Name: Oligonükleotidlerin Kimyasal Trifosforilasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Öğrenin, salisil fosforokloridit ve pirofosfat kullanarak oligonükleotidlerin 5'-trifosforilasyonu için sağlam bir kimyasal yöntemi. Bu protokol, RNA, DNA ve L-RNA dahil çeşitli türlerde trifosforile oligonükleotid sentezi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Greg Springsteen, Natasha Paul, Charles Olea, Jr., Jonathan Sczepanski ve Katrina Tjhung'a kimyasal trifosforilasyon reaksiyonları için en iyi uygulamalar hakkında yararlı tartışmalar için ve Gerald Joyce'a yararlı yorumlar için minnettardır. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı'ndan MCB 2114588 tarafından desteklenmiştir.

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Burada açıklanan trifosforilasyon prosedürü, standart fosforamid kimyası kullanılarak oligonükleotid sentezi ile geniş ölçüde uyumludur. Nükleozid fosforamiditler, fosfit üzerindeki standart β-siyanoetil ve nükleobazların ekzosiklik aminleri üzerindeki izobütiril, dimetilformamidil, asetil, fenoksiasetil veya 4-izopropilfenoksiasetil grupları dahil olmak üzere AMA39'da hızlı deproteksiyonla uyumlu baz-kararsız koruma gruplarına sahip olmalıdır. Riboz 2'-hidroksil grupları, t-bütildimetilsilil (TBDMS) veya tri-izo-propilsililoksimetil (TOM)40,41 silil koruyucu gruplar tarafından korunmalıdır. Baz kararsız pivaloyloxymethyl (PivOM) grubunun da kimyasal trifosforilasyon30 ile uyumlu olduğu bildirilmiştir.
Sentetik oligonükleotidlerin kimyasal trifosforilasyonu için birçok yöntem tanımlanmıştır 28,29,30,31,32,33,34,35. Ludwig-Eckstein reaktifi37'yi kullanan trifosforilasyonun, reaktiflerin özel sentezi ve özel ekipman gerektirmeyen, en erişilebilir olanlardan biri olduğunu bulduk. Bu yöntemle hazırlanan oligonükleotid 5′-trifosfatlar, bu "ayna görüntüsü" nükleik asidinin şablona bağımlı sentezini ve replikasyonunu elde etmek için enzimatik olarak erişilemeyen L-RNA oligonükleotid trifosfatlarının kullanımı da dahil olmak üzere, RNA ligaz ribozimleri için substratlar olarak rutin olarak kullanılmıştır 14,16,17,18 . Yöntem ayrıca, omurgalılarda doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin güçlü aktivatörleri olan küçük 5'-trifosforile kök döngü RNA'larının hazırlanması için de uygundur 6,7.
Ludwig-Eckstein reaktifi, salisil fosforokloridit37, suya karşı oldukça reaktiftir ve oligonükleotid kolonuna yüklenmeden önce reaktifi çözerken ortaya çıkan suyu etkili bir şekilde temizler. Bununla birlikte, bu noktadan sonra, 5'-fosfitylatlı oligonükleotid, pirofosfat üzerinden sisteme sokulan herhangi bir su ile tercihen reaksiyona girecek ve 28,37,38 çalışmasından sonra 5'-H-fosfonat yan ürünü oluşturacaktır. Trifosforilasyon reaktiflerinin ve trifosforilasyon reaksiyon odasının dikkatli bir şekilde hazırlanması, bu yan ürünün oluşmamasını sağlar. Solvent kurutma için, tip 4 şmoleküler elekler, çoğu oligonükleotid sentez reaktif şirketi tarafından çeşitli marka adları altında çoğu organik çözücüyle uyumlu Teflon torbalarda önceden paketlenmiş olarak satılmaktadır. Susuz bir atmosfer altında bir torpido gözünde trifosforilasyon yapmak gibi ek önlemler genellikle gerekli değildir.
5'-fosfitlenmiş oligonükleotidin TBAP ile reaksiyonu, siklik bir 5'-trimetafosfit ara maddesi oluşturur ve daha sonra oligonükleotid sentez oksitleyici çözeltisi (su / piridin / THF'deki iyot) kullanılarak siklik 5'-trimetafosfata oksitlenir. Ticari oksitleyici çözeltilerin değişen miktarlarda iyot kullandığı ve trifosfata tam oksidasyon sağlamak için yüksek 0.1 M iyot konsantrasyonunun kullanılması esastır. Döngüsel ürün, aynı çözelti37'deki nihai lineer 5′-trifosfata hidrolize edilir ve su dışındaki nükleofiller ile doğrusallaştırma isteniyorsa alternatif susuz oksitleyici çözeltiler kullanılmalıdır (uygulamalar için aşağıya bakınız)33. Bununla birlikte, herhangi bir kalıntı siklik trimetafosfat, oligonükleotidin müteakip alkali deproteksiyonu sırasında doğrusallaştırılacaktır. Döngüsel 5′-trimetafosfatın hidrolizi, dallanmış trifosfat37,46 yerine sadece doğrusal olanı verir.
Oligonükleotid deproteksiyonunun tipik olarak 5'-trifosforilasyonu barındıracak şekilde değiştirilmesi gerekmez, ancak birkaç önlem alınmalıdır. Trifosfat, alkali koşullara kısa süre maruz kalmak için nispeten kararlıdır, ancak trifosfatın AMA'ya gerekenden daha uzun süre maruz kalmamasına dikkat edilmelidir. Amonyak veya AMA'da 65 ° C'de 10 dakikadan fazla uzun süreli tedavi gerektiren grupların korunmasından kaçınılmalıdır. Oda sıcaklığında amonyakta 2 saat gibi daha nazik tedaviler, diğer fosforamid koruma gruplarıyla uyumlu olduğunda kabul edilebilir. Silil korumalı sentetik RNA oligonükleotidler için yaygın, hızlı bir deproteksiyon yöntemi, trietilamin trihidroflorür ve yüksek sıcaklık47 kullanır; Bununla birlikte, RNA 5′-trifosfatları hazırlarken bundan kaçınılmalıdır, çünkü uzun süreli asidik koşulların trifosfat hidrolizini hızlandırdığı bulunmuştur31,32.
Preparatif PAGE'in 5′-trifosforile oligonükleotidlerin postdeproteksiyonu için en basit ve en güvenilir yöntem olduğu kanıtlanmıştır (Şekil 3 ve Şekil 4). Bununla birlikte, hazırlayıcı ters fazlı HPLC, trifosforile edilmiş ürünleri saflaştırmak için de kullanılabilir. 5′-difosfat ve daha az ölçüde 5′-monofosfat ürünlerinin varlığı, kütle spektrometrisi ile trifosforilasyonu doğrularken rutin olarak gözlenir. Kütle spektrometresi sırasında, özellikle cihaz oligonükleotidlerin analizi için optimize edilmemişse, kimyasal sentez veya transkripsiyon ile hazırlanan oldukça saf malzemeden 5'-trifosfat parçalanmasını gözlemledik. Bununla birlikte, RP-LC analizi genellikle 5'-difosfat yan ürünün% 10-20'sinin daha uzun 5'-trifosforile oligonükleotidlerde bulunduğunu göstermektedir (Şekil 4). Tributylammonium pirofosfatın ticari preparatları,% 20'ye kadar monofosfat ile kontamine olabilir, bu da trifosforilasyon sırasında bir yan ürün olarak 5'-difosfat verir30,31. Bu reaktifin şirket içinde dikkatli bir şekilde hazırlanması, çok daha saf TBAP stokları sağlayabilir31. Bununla birlikte, ticari TBAP kaynakları kullanılarak trifosforile edilen oligonükleotidlerin, enzimatik reaksiyonlarda substrat olarak kullanıldığında hala karşılaştırılabilir veya daha fazla reaktivite gösterdiğini bulmuştuk (Şekil 5B), in vitro transkripsiyon ile hazırlanan materyale kıyasla.
Ludwig-Eckstein reaktifi ile oligonükleotid trifosforilasyonunun dikkate değer bir başka kullanımı, siklik trimetafosfit aramaddesi 33'ten yararlanır. Sonraki oksidasyon adımı, genellikle susuz koşullar altında oligonükleotid oksidasyonu için kullanılan hekzanlarda 1 M t-bütil peroksit ile gerçekleştirilirse, fosfitin oksidasyonu, halka açma hidrolizi olmadan gerçekleşir ve siklik trimetafosfat verir. Bu ara ürün daha sonra primer amin veya alkol nükleofilleri ile reaksiyona sokularak γ-fosfatta modifikasyonlarla 5'-trifosfat elde edilebilir. Bu modifikasyonlar, RP-LC ile hızlı trifosfata özgü saflaştırmayı kolaylaştıran bir fosforamid bağı ile bağlanmış bir lipofilik etiketin eklenmesini ve ardından etiketin trifosfat33'ten asidik hidrolizini içerir. γ-fosfat pozisyonundaki floresan modifikasyonları, ribozim-katalizörlü ligasyon reaksiyonları için gerçek zamanlı floresan muhabirleri olarak kullanılmak üzere de tanıtılabilir15,33.

RNA'nın 5'-trifosforile formu, yaşamın tüm alanlarında RNA transkripsiyonu ve birçok RNA virüsünün yaşam döngüsü boyunca RNA replikasyonu ile üretildiği için biyolojide her yerde bulunur. Bu trifosfatlar, ökaryotlarda 7-metilguanlatla kaplı mRNA oluşumu için substrat görevi görür ve bu nedenle protein ekspresyonu1'de önemli bir rol oynar. Buna karşılık, trifosfat bakteri ve virüslerde tutulur; Böylece, RNA 5′-trifosfatlar, ökaryotlardaki doğuştan gelen bağışıklık yanıtı düzenleyicileri tarafındantanınır 2,3,4,5,6,7. Biyolojinin dışında, 5'-trifosfat in vitro8'i kullanmak için bir dizi RNA ligaz ribozimi evrimleştirildi ve 9,10,11,12,13,14,15 tanısal tahlillerinde kullanılmak üzere modifiye edildi. Böyle bir ribozim, doğal D-RNA'nın biyolojik olmayan "ayna görüntüsü" enantiyomeri olan L-RNA'nın şablona bağımlı sentezi için, küçük L-RNA oligonükleotid 5′-trifosfatlardan 16,17,18 için kullanılabilir. Farklı sekanslara ve omurga kompozisyonuna sahip trifosforile oligonükleotidlerin rutin olarak hazırlanması, bu sistemlerin araştırılması için esastır.
Laboratuvarda RNA 5′-trifosfatların hazırlanmasında en yaygın ve erişilebilir yöntem in vitro transkripsiyondur. Bununla birlikte, bu yöntemle üretilen RNA, RNA polimeraz enziminin promotör ve substrat gereksinimleri ile sıra ve boyut olarak sınırlandırılmıştır. T7 RNA polimeraz ve özel türevleri bu amaçla kullanılan en yaygın polimerazlardır 19,20,21,22. Bu enzimlerle hazırlanan in vitro transkribe RNA, 5'-terminal pürin ile başlatılmalıdır ve ilk 10 nükleotid23,24'teki pürinlere karşı güçlü bir şekilde önyargılıdır. Dahası, baz veya omurga modifiye nükleotidlerin enzimatik olarak dahil edilmesi, doğal polimerazlarla en iyi ihtimalle verimsiz ve daha sık imkansızdır, bu da doğal D-RNA'dan başka herhangi bir şeyden oluşan oligonükleotid 5'-trifosfatlar üretme fırsatını sınırlar. Diğer bir sınırlayıcı faktör, in vitro transkripsiyon ile üretilen RNA'nın önemli miktarda 5 ve 3 - heterojenlik içerebilmesi ve 20 nt 23,24,25,26,27'den kısa olduğunda aşırı heterojen ürünler olarak üretilmesidir.
Buna karşılık, katı faz fosforamid sentezi 28,29,30,31,32,33,34,35 tarafından hazırlanan oligonükleotidlerin kimyasal trifosforilasyonu, herhangi bir dizinin 3-50 nt uzunluğundaki oligonükleotid 5′-trifosfatları hazırlamak için kullanılabilir. Ek olarak, fosforamid sentezine erişilebilen çok çeşitli nükleik asit modifikasyonları, 5′-trifosforilasyon 14,15,16,17,18,29,36'dan önce oligonükleotidlere eklenebilir. Bu yöntemlerin çoğu, Ludwig ve Eckstein tarafından mononükleozitlerin çözelti fazı trifosforilasyonu için geliştirilen fosfitilasyon reaktifi salisil fosforokloriditi kullanır37. Oligonükleotidlerin bu reaktif ile trifosforilasyonu, oligonükleotid 5′-hidroksilin fosfitilasyonu, pirofosfat ve oksidasyon ile reaksiyona sokularak trifosfata dönüştürülmesi, ardından oligonükleotidin katı destekten ayrılması, deproteksiyonu ve saflaştırılması için standart prosedürler ile katı fazda elde edilir (Şekil 1)28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig01v2.jpg"> Şekil 1: Sentetik oligonükleotidlerin trifosforilasyonu için şema. İlk adımda, oligonükleotid 5ʹ-hidroksil, SalPCl ile fosfitile edilir. Bir sonraki adımda, 5ʹ-salisil fosfit, siklik metafosfiti oluşturmak için TBAP ile reaksiyona sokuldu, daha sonra üçüncü adımda, aynı çözelti 28,33'te doğrusal 5ʹ-trifosfatı vermek için hızla hidrolize edilen DNA / RNA sentezleyici oksidasyon çözeltisinde (0.1 M İyot / piridin / H 2 O / THF) siklik 5ʹ-trimetafosfat üretmek için oksitlendi, 37. Sulu MeNH2 / amonyaktaki katı CPG desteğinden sonraki alkali bölünme ve oligonükleotidin korunmasının azaltılması, herhangi bir kalıntı siklik trimetafosfatı doğrusal forma hidrolize edecektir. Kısaltmalar: SalPCl = salisil fosforokloridit; TBAP = tributylammonium pyrophosphate; THF = tetrahidrofuran; CPG = kontrollü gözenekli cam; MeNH2 = metilamin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu yöntemi kullanan erken yayınlanmış raporlar genellikle düşük verimlerden ve istenmeyen yan ürünlerden muzdarip olsa da28,37,38, susuz koşulların dikkatli bir şekilde korunması, rutin olarak yüksek verim elde etmek için gerekli olan tek şeydir. Bu, reaktiflerin dikkatli bir şekilde hazırlanması ve standart plastik bileşenlerden monte edilmiş basit bir reaksiyon cihazının kullanılmasıyla sağlanabilir. Burada, reaktiflerin hazırlanması, reaksiyon odasının montajı, trifosforilasyon reaksiyonu ve daha sonra trifosforile oligonükleotidlerin korunmasının azaltılması ve saflaştırılması dahil olmak üzere oligonükleotidlerin kimyasal trifosforilasyonu için uygun adımları gösteriyoruz. Ayrıca, doğal D-RNA ve abiyotik L-RNA omurgaları ile daha büyük nükleik asit ürünlerinin sentezi için ligaz ribozimleri için substratlar olarak 5'-trifosforile oligonükleotidlerin temsili kullanımı da dahildir.

<table><tbody><tr><td>0.22 ve mikro; m polietersülfon şırınga filtresi</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLMP025SS</td><td>Ezilmiş poliakrilamid jel parçacıklarını çıkarmak için şırınga filtresi (Bölüm 5)</td></tr> <tr><td>0.22 ve mikro; m PTFE şırınga filtresi</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLLG013SL</td><td>CPG reçinesini çıkarmak için şırınga filtresi (Bölüm 5)</td></tr><tr><td>1 mL plastik şırıngalar</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-434 (BD 309659)</td><td>Trifosforilasyon aparatının bileşenleri (bölüm 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>1,4-Dioksan, susuz</td><td>MilliporeSigma</td><td>296309</td><td>Trifosforilasyon çözücüsü (bölüm 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>2-Kloro-4H-1,3,2-benzodioksafosforin-4-on, Salisil Fosforokloridit (SalPCl)</td> <td>MilliporeSigma</td><td>324124</td><td>Trifosforilasyon reaktifi (bölüm 2 ve ndash; 4)</td></tr> <tr><td>30 mL cam şişeler</td><td>MilliporeSigma</td><td>23232</td><td>Trifosforilasyon çözücüleri ve TBAP çözeltisi hazırlamak için şişeler (bölüm 2)</td></tr> <tr><td>3 Musluk, polikarbonat / polipropilen</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>7328103</td><td>Trifosforilasyon aparatının bileşeni (bölüm 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>% 40 akrilamid / bis-akrilamid çözeltisi, 19: 1</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1610144</td><td>PAGE için (bölüm 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Asetonitril, susuz, 100 mL</td><td>Glen Research</td><td>40-4050-50</td><td>Trifosforilasyon çözücüsü (bölüm 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>Amonyak nötralize edici Tuzak</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ANT100 ve ANS121</td><td>Speedvac DNA130 ile kullanım için (bölüm 5)</td></tr><tr><td>Amonyum persülfat (APS)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610700</td><td>PAGE için, akrilamid polimerizasyonu için katalizör (bölüm 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Sulu amonyak, %28</td> <td>MilliporeSigma</td><td>338818</td><td>AMA koruma koruma reaktifi hazırlamak için (bölüm 5)</td></tr><tr><td>Sulu metilamin, %40</td> <td>TCI America</td><td>TCI-M0137</td><td>AMA koruma giderici reaktifi hazırlamak için (bölüm 5)</td></tr><tr><td>Otomatik DNA/RNA oligonükleotid sentezleyici</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td>Expedite 8909 DNA/RNA Sentezleyici</td><td>Herhangi bir sütun tabanlı sentezleyici kabul edilebilir (bölüm 1)</td></tr><tr><td>Boncuk yakalama mıknatısı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12320D</td><td>Streptavidin boncuk yakalama için (bölüm 7)</td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1610404</td><td>PAGE için üre yükleme tamponu (bölüm 5)</td></tr><tr><td>Derin vakumlu yağ pompası</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VLP200-115</td><td>Liyofilizatör ile kullanım için (bölüm 5)</td></tr><tr><td>Kurutucu kurutucu, 10-20 gözenekli</td><td>MilliporeSigma</td><td>737828</td><td>Trifosforilasyon kimyasallarını ve ekipmanlarını depolamak için kurutucu (bölüm 1&ndash; 2)</td></tr> <tr><td>Evde hazırlanan D-RNA 27.3t çapraz kiral polimeraz</td><td>18</td><td>5&prime;-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3 & prime;</td><td>Çapraz kiral ribozim reaksiyonları için (bölüm 7)</td></tr><tr><td>D-RNA CPG katı destekler, 1.000 & , önceden paketlenmiş 1 & mikro; mol sentezi sütunları</td><td>Glen Research</td><td>20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E</td><td>temsilcisi, D-RNA oligonükleotid sentezi için (bölüm 1)</td></tr><tr><td>D-RNA TOM korumalı fosforamiditler</td><td>ChemGenes</td><td>ANP-3201, 3202, 3203, 3205</td><td>temsilcisi, D-RNA oligonükleotid sentezi için (bölüm 1</td></tr><tr><td>) Boş Hızlı Sentez Sütunları, 1 & mikro; m</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-01</td><td>Expedite DNA/RNA sentezleyici ile kullanım için sentez sütunları (bölüm 1)</td></tr><tr><td>EPPS, N- (2-Hidroksietil) piperazin-N&prime;-(3-propansülfonik asit), katı</td><td>MilliporeSigma</td><td>E1894</td><td>Ribozim reaksiyon tamponu bileşeni (bölüm 6)</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA), katı</td><td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>Çeşitli tamponlarda kullanım için iki değerlikli metal iyon şelatörü ( Bölüm 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Expedite sentez sütunları için filtreler</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-0F</td><td>Boş sentez sütunlarıyla kullanım için hızlandırılmış sentez sütunu filtreleri (bölüm 1)</td></tr><tr><td>Floresan/fosforlu jel tarayıcı</td><td>Cytiva</td><td>Amersham Typhoon RGB, 29187193</td><td>Analitik PAGE'i görselleştirmek için (bölüm 6&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Formamid, deiyonize</td><td>VWR Life Science</td><td>97062</td><td>PAGE formamid jel yükleme tamponu için (bölüm 6&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Jel görüntü niceleme yazılımı</td><td>Cytiva</td><td>ImageQuant TL</td><td>Taranan jel görüntülerinin miktarını belirlemek için (bölüm 6)</td></tr><tr><td>Cam kurutucu</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3121150</td><td>Trifosforilasyon çözücü depolama (bölüm 2)</td></tr><tr><td>L-RNA CPG katı destekleri, 1.000&Aring;, toplu</td><td>ChemGenes</td><td>N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10</td><td>L-RNA oligonükleotid sentezi (bölüm 1)</td></tr><tr><td>Evde hazırlanan L-RNA çekiç başlı şablon</td><td>18</td><td>5&prime;-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3&prime;</td><td>Çapraz kiral ribozim reaksiyonları için (bölüm 7)</td></tr><tr><td>Evde hazırlanan L-RNA</td><td>astarı18</td><td>5&prime;-floresein-GGCUCGA-3&prime;</td><td>Çapraz kiral ribozim reaksiyonları için (bölüm 7)</td></tr><tr><td>L-RNA TOM korumalı fosforamiditler</td><td>ChemGenes</td><td>OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205</td><td>L-RNA oligonükleotid sentezi (bölüm 1)</td></tr><tr><td>Liyofilizatör/Dondurarak Kurutucu</td><td>VirTis</td><td>Tezgah Üstü K</td><td>Oligonükleotidleri konsantre etmek için (bölüm 5)</td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür Hekzahidrat, katı</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2670</td><td>Ribozim reaksiyonları için (bölüm 6&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>N, N-Dimetilformamid, susuz</td><td>MilliporeSigma</td><td>227056</td><td>Trifosforilasyon çözücüsü (bölüm 2)</td></tr> <tr><td>NAP-25 Tuz giderme sütunu (Sephadex G-25 reçinesi)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>45000150</td><td>Sephadex G-25 reçinesi içeren tek kullanımlık yerçekimi akış boyutu dışlama kromatografi kolonları (bölüm 5)</td></tr> <tr><td>Karotsuz paslanmaz çelik iğne, 20 G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-815-410</td><td>Kauçuk septayı delmek için iğneler (bölüm 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>Oligonükleotid yok olma katsayısı hesaplayıcısı</td><td>Entegre DNA</td><td>Teknolojileri OligoAnalyzer</td><td>Aracı En Yakın Komşu Modeli Kısa Oligonükleotid 260nm yok olma katsayısı hesaplayıcısı (bölüm 5)</td></tr><tr><td>Oksitleyici çözelti, THF/piridin/suda 0,1 M İyot</td><td>ChemGenes</td><td>RN-1456</td><td>Trifosforilasyon reaktifi (bölüm 4)</td></tr><tr><td>PAGE plakaları</td><td>Timberrock/CBS</td><td>NGP-250-BO ve NO</td><td>PAGE için (bölüm 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>PAGE güç kaynağı</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>PowerPac HV 1645056</td><td>PAGE için (bölüm 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>PAGE ara parçaları ve tarakları (analitik)</td><td>Timberrock/CBS</td><td>VGS-0725 ve VGC-0714</td><td>PAGE için (bölüm 6&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>PAGE ara parçaları ve tarakları (hazırlayıcı)</td> <td>Timberrock/CBS</td><td>VGS-3025R ve VGC-3001</td><td>PAGE için (bölüm 5)</td></tr><tr><td>PAGE standı</td><td>Timberrock/CBS</td><td>ASG-250</td><td>PAGE için (bölüm 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-374-12 (Bemis PM999)</td><td>Trifosforilasyon aparatı için balmumu sızdırmazlık filmi (bölüm 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>PCR termodöngüleyici</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>C1000 Dokunmatik Termaldöngüleyici</td><td>Çapraz kiral ribozim reaksiyonları için (bölüm 7)</td></tr><tr><td>PD 10 Tuzdan arındırma kolonu (Sephadex G-10 reçinesi)</td><td>MilliporeSigma</td><td>GE17-0010-01</td><td>Oligonükleotidler < 15 nt için Sephadex G-10 reçinesi içeren tek kullanımlık yerçekimi akış boyutu dışlama kromatografisi kolonları (bölüm 5)</td></tr><tr><td>Fosfor ekranları</td><td>Cytiva</td><td>28956480</td><td>32P etiketli RNA'yı görselleştirmek için (bölüm 6)</td></tr><tr><td>Fosforamidit sentez reaktifleri</td><td>Glen Research</td><td>30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4060-62</td><td>temsilcisi, standart RNA/DNA sentezi için (bölüm 1)</td></tr><tr><td>Polipropilen vidalı kapaklı sızdırmaz tüp</td><td>MilliporeSigma</td><td>BR780752</td><td>Güvenli AMA koruması için vidalı kapaklı ve silikon O-ringli 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri ( bölüm 5)</td></tr><tr><td>Piridin, susuz</td><td>MilliporeSigma</td><td>270970</td><td>Trifosforilasyon çözücüsü (bölüm 2)</td></tr><tr><td>Ters fazlı sıvı kromatografisi/elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (RP-LC/ESI-MS)</td><td>Novatia</td><td>n/a</td><td>Oligonükleotidler konusunda uzmanlaşmış LC/MS için ticari hizmet (bölüm 5)</td></tr><tr><td>Kauçuk Septa (ID x OD 7.9 mm x 14 mm), beyaz</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z564702</td><td>Trifosforilasyon çözücüleri ve TBAP hazırlamak için septa (bölüm 2)</td></tr><tr><td>Evde hazırlanan kendinden çoğaltıcı ribozim E</td><td>14</td><td>5&prime;-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3&prime;</td><td>Kendi kendini çoğaltan ribozim reaksiyonları için (bölüm 6)</td></tr><tr><td>Evde hazırlanan kendi kendini çoğaltan substrat A</td><td>14</td><td>5&prime;-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3&prime;-OH</td><td>Kendi kendini çoğaltan ribozim reaksiyonları için (bölüm 6)</td></tr><tr><td>Evde hazırlanan transkripsiyonlu kendi kendini çoğaltan substrat B<</td><td>sup>14</td><td>5&prime;-pppGAGACCGCAA CUUA-3&prime;</td><td>Kendi kendini çoğaltan ribozim reaksiyonları için (bölüm 6)</td></tr><tr><td>Küçük Kurutma Tuzakları, 4 & Aring; moleküler elekler</td><td>ChemGenes</td><td>DMT-1975</td><td>DNA / RNA sentezleyici fosforamiditler ve trifosforilasyon reaktifleri için kurutma tuzakları (bölüm 1&ndash; 2)</td></tr> <tr><td>Sodyum Klorür (NaCl), katı</td><td>MilliporeSigma</td><td>S7653</td><td>Çeşitli tamponlarda kullanım için tuz (bölüm 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Sodyum Hidroksit (NaOH), katı</td><td>MilliporeSigma</td><td>S8045</td><td>Çeşitli tamponlarda kullanım için tuz (bölüm 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>İstatistiksel veri uydurma yazılımı</td><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>Analitik PAGE'den kinetik modellere veri uydurmak için (bölüm 6)</td></tr><tr><td>Streptavidin kaplı manyetik boncuklar</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65002</td><td>Çapraz kiral ribozim reaksiyonlarında biyotin etiketli RNA'yı yakalamak için (bölüm 7)</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>MilliporeSigma</td><td>84097</td><td>PAGE üre yükleme tamponu için (bölüm 5)</td></tr><tr><td>TBE çalışma tamponu, PAGE için 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ62788K3</td><td>(bölüm 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Tetrabütilamonyum Florür, Tetrahidrofuran Aldrich 216143 içinde 1.0 M çözeltisi</td><td></td><td></td><td>2 ve prime; - silil koruyucu grupların çıkarılması için (bölüm 5)</td></tr> <tr><td>Tetrametiletilendiamin (TEMED)</td> <td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1610801</td><td>PAGE için akrilamidin polimerizasyonu için (bölüm 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Triketilamin</td><td>MilliporeSigma</td><td>90781</td><td>Trifosforilasyon reaktifi (bölüm 2)</td></tr><tr><td>Trikilamonyum pirofosfat (TBAP)</td><td>MilliporeSigma</td><td>P8533</td><td>Trifosforilasyon reaktifi (bölüm 2)</td></tr><tr><td>Tris bazlı</td><td>MilliporeSigma</td><td>T6666</td><td>Çeşitli tamponlarda kullanım için tamponlama maddesi (bölüm 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>TWEEN20 polisorbat deterjan</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7949</td><td>Manyetik boncuklarla kullanım için nötr deterjan (Bölüm 7)</td></tr> <tr><td>Üre</td><td>MilliporeSigma</td><td>U5378</td><td>PAGE ve jel yükleme tamponu için (bölüm 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>UV-Vis spektrofotometresi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000, ND2000</td><td>Oligonükleotid konsantrasyonlarını ölçmek için (bölüm 5)</td></tr> <tr><td>Vakumlu santrifüj</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Savant Speedvac DNA130-115 Vakum Konsantratörü</td><td>AMA ve THF'yi çıkarmak için (bölüm 5)</td></tr> <tr><td>Ksilen siyanol</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1610423</td><td>PAGE için üre yükleme tamponu (bölüm 5)</td></tr></tbody></table>

oligonükleotidlerin kimyasal trifosforilasyonu

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

5′-trifosfat, tüm yaşam boyunca bulunan ve biyoteknoloji ve sentetik biyolojide oligonükleotidlerin fonksiyonel bir modifikasyonu olarak giderek daha fazla kullanılan temel bir nükleik asit modifikasyonudur. Oligonükleotid 5′-trifosfatlar tarihsel olarak enzimatik yöntemlerle in vitro olarak hazırlanmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemler doğal RNA oligonükleotidleri ile sınırlıdır, güçlü sekans tercihlerine sahiptir ve heterojen ürünler üretme eğilimindedir. Yeni kimyasal trifosforilasyon yöntemleri, hem fosforamid kimyası ile otomatik oligonükleotid sentezinin azaltılmış maliyetini hem de şu anda mevcut olan çeşitli nükleotid modifikasyonlarını tamamlamaktadır. Böylece, keyfi dizi ve uzunluktaki oligonükleotid trifosfatların sentezi ve isteğe bağlı olarak çeşitli doğal olmayan modifikasyonlar içermesi artık erişilebilirdir.
Bu yazıda oligonükleotidlerin salisil fosforokloridit ve pirofosfat kullanılarak kimyasal trifosforilasyonu için uygun yöntem ve teknikler sunulmaktadır. Bu yöntem, ticari olarak temin edilebilen reaktifleri kullanır, standart katı faz sentez yöntemleriyle hazırlanan çoğu oligonükleotid ile uyumludur ve oligonükleotid sentezini takiben, korumadan ve saflaştırmadan önce 2 saat içinde tamamlanabilir. Katalitik RNA enzimleri için substratlar olarak kimyasal olarak trifosforile oligonükleotidlerin iki kullanımı, biyolojik olmayan L-RNA trifosfatlardan çekiç başlı ribozimin ayna görüntüsü versiyonunun sentezi de dahil olmak üzere gösterilmiştir.

Oligonükleotidler, fosforamiditlere ve otomatik DNA / RNA sentezleyicisine uygun standart protokoller kullanılarak sentezlenmeli, ürün oligonükleotidi orijinal plastik sentez kolonundaki katı destekten ayrılarak, serbest 5ʹ-hidroksil üretmek için 5ʹ-terminal dimetoksitritil grubu çıkarılmalıdır (bölüm 1). Bu gösterimde kullanılan tüm oligonükleotidler, katı destek olarak 1.000 şkontrollü gözenek camı (CPG) reçinesi kullanılarak hazırlandı ve 0.2 veya 1 μmole ölçeğinde gerçekleştirildi. Sentezleyici kolonların, reçinelerin, reaktiflerin ve fosforamiditlerin temsili örnekleri Malzeme Tablosunda verilmiştir. Daha büyük ölçekli reaksiyonlar için, sonraki adımlarda kullanılan hacimlerin ve sürelerin ayarlanması gerekebilir.
Trifosforilasyon reaksiyonu, Malzeme Tablosunda listelenen standart, ticari olarak temin edilebilen bileşenler kullanılarak özel yapım bir reaksiyon odasında (Şekil 2, bölüm 3) kolon üzerinde gerçekleştirilir ve Şekil 1 (bölüm 4) 28'de gösterilen şemayı izler. Trifosforilasyon sırasında koşulların kesinlikle susuzca tutulması ve tüm çözücülerin ve reaktiflerin moleküler elekler üzerinde önceden hazırlanması ve kullanımdan önce tamamen kurumasına izin verilmesi esastır (bölüm 2). Trifosforilasyonun gerçekleşmesi tipik olarak 2 saat sürer ve daha sonra, yıkanmış ve kurutulmuş kolon standart oligonükleotid deproteksiyon ve saflaştırma prosedürlerine göre muamele edilebilir (bölüm 5).
Deproteksiyondan sonra, oligonükleotid trifosfatlar, poliakrilamid jel elektroforezini (PAGE) denatüre ederek saflaştırılır ve UV geri gölgeleme ile jelden eksize edilebilen ve salınabilen tek bir ana ürün bandı gösterilir. 5′-trifosfat ürünü, DNA trinükleotid 5ʹ-trifosfatlar, pppAAA ve pppCCC ve L-RNA trinükleotid 5ʹ-trifosfat pppGAA için Şekil 3A,B'de gösterildiği gibi, kısa oligonükleotidler için reaksiyon tarafı ürünlerinden kolayca ayrılır. AAA ve CCC DNA trimerleri için hem 5'-hidroksil hem de 5'-trifosfat ürünleri eksize edildi ve kütle spektrometresi ile tanımlandı ve buna uygun olarak Şekil 3A'da etiketlendi. AAA DNA trimeri için görülebildiği gibi ek bantlar genellikle iyileşmek ve tanımlamak için yeterli materyal içermez. Bununla birlikte, bu bantların varlığı, aşağıda tartışıldığı gibi, tipik olarak 5'-difosfat, monofosfat ve H-fosfonat yan ürünlerini temsil eden saflaştırılmamış reaksiyon ürünlerindeki (Şekil 3C) ek ürün kütleleri ile ilişkilidir.
PAGE saflaştırmasından sonra, daha büyük oligonükleotidler, ezilme ve ıslatma yöntemi42 ve ardından etanol çökeltmesi kullanılarak salınabilir. Bununla birlikte, 15 nt'den küçük oligonükleotidler etanol verimli bir şekilde çökeltilemez ve bu nedenle jel elüsyonu için modifiye edilmiş bir prosedür gerektirir (adım 5.11.3). Malzeme Tablosunda listelenen tek kullanımlık boyut hariç tutma sütunu, yalnızca 10 nt'den daha uzun oligonükleotidlerle kullanım için derecelendirilmiştir. Bununla birlikte, düzelticiler kadar kısa oligonükleotidlerin, üreticinin önerdiği protokol kullanılarak etkili bir şekilde tuzdan arındırılabileceğini bulduk. Bununla birlikte, kısa oligonükleotidlerin tuzu alınırken (adım 5.6 ve 5.11.3'te olduğu gibi) kolon elüatının fraksiyonlar halinde toplanması ve ürün fraksiyonlarının bir UV-Vis spektrofotometresi kullanılarak 260 nm'de absorbans ile tanımlanması önerilir. Daha kısa oligonükleotidler için optimize edilmiş bir boyut hariç tutma sütunu, alternatif bir seçenek olarak Malzeme Tablosunda sağlanmıştır. Saflaştırmadan sonra 1 μmol ölçekli oligonükleotid sentezinden elde edilen nihai verim 50-300 nmol'dür.
Trifosforilasyon, trifosforile edilmiş ürünün 5′-hidroksil oligonükleotidden +239.94 Da daha büyük bir kütleye sahip olduğu kütle spektrometrisi ile doğrulanabilir, ancak 5'-di- ve monofosfata karşılık gelen malzemelerin varlığı (+159.96 ve +79.98 Da) sıklıkla gözlenir. 5′-OH kütlesinden +63.98 Da kütleye sahip bir 5′-H-fosfonat yan ürünü de gözlenebilir ve bu ürünün yüksek seviyeleri, trifosforilasyon sırasındaki koşulların yeterince susuz olmadığını gösterir. Saflaştırmadan önce, korumasız oligonükleotidler tipik olarak tüm bu ürünleri gösterecektir (Şekil 3C), saflaştırılmış malzeme ise 5'-di- ve monofosfatlarla birlikte 5'-trifosfat ürününe karşılık gelen bir tepe gösterecektir (Şekil 3D, E).
Tek başına kütle spektrometresi, iyonizasyon sırasında farklı iyonlaşma oranları ve trifosfatın parçalanması nedeniyle tipik olarak 5′-trifosfat saflığının titiz bir ölçüsünü vermeyecektir. Nihai ürün saflığını ölçmek için, özellikle daha uzun oligonükleotidler için ters fazlı sıvı kromatografisi ve tandem ESI-MS (RP-LC / ESI-MS) önerilir. D-RNA 5ʹ-trifosfatlar pppACGAGG ve pppGAGACCGCAACUUA'nın RP-LC/ESI-MS ile analizi (sırasıyla Şekil 4A,B), bu iki türün daha uzun oligonükleotidlerde bulunduğunda ayrılması zor olduğundan,% 20 5ʹ-difosfat içeren tipik nihai ürün saflığını göstermektedir.
Sentetik 5'-trifosfat oligonükleotidler tipik olarak biyokimyasal çalışmalarda enzimatik olarak hazırlanan malzemelerden daha iyi veya daha iyi işlev görür. Bölüm 6'da, örnek olarak, sentetik olarak veya in vitro transkripsiyon ile hazırlanan 5'-trifosfat 14 nt RNA substratları, RNA katalizörlü bir kendi kendine replikasyon reaksiyonu14,15,43,44,45 ile karşılaştırılmıştır. Ribozime E, üstel büyüme yeteneğine sahip otokatalitik bir reaksiyonda E'nin yeni bir kopyasını vermek için A ve B substratlarının birleştirilmesini katalize eder (Şekil 5A). E ve 32P-etiketli A bileşenleri in vitro transkripsiyon ile hazırlandı ve trifosforile substrat B, yukarıda tarif edildiği gibi sentetik olarak veya in vitro transkripsiyon14 ile hazırlandı. Kendi kendini kopyalama reaksiyonu ilerlemesi, PAGE'yi denatüre ederek analiz edilen ve bir floresan / fosforesan jel tarayıcı ile ölçülen periyodik numuneler alınarak izlendi. Lojistik bir büyüme fonksiyonuna uyan elde edilen veriler, transkribe edilmiş veya sentetik B substratının üstel büyümeyi desteklediğini, ancak sentetik B'nin biraz daha fazla miktarda ürün verdiğini ortaya koymuştur (Şekil 5B). Bu sonuç, in vitro transkripsiyon23,24 tarafından hazırlanan RNA'nın 5′-ucundaki bileşimsel heterojenliği yansıtabilir.
Kimyasal trifosforilasyon ayrıca in vitro veya in hücrelerde biyolojik olarak hazırlanamayan oligonükleotid trifosfatların sentezini sağlar. Bölüm 7'de, bölüm 1-5'te olduğu gibi hazırlanan doğal D-RNA'nın enantiyomeri L-RNA'dan oluşan biyolojik olmayan oligonükleotid trifosfatlar, kısa L-RNA oligonükleotid 5′-trifosfatlardan daha uzun bir L-RNA ürününün şablona yönlendirilmiş polimerizasyonunu genel bir sırayla katalize eden D-RNA "çapraz-kiral" polimeraz ribozim 27.3t (Şekil 6A) için substrat olarak kullanılmıştır. Örnek olarak, ribozim, çekiç kafalı kendiliğinden bölünme motifinin bir L-RNA versiyonunu sentezleyebilir (Şekil 6B)18. Saflaştırılmış L-RNA trinükleotid trifosfatları, floresein etiketli L-RNA primer ve L-RNA şablonu (Şekil 6C) ile birleştirildi ve çapraz kiral ligaz ile reaksiyona sokuldu. Reaksiyon boyunca örnekler PAGE tarafından analiz edildi ve şablon tarafından kodlanan çekiç kafalı ribozimin L-RNA versiyonunun sentezini göstermek için bir floresan / fosforesan jel tarayıcı kullanılarak görüntülendi (Şekil 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig03.jpg"> Şekil 3: Trinükleotid 5ʹ-trifosfatların saflaştırılması. (A) DNA trinükleotidleri tri-deoksiadenozin (AAA, mavi) ve tri-deoksisitidin (CCC, kırmızı) trifosforilasyonunun PAGE analizi (UV geri gölgeleme ile görselleştirilmiş), minör yan ürünleri görselleştirmek için kasıtlı olarak aşırı yüklenmiştir. Hem 5ʹ-trifosfat ürünü (ppp) hem de 5ʹ-hidroksil (OH) başlangıç malzemesi MALDI-MS tarafından eksize edildi ve tanımlandı. (B) L-RNA TRINÜKLEOTID GAA'nın trifosforilasyonunun hazırlık PAGE'i, ana ürün bandı eksize edilmiş ve ESI-MS tarafından 5ʹ-trifosfat (ppp) olarak tanımlanmıştır. (C) Korumadan arındırma sonrası ham reaksiyon ürünlerinin MALDI-MS'si ve (D) (A)'dan saflaştırılmış ürünler. 5ʹ-trifosfat (ppp; pppAAA 1,119 Da, gözlenen 1,118 Da; pppCCC 1,047 Da, gözlenen 1,046); 5ʹ-difosfat (pp), 5ʹ-monofosfat (p), 5ʹ-hidroksil (OH) ve 5ʹ-H-fosfonat (Hp) etiketlenmiştir. (E) (B)'den izole edilmiş 5ʹ-trifosfat ürününün doğrudan enjeksiyonu ESI-MS'den dekonvolüne kütle spektrumu, tanımlanmış pikler etiketlenmiş (beklenen 1,181.6 Da, gözlemlenen 1,181.0 Da). 5ʹ-difosfat (pp) ürünleri, hem tri- hem de di-fosfat ürünleri (+22 Da) için sodyum iyon zirveleri gibi gözlenir. Yaygın kirletici pikleri yıldız işareti ile etiketlenir. Karşılaştırma kolaylığı için, kütle spektrumları her spektrumda ölçülen en yüksek yoğunluğa normalleştirildi ve bu değere göre yüzde olarak rapor edildi. Kısaltmalar: PAGE = poliakrilamid jel elektroforezi; MALDI-MS = matris yardımlı lazer desorpsiyonu/iyonizasyonu; ESI-MS = elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig04.jpg"> Şekil 4: 6 nt ve 14 nt D-RNA oligonükleotid trifosfatlarının analitik RP-LC'si . (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹ ve (B) 5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3ʹ. Tandem ESI-MS, her ikisinin de (~% 70) majör zirvesini 5ʹ-trifosfat (ppp) olarak tanımladı ve daha az miktarda 5ʹ-difosfat (pp) elde etti. Kısaltmalar: RP-LC = ters fazlı sıvı kromatografisi; nt = nükleotidler; ESI-MS = elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig05.jpg"> Şekil 5: Kimyasal sentez veya in vitro transkripsiyon ile hazırlanan oligonükleotid 5ʹ-trifosfat substratlarının karşılaştırılması. (A) Kendiliğinden çoğalan ribozim E, RNA A ve 5′-trifosforile RNA B'yi bağlar. (B) 10 μM A ve 10 μM B kullanılarak, sentetik (açık daireler) veya in vitro transkribe edilmiş (doldurulmuş daireler) kullanılarak kendi kendine replikasyon reaksiyonlarının karşılaştırılması. (B) Veriler lojistik büyüme denklemine uygundu: [E] = a / (1 + b e-ct), burada a nihai verim, bsigmoidisite derecesi ve c üstel büyüme oranıdır. İki reaksiyon için büyüme oranları 1.14 h-1'de aynıyken, sentetik B ile reaksiyonlar için son derece daha yüksekti<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig05large.jpg" target="_blank">.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig06.jpg"> Şekil 6: Bir ribozim ile çapraz kiral L-RNA polimerizasyonu. (A) L-RNA'nın şablona bağımlı ligasyonunu katalize eden D-RNA 27.3t polimeraz ribozim. (B) 27.3t ile sentezlenen L-RNA ürünü, çekiç kafalı endonükleaz motifinin bir parçasını oluşturur. (C) Sentetik olarak hazırlanan biyotinile edilmiş bir L-RNA şablonu (kahverengi), bir son etiketli L-RNA primer (macenta) ve dört L-RNA trinükleotid trifosfat (camgöbeği) kullanılarak 27.3t ile katalize edilen L-RNA polimerizasyonu. (D) (B)'nin uzatma ürünlerinin 4 saat ve 24 saat hızlarında, her trinükleotid birleşmesini tam uzunluktaki ürüne (siyah nokta) kadar gösteren PAGE analizi. Reaksiyona girmemiş L-RNA primer referans belirteci olarak dahil edilir. Kısaltmalar: PAGE = poliakrilamid jel elektroforezi; M = referans işaretleyici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Oligonükleotid 5′-trifosfatlar, esansiyel biyolojik yollarda her yerde bulunan bileşenlerdir ve biyoteknoloji uygulamalarında artan kullanım görmüştür. Burada, standart otomatik sentez teknikleriyle hazırlanan oligonükleotidlerden başlayarak oligonükleotid 5′-trifosfatların rutin sentezi ve saflaştırılması için teknikleri açıklıyoruz.

Oligonükleotidlerin Kimyasal Trifosforilasyonu

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

Trifosforilasyon, biyolojide RNA'nın her yerde bulunan 5' modifikasyonudur ve biyoteknoloji uygulamalarında giderek daha fazla kullanılmaktadır. Burada özetlenen protokol, standart otomatik sentez ile hazırlanan herhangi bir oligonükleotidin 5'trifosforilasyonunu sağlar. Kimyasal trifosforilasyon, RNA, DNA veya doğal olmayan nükleik asit içeren oligonükleotidler üzerinde çalışır.Burada, biyolojik D-RNA'nın enantiyomeri olan trifosforile solak L-RNA, saflaştırılmış olarak sentezlenir ve bir ribozom reaksiyonunda kullanılır. Trifosforilasyon, otomatik oligonükleotid sentezinden sonra ve deproteksiyondan önce gerçekleştirilir. Bu adımlar burada gösterilmemiştir, ancak araştırmacılar her ikisi için de standart yöntemlere aşina olmalıdır.Başlamak için, fosforilasyon çalışma alanının en az iki hatlı bir gaz manifolduna sahip olduğundan ve trifosforilasyon reaksiyonu argon altında gerçekleştirilmesi gerektiğinden, kabarcığın ayarlanabilir basınçla kuru bir argon kaynağına bağlandığından emin olun. Ardından, reaksiyon aparatına bağlantıyı kolaylaştırmak için hatlara bir mililitre plastik şırınga takın. Daha sonra, bir mililitrelik plastik şırıngalar, üç bir polipropilen tıpa, noncoring iğneler, 1,5 mililitre polipropilen tüpler, küçük bir metal spatula dahil olmak üzere ekipmanı toplayın ve kullanımdan en az bir gün önce oda sıcaklığında bir kurutucu ile kapalı bir kapta veya kurutucuda saklayın.Argon basıncı altında, kapalı bir şişeden 30 mililitre susuz 1, 4-dioksan çekin. Kurutulmuş 30 mililitrelik bir cam şişeye aktarın ve bir kurutma tuzağı ekleyin. Kauçuk septa ile kapatın ve kurutuculu bir kurutucuda saklayın.Benzer şekilde, 30 mililitre N, N-dimetilformamid, asetonitril ve üç parça dioksan ve bir parça piridin karışımını hacimce hazırlayın. Makalede açıklandığı gibi 30 mililitrelik bir cam şişede katı tributylammonium pirofosfatı dimetilformamid ve tributilamin ile karıştırarak TBAP çözeltisi hazırlayın. Üç çizim tuzağı ekleyin.Şişeyi argon altında kauçuk bir septumla kapatın ve 30 dakika boyunca argon ile kabarcıklayın. Otomatik bir DNA / RNA sentezleyici kullanarak bir sentez sütunu üzerinde serbest bir 5'hidroksil ile bir oligonükleotid hazırladıktan sonra. Pistonu kuru bir mililitrelik şırıngadan çıkararak odayı hazırlayın.Şırınganın üstünü makas veya tıraş bıçağı kullanarak kesin ve şırıngayı sentez kolonuna takın. Şırınganın tepesine, üç yönlü stopcock'u takın ve stopcock'un yan girişini bubbler ile kuru argon kaynağına takın, böylece stopcock'un üst girişi reaktif enjeksiyon portu olarak işlev görür. Bu operatörü kelepçeli bir standa sabitleyin ve tüm yukarı akış bağlantılarını balmumu sızdırmazlık filmi ile kapatın.Ardından, enjeksiyon portu kapalı olacak ve aparat argon kaynağına açık olacak şekilde stopcock'u ayarlayın. Kabarcığı kapatın ve düşük basınçta argon'un beş dakika boyunca eylem odasından akmasına izin verin. Kabarcığı yeniden açtıktan sonra, atık şırınga olacak sentez sütununun dibine bir şırınga takın.Daha sonra, atık şırıngayı kullanarak argonu sütundan tekrar tekrar çekin ve ardından şırıngayı piston tamamen içeri itilerek tekrar takın. Bir reaktif veya çözücü eklemek için, kuru argon kaynağına bir iğne takın ve iğneyi şişe içeriğine batırmamaya dikkat ederek reaktif veya çözücü şişe septumuna yerleştirin. Daha sonra kuru bir şırıngayı bir iğne ile birleştirin ve şişe içeriğine batırmadan reaktif veya çözücü şişe septumuna yerleştirin.Daha sonra, şırıngayı argon ile doldurun, iğneyi septumdan çekin ve argonu dışarı atın. Şırıngayı argon ile doldurduktan ve bir kez daha dışarı attıktan sonra, şırıngayı argon basıncı altında gerekli miktarda çözücü veya reaktif ile doldurun. Stopcock'u, argon kaynağı kapalı ve enjeksiyon portu açık olacak şekilde ayarlayın.Aparat üzerindeki durdurma hızlı bir şekilde ayarlandıktan sonra, doldurulmuş şırıngayı ve iğneyi kaynak şişeden çıkarın, iğnenin yanına veya ucuna yapışmış çözücüleri silin ve ardından iğneyi enjeksiyon portuna yerleştirin. Bir reaktifi operatörlerin anti-odasına attıktan sonra, iğneyi çıkarın ve aparatı argon kaynağına yeniden açarken enjeksiyon portunu kapatın. Atık şırıngayı kullanarak sıvıyı anti-odacıktan sentez sütunu boyunca yavaşça çekin, böylece tüm sıvı artık atık şırıngada tutulur.Şimdi çözeltiyi yavaşça sentez sütununa geri iterek sütunda gaz kabarcığı olmadığından emin olun. Karıştırmak veya çalkalamak için, çözeltiyi atık şırınga ile sütunun üzerinde yavaşça yukarı ve aşağı çekin. Bir reaktifi veya çözücüyü kolondan çıkarmak için, çözeltiyi yavaşça atık şırıngaya çekin.Çözeltinin büyük kısmı atık şırıngaya geçtikten sonra, kalan çözücüyü kolondan temizlemek için argon'u çekin. Ardından, atık şırınga ekleminin etrafındaki balmumu sızdırmazlık filmini çıkarın. Ardından şırıngayı çıkarın ve atık çözeltisini atın.Daha sonra, atık şırıngayı yeni bir kuru şırınga ile değiştirin ve eklemi yeniden kapatın. Trifosforilasyon aparatını monte ettikten sonra, daha önce gösterildiği gibi anti-odaya 200 mikrolitre piridin dioksan ekleyerek trifosforilasyon reaksiyonuna başlayın. Ancak numuneyi henüz sentez kolonuna çekmeyin.SalPCl'yi makalede açıklandığı gibi dioksan içinde çözdükten sonra, anti-odaya ekleyin ve kuru bir şırınga kullanarak sentez kolonuna yükleyin. Daha sonra 15 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verin ve daha sonra daha önce gösterildiği gibi bir atık şırınga kullanarak SalPCl çözeltisini çıkarın ve atın. SalPCl çözeltisini çıkardıktan hemen sonra, anti-odaya 250 mikrolitre TBAP çözeltisi ekleyin ve sentez kolonuna yükleyin.20 dakika ajitasyonla tepki vermesine izin verin ve daha önce açıklandığı gibi atın. Daha sonra, kolonu 0.5 mililitre N, N-dimetilformamid, daha sonra 0.5 mililitre asetonitril ile yıkayarak her eklemeden sonra çözücüyü çıkardı. Oksitleyici çözeltisi ekledikten sonra, çıkarıldıktan ve gösterilen aynı prosedürü kullanarak kolonu tekrar asetonitril ile yıkadıktan sonra, aparatı sökün ve kolonu beş mililitre asetonitril ile yıkayın.Daha sonra sütunu kurutun. Trifosforile oligonükleotidi katı destekten ayırın ve makalede açıklandığı gibi standart protokolleri kullanarak korumayı ortadan kaldırın. Daha sonra, kurutulmuş korumasız oligonükleotidi üre yükleme tamponunda çözdü, 80 santigrat dereceye ısıtıldı, daha sonra bir poliakrilamid jel üzerine yüklendi ve 25 ila 35 watt'ta bir ila iki saat çalıştırıldı.Jel elektroforezinin sonunda, jel plakasını çıkardıktan sonra, sökün ve jeli polivinilklorür filmine sarın. Ardından, 254 nanometre UV ışığı ile arka gölgeleme yaparak ürün bantlarını tanımlayın ve bir tıraş bıçağı kullanarak ana ürün bandını çıkarın. Eksize edilmiş jeli plastik bir şırıngadan veya mekanik olarak ekstrüzyon yaparak ezin.15 nükleotidden daha kısa oligonükleotidler için, nükleaz içermeyen suyun jel hacminin üç katını ajitasyon veya sallama ile en az 12 saat boyunca süzün. Daha sonra çözeltiyi 0.2 mikrometre filtre ile donatılmış bir şırıngadan geçirerek katı jel parçalarını çıkarın ve liyofilizasyon ile konsantre edin. Konsantrasyonu takiben, artık tuzları ve selamları tek kullanımlık bir boyut dışlama sütunu kullanarak çıkarın ve daha önce gösterildiği gibi liyofilizasyon ile konsantre edin.Makalede açıklandığı gibi polimeraz ribozim ve L-RNA primer şablonu ve trifosfat trinükleotidleri içeren bir RNA çözeltisinin 10 mikrolitresini hazırladıktan sonra, bir dakika boyunca 90 santigrat dereceye ısıtarak ve bir PCR termosiklusunda saniyede 0.2 santigrat derecede 23 santigrat dereceye soğutarak tavlayın. RNA çözeltisini 17 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, reaksiyon ilerledikçe başlangıç tamponunun konsantrasyonunun iki katı 10 mikrolitre ekleyerek reaksiyonu durdurun, 10 mikrolitre alikot alın ve pH 8'de beş mikrolitre 0.5 molar EDTA ile söndürün ve her numuneyi RNA'yı makalede açıklandığı gibi izole etmek için işleyin. Çökeltilmiş RNA'yı 10 mikrolitre formalize jel yükleme tamponunda çözün ve metinde açıklandığı gibi reaksiyona girmemiş son etiketli astar hazırlayın.Numuneler hazırlandıktan sonra, 80 santigrat dereceye ısıtın. Her bir kuyucuğa numunenin beş mikrolitresini yükleyin ve jeli yaklaşık 40 dakika boyunca 40 watt'ta çalıştırın. Jel plakasını standdan çıkardıktan sonra, çapraz kiral L-RNA uzatma ürünlerini görselleştirmek için bir floresan veya fosforesan jel tarayıcı kullanarak tarayın.Jel saflaştırmadan sonra, UV arka gölgeleme, AAA ve CCC DNA düzelticiler ve GAA L-RNA trimeri için gösterildiği gibi tek bir ana ürün olarak 5'trifosfatın varlığını ortaya koymaktadır. 5'hidroksil yan ürün genellikle DNA düzelticiler için kütle spektrometrisi ile izole edilen ve tanımlanan daha yavaş bir göç bandı olarak görülebilir. Jel saflaştırma sırasındaki ek bantlar, saflaştırılmamış reaksiyon ürünlerinin kütle spektrometrisinde 5'difosfat, monofosfat ve H-fosfonat yan ürünleri ile ilişkilidir.5'trifosfat ürünleri, 5'di ve monofosfat kütleleri ile birlikte 5'trifosfata karşılık gelen birincil kütle zirvesini gösterir. Kimyasal olarak trifosfatla ilişkili L-RNA trinükleotidleri, PAGE tarafından analiz edilen ve bir floresan jel tarayıcı kullanılarak görüntülenen bir RNA polimerizasyon reaksiyonunda bir L-RNA primer ve L-RNA şablonu ile kullanıldı. Siyah dairelerle işaretlenmiş genişletilmiş ürün, şablon tarafından kodlanan çekiç kafalı ribozimin L-RNA versiyonunun sentezini gösterdi.Trifosforilasyon sırasında suya maruz kalmak verimi azaltacaktır. Kuru reaktifleri hazırlamak ve reaksiyon aparatını dikkatlice monte etmek için adımları izleyin. Contaların kırılmasını önlemek için sıvıları aparattan yavaşça hareket ettirin.Kimyasal trifosforilasyon, solak RNA da dahil olmak üzere biyolojik olmayan oligonükleotid trifosfatların hazırlanması için gereklidir. Bu, biyolojide bulunan RNA moleküllerinin ayna görüntüsü versiyonlarının çapraz kiral ribozim sentezini sağlamıştır.

chemical-triphosphorylation-of-oligonucleotides

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada tarif edilen protokol modifiye nükleosit trifosfat yol açan karmaşık güzergah yolunda çok sayıda engeller açıklamak ve kesintiye uğratmak için amaçlamaktadır. Dolayısıyla, bu protokol bu aktive bina bloklarının sentezini ve pratik uygulamalar için onların durumu hem de kolaylaştırır.

Nükleosid trifosfatlar - sentezinden Biyokimyasal Karakterizasyonu için

Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Bu makale, C2'- O -konumunda modifiye edilmiş RNA dodekamerlerinin katı faz sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu hakkında ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. UV-vis ve dairesiz dikroizyum fotometrik analizleri yapısal yönleri, yani tek telli veya çift telli elektronları ölçmek ve karakterize etmek için kullanılır.

Bir 2&#39;-amino asit içeren RNA Oligomerlerinin Katı Faz Sentezi Protokolü<em&gt; Ç</em&gt; Tiyofenilmetil Değiştirme ve Sirküler Dikroizm ile Karakterizasyonlar

Biz iletişim kuralları için bir sentez raporu ve peptit nükleik asit (PNA) reaksiyonlar birleşmeyle arıtma artıkları değiştirilebilir. RNA dubleks değiştirilmiş PNAs tarafından tanınması karakterizasyonu için Biyokimya ve biyofizik yöntemleri açıklanmıştır.

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

Belirli RNA dizilere protein gen ekspresyonu önemli rol oynarlar. Bu bağlama sitelerin detaylı karakterizasyonu gen düzenlemesi bizim anlamak için önemlidir. Burada, bir tek adım yaklaşım doygunluk mutagenesis RNA protein bağlayıcı sitelerin için kullanılmıştır. Bu yaklaşım RNA içinde tüm protein bağlayıcı siteleri için geçerlidir.

Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

Bu protokol, küçük DNA ve RNA yüzeyleri üzerinde polinükleotid kinazların (PNKs) kinaz aktivitesini ölçmek için radyoaktif olmayan bir testi tanımlar.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Burada, ligaz, nükleaz ve polimeraz enzimlerinin örnekleri kullanılarak nükleik asit metabolize edici enzimlerin tahlili için bir protokol sunulmaktadır. Test, enzim davranışının karakterizasyonuna izin veren, RNA ve/veya DNA hasarlarını veya yol ara ürünlerini taklit eden dupleksler oluşturmak için birleştirilebilen floresan etiketli ve etiketsiz oligonükleotidleri kullanır.

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Hematopoez için 3D kültür sistemi, insan kordon kanı ve lösemiye kemik iliği hücreleri kullanılarak anlatılmıştır. Metodu hücre dışı matris proteinlerine ile kaplanmış bir emici sentetik poliüretan iskele kullanımına dayanmaktadır. Bu yapı iskelesi hücreleri geniş bir uyum sağlamak için uyarlanabilir.

Normal ve Anormal İnsan Hematopoezin ex vivo Mimicry

Bu yazıda tek bir hücre analizi için bir mikroakışkan çip sunuyoruz. Bu sağlar: hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörler, ve floresan deneyleri veya bağışıklık aracılığıyla ikinci haberciler miktar.

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

Millifluidic Nanomalzemelere aygıtları, tepkime mekanizmaları ve sürekli akış kataliz zaman çözümlü bir analiz olarak kontrol edilen sentez için kullanılmaktadır.

Kimyasal Sentez ve Zaman-çözülmesi Mekanistiksel Çalışmaları Millifluidics

Öğrenin, salisil fosforokloridit ve pirofosfat kullanarak oligonükleotidlerin 5'-trifosforilasyonu için sağlam bir kimyasal yöntemi. Bu protokol, RNA, DNA ve L-RNA dahil çeşitli türlerde trifosforile oligonükleotid sentezi sağlar.

Oligonükleotidlerin Kimyasal Trifosforilasyonu

Daha fazla video keşfet