük olarak endotel bakım ortamı ile doldurun. Bu protokolü kullanarak, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler, vasküler endotel hücrelerini ve podositleri çoğaltarak glomerulusun fonksiyonel bir in vitro modelini geliştirmek için kullanıldı. Podosit indüksiyonu ve vasküler endotel yayılımından sonraki 21. günde, çiplerin içindeki hücreler, podositler için Podocin ve Nefrin, vasküler endotel hücreleri için VE Cadherin ve PECAM-1 gibi soy tanımlama belirteçlerini eksprese etti.

Hem podosit hem de vasküler endotel hücre katmanları, böbrek glomerulusunda en bol GBM proteini olan Kollajen IV'ü eksprese etti. Glomerulus yongaları, kılcal damardan idrar kanalına inülin gibi küçük molekülleri seçici olarak filtrelerken, albümin gibi büyük proteinlerin kılcal kanaldan ayrılmasını önleyerek seçici bir moleküler filtrasyon fonksiyonu gösterdi. Dört ila yedi günlerinde endotel indüksiyonu sırasında, hücre sayısındaki bir artış ikincil bir hücre tabakasına neden olabilir, ancak aşırı tohumlama, farklılaşmayı engelleyebilecek agregasyona neden olabilir.

PDMS çip bileşenlerinin yetersiz bağlanması, sıvı akış yolunda tıkanma veya filtrasyon bariyerinin tehlikeye girmesi durumunda üriner ve kılcal kanallar arasında beklenmeyen sıvı çapraz akışı gözlenebilir. Endotel ve epitel tohumları ekerken ve cipsleri 15. günden itibaren korurken, her adımda kanallardaki hava kabarcıklarını görsel olarak incelemek önemlidir. İzojenik glomerulus çipinde, terapötik potansiyellerini veya toksisite seviyelerini test etmek için klinik olarak ilgili ilaç adayları uygulanabilir.

Bu teknik şimdi insan böbrek hastalığının genetik temelini anlamak ve kişiselleştirilmiş terapötikler geliştirmek için fırsatlar sunuyor.