Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitin İndüksiyonu ve Çeşitli Değerlendirme Göstergeleri

Bu protokol, miyelin oligodendrosit glikoprotein kullanılarak bir fare modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyelitin indüklenmesini ve klinik bir skorlama sistemi kullanılarak hastalık sürecinin izlenmesini açıklamaktadır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit ile ilişkili semptomlar, hastalık sürecini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için fare femur mikro-bilgisayarlı tomografi analizi ve açık alan testi kullanılarak analiz edilir.

Şu anda multipl skleroz için tam bir tedavi yoktur. Protokolümüz, multipl skleroz hastalığı tedavilerinin araştırılmasına yardımcı olmak için deneysel otoimmün ensefalomiyelit modelinin etkili bir şekilde oluşturulmasına izin verir. Protokolümüzün temel avantajı, deneysel otoimmün ensefalomiyelit tedavisinin çoklu perspektiflerden daha kapsamlı bir değerlendirmesidir.

İlk önce liyofilize peptidi ve steril önceden soğutulmuş PBS'yi kalsiyum ve magnezyum iyonları olmadan pH 7.4'te çözerek miyelin oligodendrosit glikoprotein peptid emülsiyonunu hazırlayın. Temiz iki mililitrelik mikro santrifüj tüpüne sterilize edilmiş beş milimetrelik bir çelik bilye ekleyin. Daha sonra, mililitre liyofilize mikrobakteri tüberkülozu başına beş miligram ve tüpe 500 mikrolitre miyelin oligodendrosit glikoprotein peptid emülsiyonu içeren 500 mikrolitre tam Freuds adjuvanını ekleyin.

Şimdi tüpü 10 dakika boyunca bir doku lizörü üzerinde salın. Daha sonra tüpleri buz üzerinde 10 dakika soğutun. Beyaz viskoz bir çözelti oluşana kadar işlemi dört kez tekrarlayın.

Daha sonra, boğmaca toksin sapı çözeltisini, 100 mikrolitre başına 200 nanogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için kalsiyum ve magnezyum iyonları olmadan pH 7.4'ün steril PBS'sinde 50 kez seyreltin. Başlangıçta hazırlanan tüm miyelin oligodendrosit glikoprotein peptid emülsiyonunu tüpün dibinde çökeltmek için, ekipman üzerindeki nabız düğmesine basarak tüpü iki ila üç saniye boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin. Miyelin oligodendrosit glikoprotein peptid emülsiyonunu, 22 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga ile aspire edin ve emülsiyonu yeni bir 1 mililitrelik şırınga variline aktarın.

Namluya 26 gauge'lik bir iğne takın ve bağlantıyı bir sızdırmazlık filmi ile sabitleyin. Bir farenin dorsal omurgasının her iki tarafına deri altından 100 mikrolitre miyelin oligodendrosit glikoprotein peptid emülsiyonu enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, cilt ve dorsum altındaki soğanlı kütlelerin otomatik oluşumunu gözlemleyin.

Daha sonra intraperitoneal olarak, aynı fareye 100 mikrolitre boğmaca toksini enjekte edin. Bir açık alan reaksiyon odası hazırlayın ve fare hareketini kaydetmek için bir video analiz sistemi kurun. Deneyden önce reaksiyon odasını temizlemek için, tüm alana% 70 etanol püskürtün ve temiz bir kağıt havluyla silin.

Daha sonra bir reaksiyon odasının köşesine bir fare yerleştirin. Çekime başlamak için, video kayıt sisteminin menü çubuğundaki yakalamayı başlat düğmesine tıklayın ve zamanı kaydedin. Test odasında sessizliği koruyarak, farenin beş dakika boyunca serbestçe hareket etmesine izin verin.

Ardından kaydı durdurun ve videoyu kaydedin. Fareyi tekrar kafesine koyun. Ardından test alanını% 70 etanol ile temizleyin ve bir sonraki fareye geçin.

Ötani faresini diseksiyon tepsisinde düz tutun ve ekstremiteleri sabitleyin. Arka ekstremite cildini forseps ile farede tutun ve cildi ve kasları makasla açın. Daha sonra, makası dikkatlice kullanarak femuru tibia ve kalça kemiğinden ayırın.

Femura yapışan kasları makasla çıkarın. Daha sonra femuru oda sıcaklığında% 70 etanol içine yerleştirin. Bu çalışmada, miyelin oligodendrosit glikoprotein kaynaklı peptidin EAE'yi indükleme yeteneği değerlendirilmiştir.

Peptit enjekte edilen fareler ilerleyici kilo kaybı yaşadı. Altı ila dokuz günlük enjeksiyondan sonra, 14 ila 16 gün sonra zirveye ulaşan EAE semptomları geliştirdiler. Açık alan testinden elde edilen iz grafikleri, EAE'nin farelerin normal keşif davranışını değiştirdiğini göstermiştir.

Normal farelerle karşılaştırıldığında, EAE'li fareler erken başlangıç, zirve ve remisyon aşamalarında önemli ölçüde daha az mesafe kat ettiler. EAE'li fareler ayrıca hastalığın tepe ve remisyon aşamalarında aktivite süresini önemli ölçüde azaltmıştır. Dahası, her üç aşamada da EAE fareleri, merkezde harcanan seyahat mesafesi ve zaman açısından önemli ölçüde daha azdı.

EAE farelerinden elde edilen femurların mikrobilgisayarlı tomografi taramaları, normal farelerden farklı bir trabeküler mimari ortaya çıkardı. EAE farelerinden elde edilen femurlar, normal farelerden önemli ölçüde daha az kemik mineral yoğunluğuna ve kemik hacmine doku hacmine oranına sahipti. Dahası, EAE'li farelerden elde edilen femurlar, normal farelerden daha az trabeküler bağlantı yoğunluğuna, trabeküler sayıya ve trabeküler kalınlığa sahipti.

Normal farelerle karşılaştırıldığında, EAE farelerde trabeküler aralık arttırıldı ve kortikal kemik kalınlığı azaltıldı. Ayrıca EAE farelerinin beynini ve omurga kodunu hastalığın zirvesinde izole edebilir ve grip sitometrisi ile bağışıklık hücrelerinin ve sitokinlerin üretimini analiz edebiliriz.