Name: Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Öğrenin, mikroakışkanlar ve floresan mikroskobu kullanarak aktin filamentlerinin montaj dinamiğini nasıl inceleyeceğinizi. Bu yöntem, aktin bağlayıcı proteinlerin etkilerini gerçek zamanlı olarak nicelendirmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

B. Ladoux ve R.-M.'ye minnettarız. UV temizleyici ekipmanlarının kullanımı için Mège laboratuvarı ve J. Heuvingh ve 0. du Roure, silikon gofretler üzerinde kalıp hazırlama ve mikroakışkanlar hakkında ipuçları sağlama konusunda aldığımız ilk eğitim için. Avrupa Araştırma Konseyi Grant StG-679116 (A.J.'ye) ve Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin and Conformin'den (G.R.-L.) gelen fonları kabul ediyoruz.

<ol><li>Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celebrating+20+years+of+live+single-actin-filament+studies+with+five+golden+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).</li>
<li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li>
<li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li>
<li>Jégou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+actin+filaments+in+a+microfluidic+flow+reveal+the+mechanism+of+ATP+hydrolysis+and+give+insight+into+the+properties+of+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001161(2011).</li>
<li>Gicquel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chips+for+in+situ+crystal+x-ray+diffraction+and+in+situ+dynamic+light+scattering+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133(2018).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).</li>
<li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li>
<li>Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+biochemical+characterization+of+cytokinesis+actin-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).</li>
<li>Funk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+and+formin+constitute+a+pacemaker+system+for+robust+actin+filament+growth%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth.</a> eLife. 8, 50963(2019).</li>
<li>Pandit, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+phosphate+release+from+Arp2%2F3+complex+promote+dissociation+of+actin+filament+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).</li>
<li>Wioland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2FCofilin+accelerates+actin+dynamics+by+severing+filaments+and+promoting+their+depolymerization+at+both+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends.</a> Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).</li>
<li>Pollard, T. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+actin+polymerization+rate+constants+by+electron+microscopy+of+actin+filaments+nucleated+by+isolated+microvillus+cores%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores.</a> The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).</li>
<li>Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+assembly+of+ATP-+and+ADP-actin+by+formins+and+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin.</a> Cell. 124 (2), 423-435 (2006).</li>
<li>Jégou, A., Carlier, M. -F., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formin+mDia1+senses+and+generates+mechanical+forces+on+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments.</a> Nature Communications. 4, 1883(2013).</li>
<li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rocket+launcher+mechanism+of+collaborative+actin+assembly+defined+by+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging.</a> Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).</li>
<li>Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+modulates+actin+filament+polymerization+mediated+by+formin+and+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).</li>
<li>Niedermayer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+depolymerization+of+actin+filaments+is+caused+by+photo-induced+dimerization+of+actin+protomers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).</li>
<li>Gateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomyosin+isoforms+specify+functionally+distinct+actin+filament+populations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro.</a> Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).</li>
<li>Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+dynamic+behavior+of+fascin+in+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 103, Pt 2 2747-2754 (1986).</li>
<li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsional+stress+generated+by+ADF%2Fcofilin+on+cross-linked+actin+filaments+boosts+their+severing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).</li>
<li>Colombo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+family+of+fluorescent+nucleotide+analogues+to+investigate+actin+dynamics+and+energetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics.</a> Nature Communications. 12 (1), 548(2021).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+single+filament+assay+to+study+formin+control+of+actin+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).</li>
<li>Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+biochemical+characteristics+of+the+two+human+profilin+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms.</a> European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).</li>
<li>Lin, D. C., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+induced+by+a+motility-related+high-affinity+cytochalasin+binding+complex+from+human+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).</li>
<li>Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+initial+characterization+of+a+protein+from+skeletal+muscle+that+caps+the+barbed+ends+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).</li>
<li>Kremneva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin-2+controls+actin+filament+length+in+muscle+sarcomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres.</a> Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).</li>
<li>Le Clainche, C., Carlier, M. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+motility+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin-based motility assay.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 12 1-20 (2004).</li>
<li>Vignjevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+filopodia-like+bundles+in+vitro+from+a+dendritic+network%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).</li>
<li>Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+size+of+the+EB+cap+determines+instantaneous+microtubule+stability%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability.</a> eLife. 5, 13470(2016).</li>
<li>Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+aging+probed+by+microfluidics-assisted+tubulin+washout%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).</li>
<li>Suzuki, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometrical+constraints+greatly+hinder+formin+mDia1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity.</a> Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).</li>
<li>Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+of+microfluidics+to+study+actin+biochemistry+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Aktin filamentlerinin uzunlukları boyunca birden fazla nokta ile yüzeye tutturulduğu veya metilselüloz gibi bir kalabalık ajan tarafından yüzeye yakın tutulduğu standart tek filament yöntemleriyle karşılaştırıldığında, mikroakışkanlar bir dizi avantaj sunar. Yüzeyle etkileşimler minimum olduğundan, bu etkileşimlerin hem uzama hem de depolimerizasyon sırasında neden olabileceği yapay duraklamalardan kaçınılır. Filamentler, birbirlerine paralel olarak akış tarafından hizalanır, izlenmelerini ve uzunluklarının ölçülmesini k...

Aktin filamentlerinin ve aktin filament ağlarının montajı ve sökülmesi, çeşitli biyokimyasal reaksiyonlarla kontrol edilir ve mekanik bağlama bağlıdır. Bu karmaşık mekanizmalar hakkında fikir edinmek için, bireysel filamentler üzerindeki bireysel reaksiyonları (yeterince büyük sayılarda) gözlemleyebilmek paha biçilmezdir. Son yıllarda, dinamik aktin filamentlerinin gerçek zamanlı olarak, çoğunlukla toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak gözlemlenmesi, anahtar bir teknik olarak ortaya çıkmış ve toplu çözelti biyokimyasal tahlilleri ile elde edilemeyen sonuçların etkileyici bir listesini sağlamıştır1.
Bunu başarmak için, floresan olarak etiketlenmiş aktin filamentlerini mikroskop kapağının yüzeyine yakın tutmak ve bunları floresan olarak etiketlenebilen aktin bağlayıcı proteinlerin (ABP'ler) çözeltilerine maruz bırakmak gerekir. Bunu yapmak, iyi kontrol edilen biyokimyasal koşullarda bireysel filamentlerde meydana gelen olayları izlemek ve böylece reaksiyon hızlarını ölçmek için bir araç sağlar. Bununla birlikte, bir dizi özel sınırlama dikkate alınmalıdır. Filamentlerin yüzeye yakın yapay olarak korunması, genellikle birden fazla sabitleme noktası sayesinde veya metilselüloz gibi bir kalabalık ajan kullanarak, davranışlarını değiştirebilir (örneğin, polimerizasyon ve depolimerizasyonda duraklamalara neden olabilir2). Her bir filamentin konturunu izlemek, özellikle de zaman içinde görüş alanında yeni filamentler veya filament parçaları birikirse, zor olabilir. Reaksiyonlar, aktin monomerlerinin ve ABP'lerin konsantrasyonunun zamanla değişebileceği sonlu bir hacimde gerçekleşir ve potansiyel olarak doğru hız sabitlerinin elde edilmesini zorlaştırır. Son olarak, ABP'lerin çözeltisinin yenilenmesi veya değiştirilmesi 30 saniyeden daha kısa sürede elde etmek zordur ve genellikle numunede homojen olmayan protein içeriğine yol açacaktır.
10 yıldan biraz daha uzun bir süre önce, bireysel Deoksiribonükleik Asit (DNA) iplikçikleri3'ü incelemek için zaten yapılanlardan esinlenerek, bireysel aktin filamentlerini gözlemlemek ve manipüle etmek için mikroakışkanlara dayanan yeni bir teknik sunduk4. Klasik tek filament tekniklerinin yukarıda belirtilen sınırlamalarını aşmaya izin verir. Bu mikroakışkan tahlillerinde, aktin filamentleri, kapak kayması üzerine adsorbe edilen spektrin-aktin tohumlarından yetiştirilir. Filamentler böylece bir uçtan sadece mikroakışkan odanın dibine sabitlenir ve yapışmadan yüzeyin üzerinde dalgalanır. Filamentler, gelen çözeltilerin akışıyla aynı hizadadır, böylece kontur uzunluklarının izlenmesini kolaylaştırır ve bunları TIRF'nin kullanılabileceği kapak kaymasının üzerindeki sığ bir bölgede tutar. Farklı çözeltiler aynı anda karıştırmadan odaya akar ve filamentler bunlara sırayla ve hızlı bir şekilde maruz bırakılabilir.
Burada, laboratuvarda tek aktin-filament mikroakışkan testleri oluşturmak için bir dizi temel protokol öneriyoruz. Kapaklar ve mikroakışkan odaları önceden hazırlanabilir (yarım gün içinde) ve birkaç biyokimyasal koşulun test edilebileceği deneyin kendisi bir günden daha kısa sürede yapılır.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Kazein</td><td>Merck</td><td>C6905</td><td>8 mg / mL'de kullanılır</td></tr><tr><td>Biyopsi zımbası (pistonlu)</td> <td>Ted Pella</td><td>15115-2</td><td>ID 0.75 mm, OD 1.07 mm</td></tr><tr><td>Biotin-BSA</td><td>Merck</td><td>A8549</td><td>1 mg / mL'de kullanılır</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>A8022</td><td>50 mg / mL'de kullanılır</td></tr><tr><td>Mini-Rack Teflon tutucu</td><td>Invitrogen</td><td>C14784</td><td>8 için lameller</td></tr><tr><td>Lameller 22x40mm Kalınlık #1.5</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td>631-1370</td><td></td></tr><tr><td>f-tamponunda</td><td>DABCO</td><td>Merck</td><td>D27802</td> bileşeni</tr><tr><td>DTT</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-D</td><td>f-tamponunda</td></tr><tr><td>bileşen Ester NHS Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A20000</td><td>Lys328 üzerinde aktin etiketlemesi için florofor.</td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21338</td><td>Lys328</td></tr><tr><td>Hellmanex III Hellma</td><td></td><td>9-307-011-4-507</td><td>Cam temizleme deterjanı</td></tr> üzerinde aktini biyotinillemek için <tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>N/</td><td>A açık kaynaklı yazılım</td></tr><tr><td>Laboport</td><td>KNF</td><td>811kn.18</td><td>vakum pompası (nihai vakum: 240 mbar)</td></tr><tr><td>Sihirli görünmez bant</td><td>Scotch</td><td>7100024666</td><td>standart şeffaf ofis bandı</td></tr><tr><td>Micrewtube</td><td>Simport</td><td>T341-6T</td><td>2 mL mikroakışkan rezervuar tüpleri</td></tr><tr><td>Mikroakışkan cihaz Bölüm 1: Akış Ünitesi S</td><td>Fluigent</td><td>FLU-S-D-PCKB</td><td>Akış Ölçer</td></tr><tr><td>Mikroakışkan cihaz Bölüm 2: Fluiwell-4C-2 mL</td><td>Fluigent</td><td>14002001PCK</td><td>Rezervuar tutucu</td></tr><tr><td>Mikroakışkan cihaz Bölüm 3: MFCS-EZ</td><td>Fluigent</td><td>EZ-11000001 EZ-00345001</td><td>Basınç kontrol cihazı</td></tr><tr><td>Model 42 - UVO-Cleaner</td><td>Jelight Inc.</td><td>42-220</td><td>Ultraviyole temizleyici</td></tr><tr><td>N6- (6-Aminoheksil) -ATP-ATTO-488</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-805-488</td><td>ATP-ATTO, aktin</td></tr><tr><td>nötravidinini</td> etiketlemek için kullanılır <td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>PLL-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td><td>PBS'de 1 mg / mL'de kullanın.</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS) Sylgard 184 Silikon Elastomer</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td>PDMS tabanı ve sertleştirici</td></tr><tr><td>içerir Polietereterketon (PEEK) boru</td><td>Merck</td><td></td> <td>Z226661" Mavi" : İç Çap = 0.25 mm</td></tr><tr><td>Güvenlik üfleme tabancası</td><td>Bobin Hortumu Pnömatikler</td><td>700-S</td><td>filtrelenmiş hava</td></tr><tr><td>Silikon boru</td><td>VWR</td><td>228-0701P</td><td>PEEK'i kuplöre bağlayın</td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik kateter kuplörü</td><td>Prime Bioscience</td><td>SC22/15</td><td>PEEK borularına bağlanmak için PDMS girişlerine ve çıkışına takılır</td></tr><tr><td>Termoplastik film</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PM996</td><td>Standart "parafilm" </td></tr><tr><td>Ultra saf etanol</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik temizleme banyosu</td><td>VWR</td><td>USC200TH</td><td>1 L beherleri yerleştirmek için</td></tr><tr><td>PDMS'nin veya çözeltilerin gazını almak için</td> <td>vakumlu</td> kurutucu <td>SP Bel-Art</td><td>F42022-0000</td></tr></tbody></table>

tek aktin filamentlerin ve demetlerin montaj dinamiğini İncelemek için mikroakışkanlar ve floresan mikroskobu kullanma

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Aktin filamentlerinin montajını ve sökülmesini düzenleyen karmaşık moleküler mekanizmaları deşifre etmek için, iyi kontrol edilen koşullarda yaşayan bireysel reaksiyonları izlemek büyük bir varlıktır. Bunu yapmak için, son 20 yılda, çoğunlukla toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak canlı tek filament deneyleri ortaya çıkmış ve bir dizi önemli sonuç sağlamıştır. 2011 yılında, bu deneylerin olanaklarını daha da genişletmek ve tekrarlayan sorunlu eserlerden kaçınmak için, bu testlere basit mikroakışkanlar getirdik. Bu çalışma, bireysel aktin filamentlerinin pasifleştirilmiş örtü kayma yüzeyine bir ucuyla tutturulduğu, akışla hizalandığı ve farklı protein çözeltilerine art arda maruz bırakılabildiği temel protokolümüzü detaylandırmaktadır. Ayrıca belirli uygulamalar için protokolleri sunuyoruz ve akan çözeltinin viskoz sürtünmesi sayesinde kontrollü mekanik kuvvetlerin nasıl uygulanabileceğini açıklıyoruz. Bu deneylerin teknik uyarılarını vurguluyoruz ve bu tekniğe dayanan olası gelişmeleri kısaca sunuyoruz. Bu protokoller ve açıklamalar, günümüzde kullanımı kolay mikroakışkan ekipmanlarının mevcudiyeti ile birlikte, uzman olmayanların bu testi laboratuvarlarında uygulamalarına izin vermelidir.

Yukarıda açıklanan tüm deneyler için, floresan olarak etiketlenmiş aktin filamentleri, yüzeyden düşük arka plan floresansının göstergesi olan iyi kontrastla açıkça görülebilmelidir (Şekil 4, yaygın sorunların giderilmesi için Ek Dosya 1'e bakınız). Aktin filamentleri de yüzeye yapışmamalıdır: baskın akış hızı düşük olduğunda, aktin filamentlerinin yanal dalgalanmaları, onları canlı olarak gözlemlerken algılanabilir olmalı ve birinin sadece uçlarından biri tarafından demirlen...

Basit aktin filament mikroakışkan tahlilleri için, floresan mikroskobu ile birlikte, bireysel aktin filamentlerini gerçek zamanlı olarak doğru bir şekilde izlemeyi ve sırayla farklı protein çözeltilerine maruz bırakmayı sağlayan protokoller sunuyoruz.

Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Aktin bağlayıcı proteinlerin aktin filamentlerinin montajını ve sökülmesini nasıl düzenlediğini incelemek için floresan mikroskobunu mikroakışkanlarla birleştiriyoruz. Mikroakışkanlarla, onlarca bireysel aktin filamentinde meydana gelen reaksiyonları aynı anda ölçebilir, aynı zamanda biyokimyasal ve mekanik koşulları hassas bir şekilde kontrol edebiliyoruz. Çözeltilerin ilk önce hazneye ulaşana kadar paralel olarak enjekte edildiğini ve daha sonra basınç ayarını değiştirerek filamentlerin her çözeltiye sırayla maruz bırakıldığını unutmayın.Polidimetilsiloksan veya PDMS, oda tertibatının hazırlanmasına başlamak için, sıcak plakayı 100 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Temizlenmiş bir PDMS haznesini ve temiz bir Petri kabındaki bir cam kapak kaymasını derin bir UV temizleyicide üç ila beş dakika boyunca ultraviyole ışığa maruz bırakın. İşiniz bittiğinde, PDMS odasını kapak kayması üzerine yerleştirin, böylece doğrudan UV'ye maruz kalan iki yüzey temas eder.PDMS kapak kayma arayüzünde sıkışan hava kabarcıklarını gidermek için, odanın yüzeyine parmağınızla hafifçe bastırın. Köşelere ve yanlara kuvvetlice bastırarak odanın tavanının cam yüzeyle temas etmemesini sağlayın. Odayı, cam tabanı sıcak plakaya bakacak şekilde beş dakika boyunca 100 santigrat dereceye yerleştirin.Sonra odayı hemen kullanın veya bir hafta boyunca temiz bir Petri kabında saklayın. Giriş ve çıkış borusunu durulamak için, bir adet 2 mililitrelik rezervuar tüpünü 300 mikrolitre F-tamponu ile doldurun, mikroakışkan tutucuya vidalayın ve basıncı 300 milibara ayarlayın. Beş ila sekiz damla F-tamponunun boşa gitmesine izin verin, ardından basıncı sıfıra ayarlayın ve prosedürü her kanal için tekrarlayın.Daha sonra, rezervuar borusu üzerindeki çıkışın basıncını dört ila 50 milibar olarak ayarlayın, boru ucundan bir damlacık çıktığında, boruyu PDMS odasının çıkışına bağlayın. Sıvı odayı doldururken ve tüm girişlerden çıkarken, çıkış basıncını 20 milibara ayarlayın. Daha sonra, rezervuar tüpünün basıncını 1 ila 50 milibar olarak ayarlayın.Hava kabarcıklarının ortaya çıkmasını önlemek için, boruyu girişe bağlamadan önce borudan ve PDMS girişinden bir damlacık çıktığından emin olun. Girişin basıncını 30 milibara ayarlayın. Girişleri gösterildiği gibi iki ve üç girişe bağladıktan sonra, tüm girişlerin basıncını 20 milibara ve çıkış basıncını sıfır milibara ayarlayın.Girişlerdeki akış hızlarının kabaca eşit olduğundan emin olun. Rezervuarı değiştirirken, tüm giriş basınçlarını 12 milibara ve çıkış basıncını 5 milibara ayarlayın. Bir çözeltiyi hızlı bir şekilde enjekte etmek için, karşılık gelen girişin basıncını 150 milibara ayarlayın ve diğer girişlerdeki basıncı yaklaşık 100 milibara ayarlayın, böylece girişlerde ortaya çıkan akış hızı dakikada 500 nanolitredir.Çözeltiyi değiştirmek için, çözeltinin 200 ila 300 mikrolitresini yeni bir rezervuar tüpüne doldurun ve basıncı değişim ayarına ayarlayın. Ardından, girişin rezervuar tüpünü sökün. Boru ucunda küçük bir damlacık oluştuktan sonra, yeni tüpe taze çözelti ile vidalayın, basınç ayarını yüksek akışa değiştirin.Mikroakışkan konfigürasyona ve bir oda geometrisine bağlı olarak, çözeltinin boruyu doldurması ve odaya ulaşması için üç ila beş dakika bekleyin. İşlemi, zaman içinde floresandaki artışı ölçerek takip edilebilir. Yüzey fonksiyonelleştirmesi için, F tamponunda çözeltiyi üç ila 200 mikrolitre 50 pikomolar spektrin-aktin tohumu olarak değiştirin ve çözeltiyi iki dakika boyunca yüksek akışlı üç ile enjekte edin.Yüzey pasivasyonu için, F-tamponunda 300 mikrolitre% 5 BSA ile üçüncü tüpü değiştirin, daha sonra, yüksek akışlı üçünde beş dakika boyunca enjekte edin, ardından orta akış üçünde beş dakika, dakikada 100 nanolitrelik bir karşı akış elde etmek için bir ve iki kanalda yedi ila sekiz milibar basınç düşürülür. Tüm oda yüzeyi BSA pasifleştirilecektir. Kanalı yüksek akışlı üçünde beş dakika boyunca durulamak için üçüncü tüpü F-tamponuna değiştirin.Daha sonra, makalede açıklandığı gibi, tüpleri sırasıyla bir mikromolar aktin profilin, 0.15 mikromolar aktin ve F tamponu ile bir ila üç arasında değiştirin ve üç ila dört dakika boyunca önceden ayarlanmış yüksek akışlı çözeltileri kullanarak taze hazırlanmış çözeltileri enjekte edin. Mikroskopu açın ve görüntüleri 60X hedefle yakalamak için kamera pozlama süresini 100 ila 200 milisaniyeye, uyarma lazerini% 10 ila% 20 güce ve toplam dahili yansıma floresansını veya TIRF derinliğini 200 ila 300 nanometreye ayarlayın. Ardından, filament polimerizasyonunu her 20 saniyede bir kare hızında kaydetmek için basınç ayarını 10 dakika boyunca orta akışa ayarlayın, ardından filament yaşlanması için 15 dakika boyunca orta akış iki yapın.Epifloresan modunda depolimerizasyonu her beş saniyede bir karede yakalayın, bir ila iki kare sonra, saniyede yaklaşık 10 alt birimde depolimerize olan filamentleri kaydetmek için orta akışlı üçe geçin. Deneyi sıfırlamak için, floresan olarak etiketlenmiş tüm filamentleri, iki dakika boyunca maksimum güçte sürekli olarak lazere maruz bırakarak kırın. Bir, iki veya üç çözeltiyi değiştirerek ve bunları üç ila dört dakika boyunca yüksek akışta enjekte ederek farklı koşulları test edin.Temel polimerizasyon/depolimerizasyon deneyinin sonucu burada sunulmuştur. Elde edilen kimograflar, polimerizasyon ve depolimerizasyon oranlarını ölçmek için kullanıldı. Yetiştirilen aktin filamentleri floresan olarak etiketlenmiş bir kofilin çözeltisine maruz bırakıldığında, kofilin kümeleri çekirdeklendirildi ve sivri ve dikenli uçlara doğru büyüdü.Tek filamentler büyülenmeye maruz kaldıklarında, daha parlak görünen ve akışla mükemmel bir şekilde hizalanmayan demetler oluştururlar. Tüpleri değiştirirken sisteme hava kabarcıkları girmekten kaçınmak ve rezervuar tüplerini boşaltmamaya dikkat etmek çok önemlidir. Bu teknik, onlarca tek filamentin üzerine çekme kuvvetleri uygulamak, formin ve kofilin mekanik hassasiyetine bakmak ve ARP2/3 dallanma açmak için kritik öneme sahipti.

using-microfluidics-fluorescence-microscopy-to-study-assembly

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Zaman atlamalı Mikroskopi Sökme Aktin İzlenmesi

Bu videoda, aktin ve mikrotübül polimerizasyon dinamiklerini görselleştirmek için toplam iç yansıma mikroskobu tabanlı bir teknik olan TIRF açıklanmaktadır. Yöntem, hücresel karışmaları anlamak için gerekli olan aktin ve mikrotübül eşleşme dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin verir.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğini Görselleştirmek için TIRF Mikroskobu

Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Biz moleküler mekikler, kurmak için bir protokol nerede yüzeye yapıştırılır kinesin motor proteinler boya etiketli mikrotübüller itmek mevcut. Kinesins yüzeyi ile zayıf etkileşimler tersinir kendi eki sağlar. Bu dinamik montaj ve demontaj bir bileşen işlevselliğini korurken sergileyen bir nano sistemi oluşturur.

Moleküler mekikler Powered by geri dönülebilir olarak montaj Kinesins bağlı

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Aktomiyozin demetlerinin in vitro oluşumu ve optik cımbız kullanılarak miyozin topluluk kuvveti oluşumunun ölçülmesi sunulmuş ve tartışılmıştır.

Optik Cımbız Kullanarak Aktin Filament Demetlerinde Myosin Topluluk Mekaniğinin İncelenmesi

Burada, mikrotübül demetlerini in vitro olarak yeniden yapılandırmak ve eşzamanlı optik yakalama ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak içlerinde uygulanan kuvvetleri doğrudan ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, aktif mikrotübül ağları içindeki protein toplulukları tarafından üretilen kuvvetlerin ve yer değiştirmelerin nano ölçekte ölçülmesine izin verir.

Yeniden yapılandırılmış aktif mikrotübül demetleri içindeki kuvvetleri doğrudan ölçme

Bu protokol, in vitro toplam iç floresan (TIRF) mikroskopi testi kullanarak dinamik aktin ve mikrotübülleri görselleştirmek için bir kılavuzdur.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Bu yazıda, birlikte dolaşık aktin filamentleri ve mikrotübüllerinin ayarlanabilir üç boyutlu kompozit ağlarının mühendisliği ve karakterizasyonu için protokoller sunulmaktadır. Kompozitler, miyozin II ve kinesin motorları tarafından tahrik edilen aktif yeniden yapılanma ve balistik harekete uğrar ve aktin, mikrotübüller, motor proteinler ve pasif çapraz bağlayıcıların göreceli konsantrasyonları tarafından ayarlanır.

Aktin-Mikrotübül Kompozitlerinin Ayarlanabilir Motor Tahrikli Dinamiği ve Mekaniği ile Yeniden Yapılandırılması ve Karakterize Edilmesi

Burada, saflaştırılmış proteinlerden yarı iki boyutlu (2D) dolaşık, çapraz bağlı ve sıvı kristal aktin düzeneklerinin hazırlanması için yöntemler sunuyoruz.

Aktif Aktin Bazlı Montajların Kasılma ve Deformasyon Modlarının In Vitro Olarak Ayarlanması: İki Boyutlu Aktif Ağlardan Sıvı Kristal Damlalara

Öğrenin, mikroakışkanlar ve floresan mikroskobu kullanarak aktin filamentlerinin montaj dinamiğini nasıl inceleyeceğinizi. Bu yöntem, aktin bağlayıcı proteinlerin etkilerini gerçek zamanlı olarak nicelendirmenizi sağlar.

Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

Daha fazla video keşfet