Entomopatojenik Nematodların Kültürlenmesi ve Genetik Olarak Manipüle Edilmesi

Entomopatojenik nematodu korumak ve arttırmak için etkili bir protokol, nematod patojenitesinin moleküler temelini ve konakçı anti-nematod bağışıklığını anlamak için gereklidir. Bu protokol, böcek konakçısı Galleria mellonella kullanarak çok sayıda simbiyotik ve aksenik Heterorhabditis bakteriyofora ve Steinernema carpocapsae IJ'leri üretmemizi sağlar. Petri kabını bir parça filtre kağıdı ile kaplayarak başlayın ve yaklaşık 10 ila 15 Galleria mellonella larvası ekleyin.

Bir pipet kullanarak, balmumu solucanlarına 10 mikrolitre süspansiyon başına yaklaşık 25 ila 50 enfektif genç içeren iki mililitre su dağıtın. Petri kabını oda sıcaklığında bir dolapta saklayın. Filtre kağıdının nemine bağlı olarak, her iki günde bir ila iki mililitre su ekleyin.

Enfektif yavrularla enfekte olmuş balmumu solucanları genellikle 48 saat içinde ölür. White'ın su tuzaklarını, balmumu solucanlarının enfektif yavrularla enfekte olmasından yaklaşık 10 gün sonra hazırlayın. Ölü böcekleri filtre kağıdının ıslatılmamış kısmına dikkatlice aktarın.

Alt Petri kabını doldurmak için musluk suyu kullanın ve havalandırma için bir ara parça olarak 15 mililitrelik bir tüp kapağı yerleştirin. Nematod kümelenmesini önlemek için demineralize veya deiyonize su yerine musluk suyu kullanın ve su tutucusundaki su seviyesinin Petri kabının yüksekliğinin yaklaşık yarısına ulaştığından emin olun. Küçük Petri kabındaki su nematodlar nedeniyle bulanıklaştığında, yeni nesil enfektif yavruları bir T25 veya T75 hücre kültürü şişesine taşımak için bir pipet kullanın.

Daha sonra,% 40'a kadar musluk suyu ekleyinhacim veya uygun yoğunluğa ulaşılana kadar. Ve nematod tıkanıklığını önlemek için hücre kültürü şişesini yatay olarak saklayın. Enfektif yavruların hücre kültürü şişelerine transferini ve enfektif yavrular yaklaşık üç ila beş gün içinde böcek karkaslarından çıkmayı bırakana kadar su ilavesini tekrarlayın.

Bir aşılama döngüsü kullanarak, donmuş bir Photorhabdus temperata Ret16 kültürünün birkaç pulunu bir MacConkey plakasına kazıyın ve tek koloniler için çizgi çizin. Plakayı iki ila üç gün boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, 50 mililitrelik bir tüpte MacConkey agar üzerinde bir koloni ile 10 mililitre LB suyunu aşılayın ve kültürü sallanan bir inkübatörde gece boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin.

Kuluçkadan sonra, 100 mililitrelik bir tüpten 100 mikrolitre gece kültürünü yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, daha sonra 100 gece kültürünü, 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde, 17.900 kez g'de, santrifüzyonla 900 mikrolitre tek mukavemetli PBS ile yıkayın. Süper natantı dekant. Daha sonra, kültürü tek mukavemetli PBS'de 10 kez seyreltin ve tüpü buz üzerinde bırakın.

Şimdi, balmumu solucanlarını% 70'lik bir etanol çözeltisine batırın. Böcekleri bir kağıt havluyla kuruttuktan sonra, onları 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Balmumu solucanlarını hareketsiz hale getirmek için tüpü 20 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.

Petri kabının üst ve alt yarısını örtmek için filtre kağıdı kullanın. Filtre kağıdı ile kaplı Petri kabı kapağını enjeksiyon için temel destek olarak kullanın. Alt Petri kabının filtre kağıdını nemlendirin ve enjekte edilen balmumu solucanlarının iyileşmesine yardımcı olmak için buz üzerine aktarın.

Bir parça Parafilm üzerinde 50 mikrolitre buz gibi soğuk bakteri pipeti, daha sonra 22 gauge rafineri iğne şırıngası hazırlayın ve iğnenin ucundaki havayı çıkarmak için pistona hafifçe basın. Bir balmumu solucanını stereoskop altında arka uca yakın tutmak. Bakteri kültürünü toraksın dorsal tarafına enjekte edin.

Tercihen, iç hasarı en aza indirmek ve larva gövdesinin nasıl şişmeye başladığına dikkat etmek için balmumu solucanına paralel kütikülün hemen altındaki iki segment arasındaki kavşakta. Daha sonra, enjekte edilen böcekleri kurtarma Petri kabına aktarın. Ve tüm böcekler enjekte edildikten ve kurtarma kabına yerleştirildikten sonra, Petri kabını karanlıkta yerleştirin.

Balmumu solucanları enjeksiyondan iki gün sonra yenik düşer ve yaklaşık üç ila dört gün sonra tuğla kırmızısı görünür. Bununla birlikte, kahverengi renkli böcekler başarısız bakteriyel enfeksiyonu gösterir. Enfeksiyondan yedi gün sonra, karakteristik tuğla kırmızısı renkteki böcekleri Petri kabı kaplı taze bir filtre kağıdına aktarın ve simbiyotik nematod enfektif yavruların üretimini tekrarlayın.

Yüzey sterilizasyonuna başlamak için, santrifüjleme yoluyla yeterli simbiyotik, Heterorhabditis bakteriyofora ve aday aksenik enfektif gençleri toplayın. 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpünde bir pelet yapmak için, her bir mikrosantrifüj tüpündeki pelet için 500 mikrolitre% 5 ağartıcı ekleyin ve tüpü ters çevirin. 10 dakika inkübe ettikten sonra, bir dakika boyunca 17.900 kez g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.

Daha sonra peleti bir mililitre steril suyla yıkayın. Santrifüj yapın, süpernatantı çıkarın ve bu prosedürü dört kez daha tekrarlayın. Grafik, eksenizasyondan geçen Heterorhabditis bacteriophora nematodlarının durumunu değerlendirmenin sonuçlarını göstermektedir.

Stok kültüründen heterorhabditis bakteriyofora, simbiyotik Photorhabdus luminescens hücrelerini taşıyordu. Bununla birlikte, ilişkili Photorhabdus luminescens bakterilerinden yoksun nematodlar aksenikti. Deneyinizin tekrarlanabilirliğini korumak için, her zaman taze bir koloniden gelen bakteriyel stok kültüründen taze bir şekilde çizgi çizin ve sabit yüze ulaşmadan önce gece kültürünü çıkarın.

White'ın su tuzağı için sadece tuğla kırmızısı Galleria balmumu solucanını kullanın ve gerisini atın. Bu işlemden sonra, nematodlar böcek bağışıklık sistemi ile etkileşimi araştırmak için kullanılabilir. Bu teknik, araştırmacıların nematod parazitizminin moleküler temelini ve konakçı anti-nematod bağışıklığını keşfetmelerinin yolunu açmaktadır.