Name: Cas9 Ribonükleoproteinlerin ve mRNAnın Yeni İzole Edilmiş Primer Fare Hepatositlerine Elektroporasyon Aracılı Verilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Keşfedin, primer fare hepatositlerinde CRISPR-Cas9 gen düzenleme yöntemini. Elektroporasyon ile yüksek canlılıkta hücre elde ederek metabolik hastalık modelleri oluşturun ve gen tedavisi araştırmalarına katkı sağlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RNC, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS), Amerikan Karaciğer Hastalıkları Çalışmaları Derneği Vakfı ve Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği tarafından desteklenen Güney Carolina Biyomühendislik Rejenerasyon ve Doku Oluşumu Merkezi Pilot hibesinden P30 GM131959, 2021000920 hibe numaraları altında fon aldı. ve sırasıyla 2022000099. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği veya Amerikan Karaciğer Hastalıkları Çalışmaları Vakfı'nın resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Şekil 1'in şeması BioRender.com ile oluşturulmuştur.

<ol><li>Pampols, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+metabolic+rare+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Inherited metabolic rare disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).</li>
<li>Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+approach+to+treatable+inborn+metabolic+diseases%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).</li>
<li>Arnon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+transplantation+in+children+with+metabolic+diseases%3A+the+studies+of+pediatric+liver+transplantation+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience.</a> Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).</li>
<li>Maiorana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preemptive+liver+transplantation+in+a+child+with+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia.</a> Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).</li>
<li>OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx">https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx</a> (2019).</li>
<li>Fabris, L., Strazzabosco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+and+undiagnosed+liver+diseases%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities.</a> Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).</li>
<li>Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+translational+models+for+rare+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).</li>
<li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+lethality+and+vascular+defects+in+mice+lacking+the+notch+ligand+Jagged1%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1.</a> Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).</li>
<li>Lima, A., Maddalo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEMMs%3A+Somatically+engineered+mouse+models.+a+new+tool+for+in+vivo+disease+modeling+for+basic+and+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research.</a> Frontiers in Oncology. 11, 1117(2021).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seamless+modification+of+wild-type+induced+pluripotent+stem+cells+to+the+natural+CCR5Delta32+mutation+confers+resistance+to+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).</li>
<li>Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+knock-down+in+post-mitotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons.</a> PLoS One. 9 (8), 105584(2014).</li>
<li>Hoban, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+correction+of+the+sickle+mutation+in+human+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells.</a> Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).</li>
<li>Rathbone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-mediated+delivery+of+Cas9+ribonucleoproteins+results+in+high+levels+of+gene+editing+in+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes.</a> The CRISPR Journal. , (2022).</li>
<li>Benchling [Biology Software]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://benchling.com">https://benchling.com</a> (2022).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+functional+hepatocyte-like+cells+from+mouse+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.</a> Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).</li>
<li>Severgnini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+two-step+method+for+isolation+of+functional+primary+mouse+hepatocytes%3A+cell+characterization+and+asialoglycoprotein+receptor+based+assay+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development.</a> Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).</li>
<li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222(2020).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+%283D%29+printing+of+mouse+primary+hepatocytes+to+generate+3D+hepatic+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Treatment+and+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure.</a> Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).</li>
<li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li>
<li>Lattanzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CRISPR%2FCas9+delivery+to+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+for+therapeutic+genomic+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements.</a> Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).</li>
<li>Dever, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+beta-globin+gene+targeting+in+human+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells.</a> Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).</li>
<li>Grompe, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrompe%2C+M+%22Hereditary+Tyrosinemia%3A+Pathogenesis%2C+Screening+and+Management%22">Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management</a>. Tanguay, R. M. , Springer International Publishing. 215-230 (2017).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmek için rakip çıkarları yoktur.

Hepatosit izolasyonu protokolünde belirtilen adımlar zordur ve yeterlilik için pratik gerektirir. Karaciğerden başarılı hepatosit izolasyonu için birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, inferior vena kavanın uygun şekilde kanülasyonu tam karaciğer perfüzyonu için gereklidir. Perfüzyon sonrası karaciğerde beyazlatma olmaması kateterin yer değiştirmesini gösterir (Tablo 1). İnferior vena kava (retrograd perfüzyon) portal venden (antegrad perfüzyon) daha basit ve daha erişilebilir olduğu için prodüksiyonda k...

Karaciğerin IMD'leri, toksik metabolitlerin birikmesine yol açan metabolizmada rol oynayan çok önemli bir hepatik enzimin eksikliği ile karakterize genetik bozukluklardır. Tedavi olmadan, karaciğerin IMD'leri organ yetmezliği veya erken ölümle sonuçlanır 1,2. Karaciğer IMD'leri olan hastalar için tek küratif seçenek, donör organların düşük mevcudiyeti ve prosedürü takiben immünsüpresif tedaviden kaynaklanan komplikasyonlar nedeniyle sınırlı olan ortopik karaciğer transplantasyonudur 3,4. Organ Tedarik ve Transplantasyon Ağı tarafından toplanan son verilere göre, karaciğer nakli bekleme listesindeki yetişkin hastaların sadece% 40-46'sı bir organ alırken, bu hastaların% 12.3'ü bekleme listesindeyken ölmektedir5. Ayrıca, tüm nadir karaciğer hastalıklarının sadece% 5'inde FDA onaylı bir tedavivardır 6. Karaciğerin IMD'leri için yeni tedavilere kritik bir ihtiyaç olduğu açıktır. Bununla birlikte, yeni tedavi seçenekleri geliştirmek için uygun hastalık modelleri gereklidir.
İn vitro ve in vivo sistemleri kullanarak insan hastalıklarının modellenmesi, etkili tedavilerin geliştirilmesi ve karaciğerin IMD'lerinin patolojisinin incelenmesi için bir engel olmaya devam etmektedir. Nadir karaciğer hastalığı olan hastalardan hepatositlerin elde edilmesi zordur7. Hayvan modelleri, hastalık patolojisi hakkında bir anlayış geliştirmek ve terapötik stratejileri test etmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, bir engel, ölümcül mutasyonlar taşıyan embriyolardan modeller üretmektir. Örneğin, Jag1 geninin 5′ ucuna yakın 5 kb'lik bir dizinin homozigot delesyonlarını içeren embriyolarla Alagille Sendromu'nun (ALGS) fare modellerini oluşturma girişimleri, embriyoların erken ölümüyle sonuçlandı8. Ek olarak, embriyonik kök hücrelerde gen düzenleme ile fare modelleri oluşturmak zaman ve kaynak yoğunolabilir 9. Son olarak, mutasyonlar hedeflenen dokunun dışında ortaya çıkacak ve hastalığın incelenmesini engelleyebilecek kafa karıştırıcı değişkenlere yol açacaktır9. Somatik gen düzenleme, karaciğer dokusunda daha kolay düzenlemeye izin verir ve embriyonik kök hücreleri kullanarak modeller üretmekle ilgili zorlukları atlar.
Elektroporasyon, hücre zarını geçirgenleştirmek için yüksek voltajlı akımlar uygulayarak CRISPR-Cas9'un doğrudan çekirdeğe verilmesini sağlar ve insan embriyonik kök hücreleri, pluripotent kök hücreler ve nöronlar gibi transfeksiyon tekniklerine aykırı olanlar da dahil olmak üzere birçok hücre tipiyle uyumludur10,11,12 . Bununla birlikte, düşük canlılık, elektroporasyonun potansiyel bir dezavantajıdır; prosedürün optimize edilmesi, toksisiteyi sınırlarken yüksek düzeyde doğum sağlayabilir13. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, CRISPR-Cas9 bileşenlerinin birincil fare ve insan hepatositlerine elektroporasyonunun fizibilitesini oldukça verimli bir yaklaşım olarak göstermektedir14. Hepatositlerde Ex vivo elektroporasyon, karaciğerin insan IMD'leri için yeni fare modelleri üretmek için uygulanma potansiyeline sahiptir.
Bu protokol, fare hepatositlerini karaciğerden izole etmek ve daha sonra Cas9 proteini ve sentetik tek kılavuzlu RNA'dan (sgRNA) oluşan RNP kompleksleri olarak CRISPR-Cas9'u elektroporize etmek için ayrıntılı bir adım adım prosedür sağlar veya Cas9 mRNA, yüksek düzeyde hedef gen düzenlemesi elde etmek için sgRNA ile birleştirilmiştir. Ek olarak, protokol, CRISPR-Cas9'un yeni izole edilmiş fare hepatositlerine elektroporasyonunu takiben gen düzenleme verimliliğini, canlılığını ve işlevselliğini ölçmek için yöntemler sağlar.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Ekipman< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR 8 tüplü FLEX-FREE şerit, takılı şeffaf düz kapaklar, doğal</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu Kollajen Plakaları</td><td>Gelişmiş Biomatrix</td><td>5073</td><td></td></tr><tr><td>accuSpin Micro 17R Fisher</td><td>Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td>Hepsi</tr> Bir <tr><td>Arada Floresan Mikroskop</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Analog Vorteks Karıştırıcı</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>ART Geniş BORE filtreli uçlar 1.000 & mikro; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>TC20</td><td></td></tr><tr><td>Mavi Balmumu Diseksiyon Tepsisi</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>DTW1</td><td>9" x 6.5" x 1/2"+F21</td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcı/kaldırıcı</td><td>Argos Technologies</td><td>UX-04396-53</td><td>Pirojenik olmayan, steril</td></tr><tr><td>Konik tüpler (15 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Konik tüpler (50 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Pamuk aplikatörleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-170</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli makas</td><td>Cooper Surgical</td><td>62131</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Petri Kapları</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>100mm, steril</td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Petri Kapları</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td>35mm, steril</td></tr><tr><td>Epoch Mikroplaka Spektrofotometresi</td><td>BioTek Instruments</td><td>250082</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Hücre süzgeci (70 & m)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Cooper Cerrahi</td><td>61864</td><td>Euro-Med Adson Doku Forseps</td></tr><tr><td>IV kateterleri&nbsp;</td><td>BD</td><td>382612</td><td>24 G x 0.75 inç</td></tr><tr><td>IV infüzyon seti</td><td>Baxter</td><td>2C6401</td><td></td></tr><tr><td>MyFuge 12 Mini Santrifüj</td><td>Benchmark Scientific</td><td>1220P38</td><td></td></tr><tr><td>İğneler</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-20</td><td>25 G</td></tr><tr><td>Nükleofektör 2b Cihazı</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>Programı T-028, fare hepatositlerinde elektroporasyon için kullanıldı</td></tr><tr><td>Peristaltik Pompa</td><td>Masterflex</td><td>&nbsp; HV-77120-42</td><td>10 ila 60 dev/dak; 90 ila 260 VAC</td></tr><tr><td>Hassas pompa hortumu</td><td>Masterflex</td><td>HV-96410-14</td><td>25 ft, silikon</td></tr><tr><td>Primaria Kültür Plakaları</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>353846</td><td>Azot içeren doku kültürü</td></tr><tr><td>plakaları Serolojik Pipetler (25 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-567-604</td><td></td></tr><tr><td>Şırıngalar</td><td>BD</td><td>329464</td><td>1 mL, steril</td></tr><tr><td>T100 Termal Döngüleyici</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>ALT</td><td>27577</td><td>Thermo Scientific Hassas Mikroişlemci Kontrollü 280 Serisi, 2.5 L</td></tr><tr><td><güçlü>Reaktifler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alt-R SP Cas9 Nükleaz V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9959336</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap Cas9 mRNA</td><td>Trilink Biyoteknoloji</td><td>L-7606-100</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap&nbsp; EGFP mRNA</td><td>Trilink Biyoteknoloji</td><td>L-7201-100</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrisi</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885076</td><td>Düşük glikoz, piruvat</td></tr><tr><td>Etanol% 70</td> <td>VWR</td><td>71001-652</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Termobilimsel</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Hepatosit Bakımı Orta (MM)</td><td>Lonza</td><td>MM250</td><td></td></tr><tr><td>Hepatosit Kaplama Orta (PM)</td><td>Lonza</td><td>MP100</td><td></td></tr><tr><td>Fare Albümini ELISA Kiti</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0010653</td><td></td></tr><tr><td>Fare/Sıçan Hepatosit Nükleofektör Kiti</td><td>Lonza</td><td>VPL-1004</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq HotStart DNA Polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0481L</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x pH 7.4&nbsp;</td><td>Termobilimsel</td><td>70011-044</td><td>Kalsiyum veya magnezyum klorür yok</td></tr><tr><td>Percoll (PVP çözeltisi)</td> <td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-500790A</td><td></td></tr><tr><td>Periyodik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7875-25G</td><td></td></tr><tr><td>Permount Montaj Ortamı</td><td>VWR</td><td>100496-550</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract DNA Ekstraksiyon Çözümü</td><td>Lucigen Corporation</td><td>QE05090</td><td></td></tr><tr><td>Schiff' s fuksin-sülfit reaktifi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5133</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td>Fenol kırmızısı</td></tr><tr><td>Vybrant MTT Hücre Canlılığı Testi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V13154</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Perfüzyon Çözeltisi 1 (pH 7.4, filtre sterilize edilmiş)&nbsp; </güçlü></td><td></td><td></td> <td>4 dereceden kararlı; 2 ay boyunca C</td></tr>, <tr><td>EBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14155063</td><td>200 mL'ye kadar</td></tr><tr><td>komple EGTA (0,5 M)</td><td>Bioworld</td><td>40520008-1</td><td>200 &mikro; L</td></tr><tr><td>HEPES (pH 7.3, 1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 mL&nbsp;</td></tr><tr><td><güçlü>Perfüzyon Çözeltisi 2 (pH 7.4, filtre sterilize edilmiş)&nbsp; </güçlü></td><td></td><td></td> <td>4 dereceden kararlı; 2 ay boyunca C</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H20 (1.8 mM)</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>360 ve mikro; L 1 M stok&nbsp;</td></tr><tr><td>EBSS (kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol kırmızısı yok)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-155-063</td><td>200 mL'ye kadar</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>AAJ16924AE 2 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>MgSO4 ve orta nokta; 7H<alt>2</alt>0 (0,8 mM)</td><td>Sigma</td><td>30391-25G</td><td>160 ve mikro; L 1 M stok</td></tr><tr><td><güçlü>Perfüzyon Çözeltisi 3&nbsp; </güçlü></td><td></td><td></td><td>Kullanmadan önce taze hazırlanmış</td></tr><tr><td>Çözüm 2</td><td></td><td></td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Liberaz</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td>0.094 Wunsch birimi/mL</td></tr><tr><td><güçlü>Fare Anestezik Kokteyl&nbsp; </güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asepromzin</td><td></td><td></td><td>0.25 mg/mL nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td></td><td></td><td>7.5 mg/mL nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td></td><td></td><td>1.5 mg/mL nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>Software</td><td>URL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchling</td><td>https://www.benchling.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ImageJ</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td> TIDE: Ayrışma https://tide.nki.nl/ <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>ile <td>İndellerin İzlenmesi</td></tr></tbody></table>

cas9 ribonükleoproteinlerin ve mrna'nın yeni İzole edilmiş primer fare hepatositlerine elektroporasyon aracılı verilmesi

Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes

Bu protokol, primer fare hepatositlerini izole etmek için hızlı ve etkili bir yöntemi ve ardından CRISPR-Cas9'un ribonükleoproteinler (RNP'ler) ve mRNA olarak elektroporasyon aracılı olarak verilmesini açıklar. Primer fare hepatositleri, karaciğer başına 50 × 106 hücreye kadar yüksek verim ve% >85 hücre canlılığı ile sonuçlanan üç aşamalı retrograd perfüzyon yöntemi kullanılarak izole edildi. Bu protokol, hepatositlerin kaplanması, boyanması ve kültürlenmesi için ayrıntılı talimatlar sağlar. Sonuçlar, elektroporasyonun, yeşil floresan protein (GFP)-pozitif hücrelerin yüzdesi ve fare hepatositlerinde% >35'lik mütevazı hücre canlılığı ile ölçüldüğü gibi% 89'luk yüksek bir transfeksiyon verimliliği sağladığını göstermektedir.
Bu yaklaşımın yararlılığını göstermek için, hidroksifenilpiruvat dioksijenaz genini hedef alan CRISPR-Cas9, karaciğerin kalıtsal bir metabolik hastalığı (IMD) ile ilgili terapötik bir geni bozmak için prensip kanıtı gen düzenlemesi olarak birincil fare hepatositlerine elektroporate edildi. RNP'ler için% 78'lik daha yüksek bir hedef üzerinde düzenleme, mRNA ile% 47 düzenleme verimliliğine kıyasla gözlenmiştir. Hepatositlerin işlevselliği, CRISPR-Cas9'un RNP'ler ve mRNA olarak verilmesinin, primer fare hepatositlerinde karşılaştırılabilir hücre canlılığı ile sonuçlandığını gösteren bir albümin testi kullanılarak in vitro olarak değerlendirildi. Bu protokol için umut verici bir uygulama, karaciğeri etkileyen insan genetik hastalıkları için fare modellerinin üretilmesidir.

Kaplanabilir primer hepatositlerin karaciğerden izolasyonu Karaciğer perfüzyonu ve hepatosit izolasyonunun genel süreci Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu deneyde vahşi tip, 8-10 haftalık C57BL6/6J fareler kullanıldı. Prosedürün% 85 ila% 95 arasında bir canlılığa sahip fare başına 20-50 × 106 hücre vermesi beklenmektedir. Canlılık% &lt;70 ise, ölü hücreleri çıkarmak için perkollasyon tedavisi izlenmelidir. Yeni izole edilmiş hepatositler kollajen I kaplı veya azot i...

Bu protokol, primer fare hepatositlerini karaciğerden izole etme ve karaciğerin kalıtsal bir metabolik hastalığı ile ilişkili terapötik bir hedef geni bozmak için CRISPR-Cas9'u ribonükleoproteinler ve mRNA olarak elektroporasyon tekniklerini açıklar. Tarif edilen yöntemler, elektroporasyondan sonra yüksek canlılık ve yüksek düzeyde gen modifikasyonu ile sonuçlanır.

Cas9 Ribonükleoproteinlerin ve mRNA'nın Yeni İzole Edilmiş Primer Fare Hepatositlerine Elektroporasyon Aracılı Verilmesi

This protocol describes a fast and effective method for isolating primary mouse hepatocytes followed by electroporation-mediated delivery of CRISPR-Cas9 ...

Tekniğimizin temel avantajı, in vitro ve in vivo hastalık modelleri üretmenin bir yolu olarak primer fare hepatositlerindeki genleri düzenlemek için kolay, hızlı ve tekrarlanabilir bir yaklaşım olmasıdır. Tekniğimizi kullanarak, izole hepatositlerde bir hedef geni yıkmak ve daha sonra bunları hastaya geri nakletmek, hastalıklı hücreleri gen düzenlenmiş hepatositlerle değiştirmek mümkün olabilir Deneyimsiz araştırmacılar kanülasyonla mücadele edebilir ve kateteri perfüzyon boyunca sabit tutabilir. Kullanıcıların başlamadan önce prosedürü ve sorun giderme yöntemlerini dikkatlice okumaları ve uygulamaları önerilir.Karaciğer perfüzyonu ve hepatosit izolasyonunu gösteren, klinik tesis müdürü Tina Parker ve lisansüstü araştırma görevlisi Ilayda Ates olacaktır. Elektroporasyon prosedürü, laboratuvarımdan mezun bir araştırma asistanı olan Callie Stuart tarafından gösterilecek. Cerrahi anestezi düzlemi altında.Makas kullanarak karın derisinde U şeklinde bir lateral kesi yaparak karaciğer perfüzyonuna başlayın ve deliği yanlardan genişletin. Cildi göğüs kafesine açmaya devam edin. Makas kullanarak, karın boşluğunu göğüs kafesine kadar açığa çıkarmak için periton boyunca kesin.Herhangi bir organı nicklememeye dikkat etmek. Forsepsin arkasını veya makasın künt yüzeyini kullanarak bağırsakları sağ tarafa hareket ettirin. Portal veni ve inferior vena kavayı tanımlayın.Önceden ısıtılmış perfüzyon solüsyonunu kateterden temizlemek için pompayı çalıştırın. Pompayı durdurun ve kateteri çıkarın. Daha sonra katetere bağlı iğnenin ucunu damara 10 ila 20 derecelik bir açıyla inferior vena kavaya yerleştirin, iğneyi kateterden çıkarın.Daha sonra kateteri damara paralel bir hareketle yavaşça damarın içine itin. Kateteri damarın içine daha fazla hareket ettirmeden tüpü kateterle bağlayın. Pompayı dakikada iki mililitre debi ile çalıştırın.Perfüzyonun başarılı olduğunun bir işareti olarak karaciğerin hemen soluklaşmasını bekleyin. Portal damarı makas kullanarak kesin. Akış hızını kademeli olarak dakikada beş mililitreye yükseltin.Perfüzyon çözeltisi üçü aktıktan sonra karaciğerin elastikiyetini dikkatlice izleyin. Karaciğerin yumuşayıp yumuşamadığını belirlemek için, karaciğeri pamuklu çubukla veya forseps ile hafifçe bastırın ve karaciğerde girintilerin oluşup oluşmadığını kontrol edin. Hücre canlılığının kaybını önlemek için aşırı perfüzyona dikkat edin.Karaciğer 30 ila 50 mililitre perfüzyon çözeltisinden sonra yumuşadıktan sonra, üç tanesi aktığında, pompayı durdurun, kateteri ve safra kesesini çıkarın. İçeriğini dökmemeye dikkat edin. Sonra karaciğeri dikkatlice inceleyin.Karaciğeri% 10 FBS ortamı ile buz gibi soğuk DME M içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Olası kan pıhtılarını gidermek için Petri kabını yavaşça döndürün. Karaciğeri buz gibi soğuk DME M ve% 10 FBS ortamı içeren yeni bir Petri kabına aktarın.Karaciğer kapsülünden hücreleri serbest bırakmak için, Petri kabını buzun üzerine yerleştirin, ardından iki çift steril forseps kullanarak, karaciğer kapsülünü tüm loblarda yavaşça parçalayın. Hepatositleri serbest bırakmak için bir hücre kaldırıcı kullanarak karaciğeri yavaşça ortamın etrafında döndürün. Karaciğer çok küçülene ve süspansiyon kahverengi ve opak hale gelene kadar bu harekete devam edin.Karaciğer dokusu kalıntılarını plakadan çıkarın ve düşük hıza ayarlanmış 25 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu buz üzerinde önceden soğutulmuş ve 100 mikrometrelik bir hücre süzgeci ile donatılmış 50 mililitrelik bir konik tüpe dikkatlice aktarın. Kalan hücreleri yüzeyden yıkamak ve toplamak için Petri kabına taze buz gibi soğuk DMEM ve% 10 FBS ortamı ekleyin. Ardından, 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.Tüm hücreler toplanana kadar bu adımı yineleyin. Hepatositleri parankimal olmayan hücrelerden yıkamak ve saflaştırmak için, 50 mililitrelik konik tüpte toplanan hücreleri, düşük yavaşlamada veya herhangi bir mola vermeden beş dakika boyunca dört santigrat derecede 50 RCF'de santrifüj edin. Enkaz ve parankimal olmayan hücreler içeren süper-natonu atın.Ardından, tüpü yavaşça döndürerek peleti artık süper natonda yeniden askıya alın. Pelet yeniden süspansiyonundan sonra 30 mililitre taze buz gibi soğuk DMEM ve% 10 FBS ortamı ekleyin. Elektroporasyon cihazındaki güç düğmesini açarak CRISPR CAS 9 substrat ortamını, hücrelerini ve elektroporasyon cihazını hazırlamaya başlayın.Ardından, ekranda T 0 28 programı görünene kadar X düğmesine ve ardından aşağı ok düğmesine basarak elektroporasyon programını ayarlayın. Elektroporatörlü hepatositler için hedef kuyuları, altı kuyu kollajen tek kaplamalı plakaya 1,5 mililitre PM eklenerek hazırlandı. Plakaları kullanıma hazır olana kadar 37 santigrat derecelik bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.PCR bölünmüş şerit tüplerinde, CAS 9 RMP ve mRNA komplekslerini metin yazısında açıklandığı şekilde hazırlayın. mRNA SG RNA karışımını elektroporasyona kadar buz üzerinde saklayın. Ayrı olarak, floresan mikroskobu kullanarak başarılı elektroporasyonu doğrulamak için bir mikrogram E G F P mRNA içeren bir tüp hazırlayın.Elektroporasyon reaksiyonunu 100 RCF'de dört santigrat derecede iki dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatonu hücre peletinden çıkarın ve tüp duvarının yan tarafı boyunca reaksiyon başına 100 mikrolitre nükleofeksiyon çözeltisi ekleyin. Elektroporasyon çözeltisindeki hepatositleri, tüpü elle hafifçe sallayarak yeniden askıya alın.Hepatositler elektroporasyon çözeltisinde eşit olarak dağıldıktan sonra, hepatosit süspansiyonunun 100 mikrolitresini CAS dokuz kompleksini içeren şerit tüplere aktarın. Şeridin içeriğini bir elektroporasyon kabına iyice aktarın. Nükleo-veteriner damarını elektroporasyon cihazındaki yuvaya yerleştirin.X düğmesine basarak hepatositleri elektroporat yapın. Elektroporasyondan sonra, cihazda şöyle bir ekran açılmasını bekleyin:Tamam. X düğmesine tekrar basın ve kabı çıkarın.Elektroporated kabı 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Elektroporasyon kabına 500 mikrolitre önceden silahlanmış bir PM ekleyin. Elektroporasyon reaksiyonunun 300 mikrolitresini, önceden ısıtılmış plaka üzerindeki her bir hedefe iyi bir şekilde aktarın.Plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Membran matrisini buz gibi soğuk hepatosit bakım ortamına ekleyin ve 10 kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın. Ortamı, hücreleri kapladıktan 24 saat sonra gen düzenleme analizi için belirlenen kuyucuklardan çıkarın.Bindirme karışımını yavaşça hücrelerin üzerine pipetleyin ve plakayı 37 santigrat dereceye geri yerleştirin. Kaplamadan 24 saat sonra, şartlandırılmış ortamı MTT ve albümin tahlilleri için iyi belirlenmiş kuyudan aktarın ve albümin tahlilini gerçekleştirmeye hazır olana kadar bir mikro füj tüpünde saklayın. Genomik DNA'yı çıkararak ve metin makalesinde açıklandığı gibi PCR'yi kurarak hedef CAS dokuz aktivitesinin analizine devam edin.Kaplamadan sonraki 3 ila 12 saat içinde hepatositler plakaya yapıştı ve hücre morfolojisi 24 saat içinde tipik bir poligonal veya altıgen görünüm kazandı İzole hücrelerin saflığı, kaplamadan 24 saat sonra periyodik asit kayma reaktifi kullanılarak glikojen boyama yoluyla doğrulandı. Lekeli hepatositlerin sitoplazması macenta olarak ortaya çıktı. Hepatositler elektroporasyondan 24 saat sonra görüntülendi ve ortalama olarak hepatositlerin %89.8'i GFP pozitifti.Elektroporasyondan üç gün sonra CAS dokuz, analiz edilen HPD lokusunda indüklendi ve sonuçlar, CRISPR Cas dokuz mRNA ve CAS dokuz RNP için% 78.4 indel ile elektroporate hepatositlerde% 47.4'lük hedef indellerde gösterdi. MTT testi, CRISPR Cas dokuz mRNA ve R N P ile tedavi edilen hepatositlerde% 35.4 ve% 45.9 canlılık gösterdi.MTT sonuçları ile tutarlı olarak, normalize albümin seviyeleri, CAS dokuz RNA ile tedavi edilen hepatositlerde% 31.8 ve CAS dokuz r p için% 34.5 idi. Hatırlanması gereken en önemli şey, uygun kanülasyonun sonraki tüm adımları ve prosedürün başarısını etkilediğidir.Bu işlemden sonra, hepatositler nakledilebilir ve engraftmanlarını araştırmak için fareler nakledilebilir. Ayrıca, kaplanmış hepatositlerin genomik DNA'sı, CAS dokuz düzenlemesinin verimliliğini ve özgüllüğünü analiz etmek için çıkarılabilir.

electroporation-mediated-delivery-cas9-ribonucleoproteins-mrna-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bir mikroelektrot dizisi (MEA) kullanarak bir yapışkan memeli hücre kültüründe siRNA karıştırılmış dizi site-spesifik transfeksiyon için madde ayrıntılar protokolü.

Mikroelektrod Diziler Kullanarak siRNA Bağlanan Hücre Yüksek verim, Siteye özgü Transfeksiyon (MEA)

Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon transposon dayalı Tümleştirme vektörlerin sağlar fare tetkikine istikrarlı transfection içinde vivo. Burada, tek bir transgene uzun vadeli kurucu ifade veya kombine kurucu ve Doksisiklin indüklenebilir ifade bir transgene veya miR-shRNA karaciğerde sağlayan pratik bir protokol transfection sistemler mevcut.

Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon kullanarak fare tetkikine genetik Vivo içinde değişiklik kurucu ve indüklenebilir sistemleri

Kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik tekrarlar/ilişkili CRISPR protein 9 (CRISPR/Cas9) interspaced sistem genetik mühendisliği için umut verici bir araçtır ve hedeflenen entegrasyonu transgenes olasılığı kadar açılır. Biz (HMEJ) katılmadan homoloji-aracılı son tarif-verimli DNA Tümleştirme vivo içinde hedef ve gen tedavileri CRISPR/Cas9 kullanarak hedef için strateji tabanlı.

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

Bir iletişim kuralı için hızlı fare CRISPR/Cas9-aracılı gene bozulma ve insan birincil hematopoetik hücreler bu makalede açıklanan. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins elektroporasyon ile vitro transkripsiyon ve ticari Cas9 ile oluşturulan sgRNAs ile tanıtılmaktadır. Yüksek Düzenleme verimliliği sınırlı zaman ve maliyet ile elde edilir.

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Burada, sağlıklı ve fonksiyonel birincil fare tetkikine yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Hepatik doğmakta olan protein sentezi tarafından radyoaktif olmayan etiketleme substrat algılamak için yönergeler protein sentezi karaciğer homeostazı enerji metabolizması bağlamında temel mekanizmaları anlamanıza yardımcı olmak için sağlanmıştır.

Birincil fare tetkikine yalıtım doğmakta olan Protein sentez analiz radyoaktif L-azidohomoalanine etiketleme yöntemi tarafından için

Burada sunulan verimli CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein aracılı gen düzenleme meme hücrelerinde tüp Elektroporasyon kullanarak bir protokoldür.

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Ribozom afinite saflaştırmanın (TRAP) çevirisi hücre tipine özgü translating mRNA'nın hızlı ve etkin bir şekilde izole edilmesini sağlar. Burada, karaciğer repopülasyonu ve TRAP bir fare modelinde hidrodinamik kuyruk-ven enjeksiyonu birleştiren bir yöntem göstermek hepatositlerin ifade profilini incelemek için.

Fare Karaciğerinde Hücre Tipine Özgü Gen Ekspresyonu Profiloluşturma

Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Bu protokol, in vitro olarak bir araya getirilen ve elektroporasyon yoluyla iletilen Cas9-sgRNA ribonükleoprotein kompleksleri kullanılarak fare kemik iliği türevi makrofajlarda genom düzenleme prosedürünü açıklar.

Elektropore Cas9-sgRNA Kompleksleri Kullanılarak Primer Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda Yüksek Verimli Gen Bozulması

Biyo-uyumlu pH duyarlı sol-jel nanosensors poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) electrospun iskeleleri katılabilecektir. Üretilen kendi-rapor iskeleleri iskelesi üzerinde hücrelerin kültürlenmesi iken microenvironmental durumların in situ izlenmesi için de kullanılabilir. 3D hücresel yapı deneyi bozmadan gerçek zamanlı olarak izlenebilir edildiğinden bu durum yararlıdır.

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Keşfedin, primer fare hepatositlerinde CRISPR-Cas9 gen düzenleme yöntemini. Elektroporasyon ile yüksek canlılıkta hücre elde ederek metabolik hastalık modelleri oluşturun ve gen tedavisi araştırmalarına katkı sağlayın.

Cas9 Ribonükleoproteinlerin ve mRNA'nın Yeni İzole Edilmiş Primer Fare Hepatositlerine Elektroporasyon Aracılı Verilmesi

Daha fazla video keşfet