Name: Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kullanarak Tek Hücreli Mitokondriyal DNA Kopya Sayısını ve Heteroplazmiyi Ölçme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Öğrenin, dijital damlacık PCR kullanarak tek hücreli mitokondriyal DNA kopya sayısını ve heteroplazmi düzeylerini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, mitokondriyal fonksiyon ve mutasyonları çalışan araştırmacılar için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. L Bozhilova'ya damlacık üretimi PCR verilerinin istatistiksel analizi konusunda tavsiyeleriniz için teşekkür ederiz. Dr. H Zhang'a, Şekil 3C ve Şekil 4B'de veri üretmek için kullanılan oositleri sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Cambridge Üniversitesi Tıbbi Araştırma Konseyi Mitokondriyal Biyoloji Birimi'nde (MC_UU_00015 / 9) SPB tarafından yürütülmüş ve PFC (212219 / Z / 18 / Z) tarafından düzenlenen Wellcome Trust Principal Research Fellowship tarafından finanse edilmiştir.

<ol><li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+genome%3A+structure%2C+transcription%2C+translation+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li>
<li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+mammalian+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.</a> Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).</li>
<li>D'Erchia, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+mtDNA+abundance+from+exome+data+and+its+correlation+with+mitochondrial+transcription%2C+mass+and+respiratory+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity.</a> Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).</li>
<li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy%3A+implications+for+human+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li>
<li>Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+levels+of+wild-type+mitochondrial+DNA+maintain+cytochrome+c+oxidase+activity+for+two+pathogenic+mitochondrial+DNA+mutations+but+not+for+m.3243A--%3EG%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A-->G.</a> American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+mitochondrial+DNA+copy+number+in+urinary+cells+as+a+useful+marker+for+diagnosing+severity+of+the+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases.</a> PloS One. 8 (6), 67146(2013).</li>
<li>Filograna, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mtDNA+copy+number+ameliorates+the+pathological+consequences+of+a+heteroplasmic+mtDNA+mutation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse.</a> Science Advances. 5 (4), (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+of+mitochondrial+DNA+content+in+endometrial+adenocarcinoma+cells%3A+a+quantitative+study+using+laser-captured+microdissected+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues.</a> Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).</li>
<li>Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+threshold+expression+of+the+tRNA%28Lys%29+mutation+in+skeletal+muscle+of+patients+with+myoclonic+epilepsy+and+ragged-red+fibers+%28MERRF%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF).</a> American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).</li>
<li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics%3A+technologies+and+data+analysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li>
<li>Herbst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+quantitation+of+muscle+mitochondrial+DNA%3A+age%2C+fiber+type%2C+and+mutation-induced+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).</li>
<li>O'Hara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mitochondrial+DNA+copy+number+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution.</a> Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).</li>
<li>Diaz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mitochondrial+DNA+with+large+deletions+repopulates+organelles+faster+than+full-length+genomes+under+relaxed+copy+number+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).</li>
<li>Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+real-time+PCR+method+to+detect+and+quantify+mitochondrial+DNA+deletions+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells.</a> Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).</li>
<li>Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+mitochondrial+DNA+in+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis.</a> Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).</li>
<li>Perier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+mitochondrial+DNA+deletions+within+dopaminergic+neurons+triggers+neuroprotective+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms.</a> Brain. 136, Pt 8 2369-2378 (2013).</li>
<li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+%28second+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li>
<li>Cree, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reduction+of+mitochondrial+DNA+molecules+during+embryogenesis+explains+the+rapid+segregation+of+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes.</a> Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).</li>
<li>Belmonte, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+methods+improve+detection+sensitivity+and+measurement+precision+of+low+abundance+mtDNA+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions.</a> Scientific Reports. 6, 25186(2016).</li>
<li>Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+direct+repeats+cause+most+human+mtDNA+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Two direct repeats cause most human mtDNA deletions.</a> Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).</li>
<li>Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitochondrial+DNA+deletion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation.</a> Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).</li>
<li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+parallel+sequencing+of+the+genomes+and+transcriptomes+of+single+cells+using+G%26T-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).</li>
<li>Ludwig, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+in+humans+enabled+by+mitochondrial+mutations+and+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics.</a> Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+based+determination+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species.</a> Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).</li>
<li>Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+droplet+digital+PCR+to+analyze+allele-specific+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).</li>
<li>Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+single+cell+analysis+of+mitochondrial+heteroplasmy+in+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10821(2020).</li>
<li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dPCR%3A+A+Technology+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li>
<li>Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+loop-mediated+isothermal+amplification+on+a+commercial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane.</a> ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+microfluidic+devices+for+qualitative%2C+quantitative+and+digital+nucleic+acids+testing+at+point+of+care%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care.</a> Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952(2021).</li>
</ol>

Açıklanacak çıkar çatışması yok.

Burada açıklanan protokol, yukarıda tartışılanlara ek olarak çok çeşitli hücre tipleri ve türleri arasında uygulanabilir, ancak yeni tahlil tasarımlarının dikkatli optimizasyonu, daha önce doğrulanmış primer / prob kombinasyonlarından uzaklaşırken yöntemin doğruluğunun ve tekrarlanabilirliğinin korunmasını sağlamak için anahtar olacaktır. Tek hücrelerle çalışırken, elde edilen sonuçların tek tek hücrelerinkileri gerçekten yansıttığından emin olmak için numune toplamanın mümkün olduğunca doğru bir şekilde yapılmasını sağl...

Memeli mitokondriyal (mt) DNA'sı, iki rRNA, 22 tRNA ve 13 protein kodlayan gen 1'den oluşan 37 geni kodlayan mitokondriyal matriste bulunan küçük (yaklaşık 16.5 Kb), dairesel bir DNA genomudur. Hücre başına her genin bir (haploid) veya iki (diploid) kopyasını içeren nükleer genomun aksine, mtDNA, her hücrenin mitokondrisinde, onlarca kopyadan (örneğin, olgun spermatositler) yüz binlerce kopyaya (örneğin, oositler) kadar değişen çoklu kopyalarda bulunur2,3. Bu çok kopyalı doğanın bir sonucu, mtDNA genomundaki tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler), delesyonlar veya duplikasyonlar olarak var olabilen mutasyonların, herhangi bir hücrede değişen seviyelerde bulunabilmesidir ve hücrenin toplam mtDNA popülasyonunun% 0 ila% 100'ünü oluşturur. Aynı hücrede vahşi tip ve mutant mtDNA genomlarının varlığı heteroplazmi olarak adlandırılır ve patojenik heteroplazmik mtDNA mutasyonları, altta yatan heteroplazmik mtDNA mutasyonlarına bağlı birkaç yaygın nörolojik sendromla mitokondriyal hastalığın önemli bir nedenidir4.
Klinik hastalığa neden olan heteroplazmik mtDNA mutasyonu olasılığına katkıda bulunan iki anahtar parametre, heteroplazmi seviyesi ve mtDNA kopya sayısıdır. Birçok heteroplazmik mutasyon bir eşik etkisi gösterir, biyokimyasal ve klinik fenotipler sadece belirli bir heteroplazmi seviyesinin üzerinde, tipik olarak% 80 civarında5 belirginleşir ve daha sonra heteroplazmi daha da arttıkça kötüleşir4. Bununla birlikte, hücrede bulunan mtDNA'nın kopyalarının sayısını da dikkate almak önemlidir, çünkü bu, belirli bir heteroplazmi seviyesinde bulunan vahşi tip (yani 'sağlıklı') mtDNA genomlarının sayısını etkileyecektir. Mitokondriyal hastalık hastalarında yapılan çalışmalar, heteroplazmi ile kopya sayısı5,6 arasındaki bu etkileşimin önemini vurgulamıştır ve Filograna ve ark. yakın zamanda, mitokondriyal hastalığın bir fare modelinde değişmemiş heteroplazmiye rağmen semptomları hafifleten mtDNA kopya sayısında bir artış olduğunu bildirmiştir7.
Son yıllarda mtDNA heteroplazmisinin neden olduğu hastalıkların patogenezi ve iletiminin anlaşılmasını geliştirmek için çok şey yapılmış olsa da, bu çalışmanın çoğu, ortalama doku heteroplazmi seviyelerini ve toplu doku biyopsilerinden ve kan örneklerinden elde edilen kopya sayısı ölçümlerini karşılaştırarak, hücrelerden ziyade dokular düzeyinde gerçekleştirilmiştir. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu gibi bazı köklü teknikler, hücresel düzeyde bu tür ölçümlere izin verir 8,9; Bununla birlikte, yüksek verimli tek hücreli analiz yöntemlerinin veya "Tek Hücreli Omics"10 olarak adlandırılan son patlaması, bu önemli mtDNA parametrelerini tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçebilen yöntemler için bir gereklilik yaratmıştır.
Damlacık üretimi PCR yöntemi, örnek DNA11'deki spesifik hedef amplikonların PCR amplifikasyonu yoluyla bilinmeyen DNA konsantrasyonlarını ölçmek için mevcut yöntemleri geliştirmek için mikroakışkan teknolojisindeki son gelişmelerden yararlanır. Numune DNA'sının tek bir reaksiyonda güçlendirildiği qPCR'den farklı olarak, PCR ürününün göreceli birikim hızı okuma görevi görür, bu yöntem ilk numuneyi binlerce bireysel damlacığa böler, böylece numune DNA moleküllerini mekansal olarak ayrı reaksiyonlara bölümlere ayırır12. Sonraki PCR reaksiyonu her bir damlacıkta ilerler, PCR ürünü sadece hedef DNA'yı içeren damlacıklarda birikir. Bu reaksiyonun sonucu, hedef DNA'nın ve güçlendirilmiş PCR ürününün bir kopyasını içeren veya hedef DNA içermeyen bir damlacık havuzu şeklinde dijital bir çıktıdır. Floresan DNA probları veya çift sarmallı (ds) DNA bağlayıcı boya kullanılarak, güçlendirilmiş ürün içeren damlacıklar sayılabilir ve ilk numunede bulunan DNA kopyalarının mutlak sayısını hesaplamak için 'pozitif' ila 'negatif' damlacıkların oranı kullanılabilir. Bu mutlak ölçüm, bir qPCR reaksiyonundan elde edilen bağıl ölçümün aksine, bu metodolojinin tek hücrelerde mtDNA kopya sayısının ve heteroplazminin doğru ölçümü için kullanılmasına izin veren anahtar faktördür11 ve son zamanlarda yapılan birkaç çalışmada damlacık üretimi PCR teknolojisi bu amaçla kullanılmıştır13,14 . Bu makalede, hem insan hem de fare dokusundan tek hücrelerde mtDNA kopya sayısını ve delesyon heteroplazmisini ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır.

<table><tbody><tr><td>%50 Tween-20 solüsyonu</td><td>Novex</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik damlacık üreten yağ&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864110</td><td>Yağ/damlacık emülsiyonunu oluşturmak için kullanılan ticari yağ formülasyonu (Protokol Adım 4.1'de kullanılır)</td></tr><tr><td>Derin kuyu bloğuna sahip C1000 PCR makinesi</td><td>Hücre</td><td></td><td>lizisi (Protokol Adım 2.1.2.) ve PCR döngüsü (Protokol Adım 5) için kullanılan, derin kuyu ısıtma bloğu ile donatılmış Bio Rad 1851197 PCR termodöngüleyici</td></tr> <tr><td>Toplama plakası soğutma bloğu</td><td>Bio Rad</td><td>12002819</td><td>Damlacık oluşumu sırasında numuneleri soğuk tutan soğutma bloğu (Protokol adımı 4.3'te kullanılır)</td></tr> <tr><td>ddPCR 96 oyuklu plakalar&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>12001925</td><td>QX200 AutoDG damlacık üretecinde kullanılmak üzere tasarlanmış, numune hazırlama (Protokol adım 3.4) ve damlacık toplama (Protokol adım 4.3) için kullanılan 96 kuyucuklu plakalı pipet uçları,</td></tr> <tr><td>ddPCR damlacık okuyucu yağı&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1863004</td><td>Damlacık okuyucu tarafından kullanılan ticari yağ formülasyonu (Protokol adımı 6.1'de kullanılır)</td></tr> <tr><td>Problar için ddPCR Süper Karışımı (dUTP yok)</td> <td>Bio Rad</td><td>1863023</td><td>Probları kullanan ddPCR deneylerinde kullanım için ticari süper karışım (Protokol Adım 3.3'te kullanılır)</td></tr> <tr><td>DG32 otomatik damlacık üreteci kartuşları&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864108</td><td>Yağ/damlacık emülsiyonunu oluşturmak için QX200 AutoDG damlacık üretecinde kullanılan mikroakışkan kartuşlar (Protokol Adım 4.3'te kullanılır)</td></tr> <tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Nitelikli fetal sığır serumu</td></tr><tr><td>Folyo plaka kapakları&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1814040</td><td>Damlacık oluşumundan sonra damlacık toplama plakalarını kapatmak için kullanılan folyo plaka kapakları (Protokol adımı 4.6'da kullanılır)</td></tr> <tr><td>HEK 293T hücreleri</td><td>Takara</td><td>632180</td><td>SV40 Large-T antijeni HeLa hücrelerini eksprese eden dönüştürülmüş insan embriyonik böbrek hücre hattının ticari alt klonu HEK 293</td></tr><tr><td></td><td>ECACC</td><td>93021013</td><td>İnsan serviks epiteloid karsinom hücreleri</td></tr><tr><td>Yüksek glikozlu DMEM</td><td>Gibco</td><td>13345364</td><td>4.5 g / L D-Glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat ile</td></tr><tr><td>İnsan cybrids</td><td>Miami Üniversitesi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fare embriyonik fibroblastları&nbsp;</td><td>Newcastle Üniversitesi</td><td>C57Bl/6 farelerden</td><td></td>ölümsüzleştirildi</tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>PCR plaka contaları</td><td>Pierce</td><td>SP-0027</td><td>Şeffaf yapışkan plaka contaları, yalnızca damlacık üretimi öncesi kullanılır (adım 4.6'da folyo conta kullanılmalıdır)</td></tr> <tr><td>Pipet Ucu Atık Kutuları</td><td>Bio Rad</td><td>1864125</td><td>QX200 AutoDG damlacık üretecinde atılan uçları toplamak için kullanılan tek kullanımlık toplama kutusu (Protokol adımı 4.3'te kullanılır)</td></tr><tr><td>AutoDG sistemi için pipet uçları&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864120</td><td>QX200 AutoDG damlacık üretecinde kullanılmak üzere tasarlanmış filtreli pipet uçları (Protokol adımı 4.3'te kullanılır)</td></tr> <tr><td>Birincil insan dermal fibroblast hücreleri</td><td>Newcastle Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primerler/Problar</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Tam primer/prob dizileri teste bağlı olacaktır. Bu çalışmada kullanılan primerler ve problar Tablo 1'de verilmiştir</td></tr><tr><td>Proteinaz K 20 mg/mL çözeltisi</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR plaka kapatıcı</td><td>Bio Rad</td><td>1814000</td><td>Damlacık oluşumundan sonra ddPCR numune plakalarına folyo contalar uygular (Protokol Adım 4.6'da kullanılır)</td></tr> <tr><td>QX Manager yazılımı</td><td>Bio Rad</td><td>12012172</td><td>Damlacık okuyucu kurulum ve analiz yazılımı (Protokol Adımları 6 ve 7'de kullanılır)</td></tr><tr><td>QX200 AutoDG damlacık üreteci</td><td>Bio Rad</td><td>1864101</td><td>Otomatik mikroakışkan damlacık üreteci (Protokol Adım 4'te kullanılır)</td></tr><tr><td>QX200 damlacık okuyucu</td><td>Bio Rad</td><td>1864003</td><td>Damlacık okuyucu (Protokol Adım 6'da kullanılır)</td></tr><tr><td>Trizma önceden ayarlanmış kristaller pH 8.3</td><td>Sigma</td><td>T8943-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak tek hücreli mitokondriyal dna kopya sayısını ve heteroplazmiyi Ölçme

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Memeli mitokondriyal (mt) DNA'sı, elektron taşıma zincirinin 13 alt birimini kodlayan küçük, dairesel, çift sarmallı, mitokondriyal bir DNA molekülüdür. Diploid nükleer genomun aksine, çoğu hücre, hücre tipine bağlı olarak 100'den az ila 200.000'den fazla kopya arasında değişen mtDNA'nın çok daha fazla kopyasını içerir. MtDNA kopya sayısı, yaşa bağlı bir dizi dejeneratif durum ve hastalık için bir biyobelirteç olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır ve bu nedenle, mtDNA kopya sayısının doğru ölçümü hem araştırma hem de teşhis ortamlarında önemli bir araç haline gelmektedir. Genellikle tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler) veya delesyonlar olarak ortaya çıkan mtDNA'daki mutasyonlar, hücre içindeki mtDNA'nın tüm kopyalarında (homoplazmi olarak adlandırılır) veya mutasyona uğramış ve WT mtDNA kopyalarının (heteroplazmi olarak adlandırılır) bir karışımı olarak bulunabilir. Heteroplazmik mtDNA mutasyonları, nadir hastalıklarda veya Parkinson hastalığı gibi giderek artan sayıda yaygın geç başlangıçlı hastalıkta klinik mitokondriyal patolojinin önemli bir nedenidir. Hücrelerde bulunan heteroplazmi seviyesinin belirlenmesi, nadir görülen mitokondriyal hastalıkların tanısında ve mitokondrinin rol oynayabileceği yaygın geç başlangıçlı bozuklukları anlamayı amaçlayan araştırmalarda kritik bir adımdır. MtDNA kopya sayısı ve heteroplazmi geleneksel olarak kantitatif (q) PCR tabanlı testler veya derin dizileme ile ölçülmüştür. Bununla birlikte, ddPCR teknolojisinin yakın zamanda tanıtılması, her iki parametreyi ölçmek için alternatif bir yöntem sağlamıştır. Mutlak mtDNA kopya sayısını ölçme yeteneği ve düşük kopya sayılarında bile tek hücrelerden doğru ölçümler yapmak için yeterli hassasiyet de dahil olmak üzere mevcut yöntemlere göre çeşitli avantajlar sunar. Burada, ddPCR kullanılarak tek hücrelerde mtDNA kopya sayısının ölçümünü açıklayan ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır, bundan böyle damlacık üretimi PCR olarak adlandırılacaktır ve mtDNA delesyonlu hücrelerde heteroplazmilerin eşzamanlı olarak ölçülmesi seçeneği sunulmaktadır. Bu yöntemin mtDNA SNP'li hücrelerde heteroplazmiyi ölçmek için genişletilmesi olasılığı da tartışılmaktadır.

Damlacık oluşumunu takiben, her bir kuyucuktaki yağ fazının üstünde yüzen şeffaf bir opak damlacık tabakası görülebilir (Şekil 1B). Damlacık oluşumu, tek hücreler üzerinde deneyler yapılırken giriş lizatındaki deterjanların varlığından olumsuz etkilenebilir. 2.1.2.'de açıklanan lizis protokolü kullanılarak, son numunede küçük bir kalıntı miktarda TWEEN-20 bulunmasına rağmen, önerilen 10.000 seviyesinin üzerindeki damlacık verimleri rutin olarak elde edilir (Şekil 1C</str...

Burada, tek hücrelerde mutlak mitokondriyal (mt) DNA kopya sayısını ve mtDNA delesyon heteroplazmi seviyelerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kullanarak Tek Hücreli Mitokondriyal DNA Kopya Sayısını ve Heteroplazmiyi Ölçme

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

Bu protokol, bireysel hücrelerde bulunan mitokondriyal DNA'nın kopyalarının sayısını ve belirli mitokondriyal DNA mutasyon tiplerinin seviyesini doğru bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Önceki yöntemler, bu ölçümleri birçok hücre içeren doku örneklerinde doğru bir şekilde yapabilir. Bu tekniğin temel avantajı, aynı ölçümleri tek hücrelerde yapabilmemizdir.Bu yöntem özellikle mitokondri üzerinde çalışanlar için kullanışlıdır ve bu alanda geniş uygulamalara sahip olacaktır. Tek hücrelerin etkili izolasyonu ve lizisi bu tekniğin anahtarıdır. Tek hücre sıralama ile ilgili önceki deneyim çok yardımcı olacaktır.Başlamak için, metinde açıklandığı gibi, buz üzerinde örnek DNA olmadan PCR için ana karışımı hazırlayın. Vorteksten kısa bir süre sonra, hazırlanan ana karışımın gerekli hacmini, damlacık üretimi PCR 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna dağıtın ve numuneleri tam sütunlar halinde düzenleyin. Ardından, ana karışımı şablon dışı denetimler olarak kullanmak için tamamlanmamış sütunlardaki boş kuyucuklara ekleyin.Ardından, her bir kuyucuğun toplam hacmini 22 mikrolitre yapmak için giriş DNA'sını her bir kuyucuğa ekleyin. Plakayı yapışkan bir plaka contasıyla kapatın ve bir dakika boyunca 2000 RPM'de bir çalkalayıcıya yerleştirin. Daha sonra plakayı buzun üzerine koymadan önce dört santigrat derecede bir dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüj yapın.Damlacık üretimi için, önce damlacık jeneratörünün açık olduğundan emin olun ve alet güvertesinin E konumuna bir şişe damlacık üreten yağ yüklenip yüklenmediğini kontrol edin. Ardından dokunmatik ekranda Örnek Plakayı Yapılandır'ı tıklayın. Numuneleri veya boşlukları içeren numune plakasındaki tüm sütunları seçtikten sonra, plaka konfigürasyonunu onaylamak için Tamam'a tıklayın.Ardından, damlacık jeneratörü kartuşlarını enstrüman güvertesinde B konumuna yerleştirin, böylece tüm ışıklar yeşile döner ve boş bir uç atık oluğunu C konumuna yerleştirin. Ardından, numune plakasını alet güvertesinin F konumuna yerleştirmeden önce yapışkan contayı çıkarın, böylece ışık yeşile döner. Ayrıca, ışığın yeşile dönmesi için G konumunda, eksi 20 santigrat derecede önceden soğutulmuş, serin bir bloğa yerleştirilmiş boş bir damlacık toplama 96 delikli plaka yükleyin.Cihazın dokunmatik ekranında Damlacık Oluşturmayı Başlat'a tıkladığınızda damlacık jeneratörü kapağı otomatik olarak kapanır. Damlacık üretimi tamamlandıktan sonra, her bir kuyucukta yağ fazının üzerinde bir damlacık emülsiyon tabakasının bulunduğunu doğrulamak için numune toplama plakasını görsel olarak kontrol edin. Ardından, plaka kapatıcıyı açın ve sıcaklığı 180 santigrat dereceye ayarlayın ve kapatma süresini beş saniyeye ayarlayın.Makinenin çalışma sıcaklığına ulaşmasına izin verin. Daha sonra numune toplama plakasını plaka kapatıcının plaka tutucusuna yerleştirin ve plakanın üstüne kırmızı çizgi yukarı bakacak şekilde taze bir folyo conta yerleştirin. Plaka sızdırmazlık elemanı çalışma sıcaklığına ulaştığında, cihazın dokunmatik ekranında çıkarma düğmesine basın.Plaka tutucuyu plaka kapatıcının çekmecesine yerleştirdikten sonra, çekmeceyi kapatmak için contaya basın. Sızdırmazlık tamamlandığında, çekmece otomatik olarak açılacaktır. Sızdırmaz plakayı çıkarın ve soğuk bloğun üzerine yerleştirin.Ardından plaka kapatıcıyı kapatın. PCR'yi çalıştırmak için, kapalı damlacık toplama plakasını 96 derin kuyucuklu bir bloğa sahip bir PCR makinesine yerleştirin. PCR tamamlandıktan sonra, damlacık okuyucuyu ve bağlı bilgisayarı açın.PCR sonrası numunelerle plakayı damlacık okuyucu plaka tutucusuna yükleyin. Folyo kapağını numune plakasında tutarken, kapağı tutucunun üstüne yerleştirin ve siyah kilitleme klipsleriyle yerine sabitleyin. Ardından, damlacık okuyucu kapağını açmak için aç/kapat düğmesine basın.Ardından, damlacık okuyucu plakası tutucusunu numune plakasıyla birlikte okuyucu odasına yükleyin ve manyetik tabana güvenli bir şekilde yerleştirin. Kapağı kapatmak için aç/kapat düğmesine tekrar basın. Analiz yazılımı arayüzünü açın.Plaka Ekle sekmesini seçin, Plaka Ekle'yi tıklatın ve ardından Plakayı Yapılandır'ı tıklatın. Plaka Bilgileri sekmesinde bir plaka adı girin, Supermix Açılır menüsünden Problar için Supermix, DUTP Yok'u seçin ve Kuyu Seçimi sekmesindeki Veri Dosyasını Kaydet As.In altına bir dosya adı girin, analiz edilecek kuyuları vurgulayın ve Seçilen Kuyuları Dahil Et'i tıklatın. Ardından, Kuyu Bilgileri sekmesinde, açıklama eklenecek kuyuları seçin.Deneme Türü açılır menüsünden Doğrudan Nicelik'i seçin. Ardından örnek açıklamasını, örnek türünü ve hedef adı kutularını doldurun ve gerektiğinde iyi notlar ve/veya plaka notları ekleyin. Ardından Uygula'yı tıklayın.Plaka yapılandırması tamamlandıktan sonra, Çalıştırmayı Başlat'ı tıklatın. Sonuç analizi için, Veri Analizi sekmesini seçin ve analiz edilecek dosyayı Veri Dosyalarım menüsünden açın. Ardından, tek renkli denemeler için 1B Genlik sekmesini veya iki renkli denemeler için 2B Genlik sekmesini tıklatın.Ardından, eşik gerektiren kuyuları seçin. Genlik grafiğindeki pozitif ve negatif popülasyonlar arasındaki boş alana eşiği manuel olarak uygulamak için Eşik Çizgisi Modu aracını kullanın ve artı işaretinin dört damlacık popülasyonunun açıkça ayrılacağı şekilde yerleştirilmesini sağlayın. Eşik tüm örnekler için uygulandıktan sonra, Veri Tablosu sekmesi, İçe/Dışa Aktar'a tıklayıp Görünür Verileri CSV'ye Aktar'ı seçerek sonuçları daha fazla analiz için csv dosyası olarak dışa aktarın.Uygun bir dosya adı girin ve Kaydet'i tıklatın. Bu protokolde kullanılan PCR ve damlacık okuma prosedürleri, hem fam hem de hex kanallarında açıkça ayrılmış pozitif ve negatif damlacık popülasyonlarının varlığını göstermiştir. Her iki prob için pozitif olan mitokondriyal DNA popülasyonları, tek hücreli lizatlardan da ayırt edilebilir.Bu yöntem aynı zamanda mitokondriyal DNA'da delesyonları olan örnekler için, DNA'nın sadece silinmemiş kısmı için pozitif olan çift pozitif damlacıklar ve damlacıklardan oluşan karışık bir popülasyonun mevcut olduğunu göstermiştir. Bu yöntem, fare oositleri ve birincil fare embriyonik hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli memeli hücrelerinde hücre başına mitokondriyal DNA kopya sayısını saymak için başarıyla kullanılmıştır. Ayrıca, yüksek delesyon heteroplazmisine sahip hücrelerde, tek bir prob için pozitif olan popülasyonun, çift pozitif popülasyondan anlamlı derecede daha büyük olduğu bulunmuştur.Bununla birlikte, düşük delesyonlu heteroplazmiye sahip hücrelerde, her iki popülasyon da benzer büyüklükteydi. Bu nedenle doğru sonuçlar her zaman damlacık üretiminin başarılı olmasını ve eşiklemenin 1D veya 2D genlik görünümü kullanılarak uygun şekilde uygulanmasını sağlar. Kullanılmayan lizat, tek nükleotid polimorfizm heteroplazmını ölçebilen pirosekanslama gibi diğer tek hücreli testler için kullanılabilir.Bu tekniğin geliştirilmesi, mitokondriyal DNA kopya sayısının doğru ölçümlerini yapmamıza ve daha önce mümkün olmayan bireysel hücrelerde delesyon heteroplazmisini yapmamıza izin verdi.

measuring-single-cell-mitochondrial-dna-copy-number-heteroplasmy

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, dijital polimeraz zincir reaksiyonu veya dPCR ile hedef nükleik asitleri tespit etmek için emülsifiye edilmiş nano damlacıklar oluşturmak için adım adım bir prosedür sunuyoruz.

Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Nadir Tümör Mutasyonlarını Tespit Etmek için Nanodamlacık PCR Reaksiyonları Oluşturmak İçin Bir Yöntem

Bu videoda, iki farklı genetik belirteci aynı anda tespit etmede yararlı olan geleneksel PCR tekniğinin bir modifikasyonu olan çift yönlü dijital PCR (ddPCR) tekniğini gösteriyoruz. Tek bir PCR reaksiyonu, bağımsız olarak amplifiye edilen nanolitre boyutunda emülsifiye edilmiş damlacıklara bölünür ve hedef dizilerin başlangıç konsantrasyonunu hesaplamak için damlacıkların fraksiyonundan farklı renkli floresan amplifikasyon sinyallerinin tespiti kullanılır.

Çift genetik belirteçlerin eş zamanlı olarak ölçülmesi için dubleks dijital PCR

Bu video, klinik tanı ve prognoz için erken bir biyobelirteç olarak farklı beyaz kan hücresi popülasyonlarında metillenmiş DNA bölgelerinin eş zamanlı olarak ölçülmesi için multipleks damlacık polimeraz zincir reaksiyonu tekniğini göstermektedir.

Lökositlerde DNA Metilasyonunu Tespit Etmek için Multipleks Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Boya bazlı bir kimya ve damlacık dijital PCR teknolojisi kullanılarak hücresiz mikroRNA'ların miktar tayini için hassas ve doğru bir yöntem açıklanmaktadır.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Burada tarif biz aynı anda quantitate için müsait bir yöntem ve genomik DNA'ın enzimatik bölünme onun alkalin hidroliz ve sonraki 5´ uç ile birleştirerek tek nükleotid çözünürlükte son derece sağlam DNA genom geniş harita ribonucleotides sıralama.

Eş zamanlı haritalama ve Nefelometri Ribonucleotides insan mitokondriyal DNA'ın

Burada, mitokondriyal DNA (mtDNA) metilasyon doğru miktar bir iletişim kuralını mevcut. Bu protokol için bir enzimatik sindirim DNA BamHI tahmindi mtDNA metilasyon düzeyi mtDNA ikincil yapı tarafından neden önlemek için kullanılan bioinformatic analiz boru hattı ile birleştiğinde ile açıklanmaktadır.

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Burada, doğru bir şekilde birden fazla genetik değişiklikler hedef bölge teslim ddPCR ve hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak tek bir tepki olarak ölçmek için bir protokol mevcut.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Epigenetik belirteçler beyaz kan hücresi (WBC) DNA metilasyon desenleri nicelik selektib yoluyla subtyping için kullanılır. Bu protokol, WBC diferansiyel sayımlarının hassas ve çok katlı metilasyona özgü hedef nicelemesine olanak sağlayan damlacık üretimi için termoplastik elastomer (TPE) tabanlı mikroakışkan bir cihaz kullanılarak çok katlı damlacık polimeraz zincir reaksiyonu (mdPCR) yöntemi ni sunar.

Hematolojik Tanı için Polimer Damlacık Jeneratör Cihazı ile Metilasyona Özgü Multipleks Damlacık PCR

Pirosekans testleri, heteroplazmik hücrelerde veya dokularda mitokondriyal DNA tek nükleotid polimorfizmlerinin sağlam ve hızlı genotiplendirilmesini sağlar.

Mitokondriyal Genomdaki Tek Nükleotid Polimorfizmlerinin Pirosequencing ile Genotiplenmesi

mtDNA sentezini ve dağılımını tespit etmek ve ölçmek için çok kuyucuklu bir plaka formatı ve otomatik immünofloresan görüntüleme kullanarak hücrelerdeki mitokondriyal DNA (mtDNA) metabolizmasının dinamiklerini incelemek için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu, çeşitli inhibitörlerin, hücresel streslerin ve gen susturmanın mtDNA metabolizması üzerindeki etkilerini araştırmak için de kullanılabilir.

Mitokondriyal DNA Sentezi ve Dağılımının Yüksek Verimli Görüntü Tabanlı Nicelleştirilmesi

Bu çalışma, toprak mikrobiyal biyokütlesi ve mantar-bakteriyel oranlarının nicelendirilmesi için hızlı bir ddPCR yöntemi sunmaktadır. ddPCR kaynaklı mikrobiyal biyokütle karbonu, kloroform fumigasyon tahminleriyle yalnızca zayıf korelasyon gösterse de, yöntem ek toprak örnekleme veya sert yöntem kullanmadan mikrobiyal bolluğu değerlendirmek için hassas ve ölçeklenebilir bir moleküler yaklaşım sunar.

Dijital Damla PCR (ddPCR) kullanılarak toprakta Mikrobiyal Biyokütlenin Belirlenmesi

Öğrenin, dijital damlacık PCR kullanarak tek hücreli mitokondriyal DNA kopya sayısını ve heteroplazmi düzeylerini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, mitokondriyal fonksiyon ve mutasyonları çalışan araştırmacılar için değerlidir.

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kullanarak Tek Hücreli Mitokondriyal DNA Kopya Sayısını ve Heteroplazmiyi Ölçme

Daha fazla video keşfet