Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

Aktin bağlayıcı proteinlerin aktin filamentlerinin montajını ve sökülmesini nasıl düzenlediğini incelemek için floresan mikroskobunu mikroakışkanlarla birleştiriyoruz. Mikroakışkanlarla, onlarca bireysel aktin filamentinde meydana gelen reaksiyonları aynı anda ölçebilir, aynı zamanda biyokimyasal ve mekanik koşulları hassas bir şekilde kontrol edebiliyoruz. Çözeltilerin ilk önce hazneye ulaşana kadar paralel olarak enjekte edildiğini ve daha sonra basınç ayarını değiştirerek filamentlerin her çözeltiye sırayla maruz bırakıldığını unutmayın.

Polidimetilsiloksan veya PDMS, oda tertibatının hazırlanmasına başlamak için, sıcak plakayı 100 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Temizlenmiş bir PDMS haznesini ve temiz bir Petri kabındaki bir cam kapak kaymasını derin bir UV temizleyicide üç ila beş dakika boyunca ultraviyole ışığa maruz bırakın. İşiniz bittiğinde, PDMS odasını kapak kayması üzerine yerleştirin, böylece doğrudan UV'ye maruz kalan iki yüzey temas eder.

PDMS kapak kayma arayüzünde sıkışan hava kabarcıklarını gidermek için, odanın yüzeyine parmağınızla hafifçe bastırın. Köşelere ve yanlara kuvvetlice bastırarak odanın tavanının cam yüzeyle temas etmemesini sağlayın. Odayı, cam tabanı sıcak plakaya bakacak şekilde beş dakika boyunca 100 santigrat dereceye yerleştirin.

Sonra odayı hemen kullanın veya bir hafta boyunca temiz bir Petri kabında saklayın. Giriş ve çıkış borusunu durulamak için, bir adet 2 mililitrelik rezervuar tüpünü 300 mikrolitre F-tamponu ile doldurun, mikroakışkan tutucuya vidalayın ve basıncı 300 milibara ayarlayın. Beş ila sekiz damla F-tamponunun boşa gitmesine izin verin, ardından basıncı sıfıra ayarlayın ve prosedürü her kanal için tekrarlayın.

Daha sonra, rezervuar borusu üzerindeki çıkışın basıncını dört ila 50 milibar olarak ayarlayın, boru ucundan bir damlacık çıktığında, boruyu PDMS odasının çıkışına bağlayın. Sıvı odayı doldururken ve tüm girişlerden çıkarken, çıkış basıncını 20 milibara ayarlayın. Daha sonra, rezervuar tüpünün basıncını 1 ila 50 milibar olarak ayarlayın.

Hava kabarcıklarının ortaya çıkmasını önlemek için, boruyu girişe bağlamadan önce borudan ve PDMS girişinden bir damlacık çıktığından emin olun. Girişin basıncını 30 milibara ayarlayın. Girişleri gösterildiği gibi iki ve üç girişe bağladıktan sonra, tüm girişlerin basıncını 20 milibara ve çıkış basıncını sıfır milibara ayarlayın.

Girişlerdeki akış hızlarının kabaca eşit olduğundan emin olun. Rezervuarı değiştirirken, tüm giriş basınçlarını 12 milibara ve çıkış basıncını 5 milibara ayarlayın. Bir çözeltiyi hızlı bir şekilde enjekte etmek için, karşılık gelen girişin basıncını 150 milibara ayarlayın ve diğer girişlerdeki basıncı yaklaşık 100 milibara ayarlayın, böylece girişlerde ortaya çıkan akış hızı dakikada 500 nanolitredir.

Çözeltiyi değiştirmek için, çözeltinin 200 ila 300 mikrolitresini yeni bir rezervuar tüpüne doldurun ve basıncı değişim ayarına ayarlayın. Ardından, girişin rezervuar tüpünü sökün. Boru ucunda küçük bir damlacık oluştuktan sonra, yeni tüpe taze çözelti ile vidalayın, basınç ayarını yüksek akışa değiştirin.

Mikroakışkan konfigürasyona ve bir oda geometrisine bağlı olarak, çözeltinin boruyu doldurması ve odaya ulaşması için üç ila beş dakika bekleyin. İşlemi, zaman içinde floresandaki artışı ölçerek takip edilebilir. Yüzey fonksiyonelleştirmesi için, F tamponunda çözeltiyi üç ila 200 mikrolitre 50 pikomolar spektrin-aktin tohumu olarak değiştirin ve çözeltiyi iki dakika boyunca yüksek akışlı üç ile enjekte edin.

Yüzey pasivasyonu için, F-tamponunda 300 mikrolitre% 5 BSA ile üçüncü tüpü değiştirin, daha sonra, yüksek akışlı üçünde beş dakika boyunca enjekte edin, ardından orta akış üçünde beş dakika, dakikada 100 nanolitrelik bir karşı akış elde etmek için bir ve iki kanalda yedi ila sekiz milibar basınç düşürülür. Tüm oda yüzeyi BSA pasifleştirilecektir. Kanalı yüksek akışlı üçünde beş dakika boyunca durulamak için üçüncü tüpü F-tamponuna değiştirin.

Daha sonra, makalede açıklandığı gibi, tüpleri sırasıyla bir mikromolar aktin profilin, 0.15 mikromolar aktin ve F tamponu ile bir ila üç arasında değiştirin ve üç ila dört dakika boyunca önceden ayarlanmış yüksek akışlı çözeltileri kullanarak taze hazırlanmış çözeltileri enjekte edin. Mikroskopu açın ve görüntüleri 60X hedefle yakalamak için kamera pozlama süresini 100 ila 200 milisaniyeye, uyarma lazerini% 10 ila% 20 güce ve toplam dahili yansıma floresansını veya TIRF derinliğini 200 ila 300 nanometreye ayarlayın. Ardından, filament polimerizasyonunu her 20 saniyede bir kare hızında kaydetmek için basınç ayarını 10 dakika boyunca orta akışa ayarlayın, ardından filament yaşlanması için 15 dakika boyunca orta akış iki yapın.

Epifloresan modunda depolimerizasyonu her beş saniyede bir karede yakalayın, bir ila iki kare sonra, saniyede yaklaşık 10 alt birimde depolimerize olan filamentleri kaydetmek için orta akışlı üçe geçin. Deneyi sıfırlamak için, floresan olarak etiketlenmiş tüm filamentleri, iki dakika boyunca maksimum güçte sürekli olarak lazere maruz bırakarak kırın. Bir, iki veya üç çözeltiyi değiştirerek ve bunları üç ila dört dakika boyunca yüksek akışta enjekte ederek farklı koşulları test edin.

Temel polimerizasyon/depolimerizasyon deneyinin sonucu burada sunulmuştur. Elde edilen kimograflar, polimerizasyon ve depolimerizasyon oranlarını ölçmek için kullanıldı. Yetiştirilen aktin filamentleri floresan olarak etiketlenmiş bir kofilin çözeltisine maruz bırakıldığında, kofilin kümeleri çekirdeklendirildi ve sivri ve dikenli uçlara doğru büyüdü.

Tek filamentler büyülenmeye maruz kaldıklarında, daha parlak görünen ve akışla mükemmel bir şekilde hizalanmayan demetler oluştururlar. Tüpleri değiştirirken sisteme hava kabarcıkları girmekten kaçınmak ve rezervuar tüplerini boşaltmamaya dikkat etmek çok önemlidir. Bu teknik, onlarca tek filamentin üzerine çekme kuvvetleri uygulamak, formin ve kofilin mekanik hassasiyetine bakmak ve ARP2/3 dallanma açmak için kritik öneme sahipti.