Plazmid DNA'sının Fare İskelet Kasına Elektroporasyonu

Plazmid DNA'sının iskelet kasına elektroporasyonu, farelerde kas kontraktilitesinden ödün vermeden gen ekspresyonunu modüle etmek için uygun bir yöntemdir.

Kaslarda elektroporasyon aracılı gen transferi, kas fizyolojisindeki değişiklikleri araştırmak için kolay ve etkili bir tekniktir. Elektroporasyonun kas kontraktilitesinden ödün vermediğini bulduk. Gen yapılarının in vivo kas içine elektroporasyonu, gen yapılarının viral vektörlere daha kapsamlı bir şekilde paketlenmesini gerektirmeyen basit ve etkili bir prosedürdür.

Konumu ve küçük boyutu nedeniyle EDL'yi görselleştirmek, izole etmek ve enjekte etmek zordur. Bir fare karkası üzerinde pratik yapmak ve Hindistan mürekkebi gibi biyolojik mürekkep enjeksiyonu, yeterli enjeksiyon kanıtı sağlamada yardımcı olabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Brian Hain olacak.

Fareyi enjekte etmeden önce, ayak parmağı sıkışma refleksinin yokluğunda forseps kullanarak anestezinin cerrahi düzlemini onaylayın, ardından fareyi, prosedürün geri kalanı için 37 santigrat derecede dolaşımdaki bir su plakasına dayanan bir burun konisine aktarın. Fare sırtüstü pozisyona yerleştirildikten sonra, küçük saç kesme makineleri kullanarak her iki arka bacaklardaki tüyleri çıkarın, ardından enjeksiyon bölgesini dönüşümlü% 70 etanol ve betadin ile sterilize edin. Enjeksiyon için, alt bacağın lateral tarafındaki deriden görülebilen tibialis anterior veya TA tendonunu bulun ve TA kasının üst ucunu işaretleyin.

Ardından, 50 mikrolitrelik bir mikro şırıngaya monte edilmiş 30 gauge'luk bir iğneyi, iğne kasın üst ucuna ulaşana kadar miyotendinöz kavşaktan bir ila iki milimetre daha üstün olan sığ bir beş derecelik açıyla kas içine yerleştirin. Plazmid çözeltisinin 50 mikrolitresini kas içine vermek için iğneyi enjeksiyon yolu boyunca yavaşça geri çekerken pistonu bastırın. Kas şişmelidir.

Zamanlayıcıyı bir dakika boyunca ayarlayın ve TA kasındaki bacağın kalınlığını ölçün, ardından kumpas elektrotlarını ölçülen kalınlığa ayarlayın. Ardından elektroporatör voltajını milimetre başına 12,5 volta ayarlayın. Bir dakika sonra, kaliper elektrotlarını 20 milisaniye süreli ve 200 milisaniyelik aralıklarla beş kare dalga darbesi vermek için aşırı sıkı olmadan alt ekstremitenin etrafına yakın bir şekilde yerleştirin.

Kas her nabızla seğirmelidir. Kontrol plazmid vektörünü kullanarak prosedürü diğer ekstremiteyle tekrarlayın. İşiniz bittiğinde, fareyi burun konisinden çıkarın ve farenin 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısıtma yastığı üzerinde iyileşmesine izin verin.

İyileştikten sonra, fareyi kafesine geri getirin. Fare sırtüstü pozisyondayken, tibia kemiği ön tepesini görsel olarak ve nazik çarpıntı yoluyla bulun. Tibia ön tepesinin lateral tarafındaki deriden dizden beş milimetre daha düşükten TA miyotendinöz bileşke iki milimetre daha üstün sığ bir kesi yapmak için bir neşter kullanın.

Küçük makas yardımıyla fasyayı açıkça diseke edin, TA kasını açığa çıkarın ve daha sonra ekstansör digitorum longus veya EDL'yi ortaya çıkarmak için kası çekerek TA kasını tibiadan yavaşça ayırın. Küçük kavisli forseps kullanarak prosedür sırasında TA'yı EDL'den uzak tutun. 30 gauge iğneyi, iğne kasın üst ucuna ulaşana kadar uzunlamasına EDL'ye yerleştirin ve daha önce gösterildiği gibi plazmid çözeltisinin 10 mikrolitresini enjekte edin.

EDL kası şişmelidir. EDL'deki bacağın kalınlığını ölçün ve daha önce açıklandığı gibi beş kare dalga darbesi vermek için kumpas elektrotlarını ölçülen kalınlığa ayarlayın. Tamamlandığında, tek kullanımlık 4-0 emilemeyen naylon dikişler kullanarak insizyonu kapatın.

Daha sonra fareyi burun konisinden çıkarın ve 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısıtma yastığı üzerinde iyileşmesine izin verin. Ameliyattan hemen sonra ve ameliyattan 12 ila 24 saat sonra uygun bir deri altı analjezik uygulayın. Kurtarıldıktan sonra fareyi ev kafesine geri getirin.

TA ve EDL kaslarında pcDNA3-EGFP plazmidinin enjeksiyonu ve elektroporasyonundan sonra, kas liflerinde DNA alımını gösteren GFP ekspresyonu gözlendi. Daha düşük bir büyütmede görüntülendiğinde, EDL kas transfeksiyon verimliliği, siyah liflere karşı yeşil liflerin ortaya çıkmasıyla görselleştirilebilir. Enjekte edilen ve elektroporated EDL'ler, enjekte edilmemiş veya elektroporated kaslara kıyasla 100 Hertz'de benzer tetanik yanıtlara sahipti.

Enjekte edilen ve elektroporated EDL, tetanik kas kuvveti, spesifik tetanik kas kuvveti, gerginliğin zirveye ulaşma süresi ve yarım gevşeme süresi, el değmemiş kontrole kıyasla ödün vermedi. Enjekte edilecek kası doğru bir şekilde tanımlamak ve plazmid çözeltisini verimli bir şekilde vermek önemlidir. Bu protokol kullanılarak bir dizi histolojik ve biyokimyasal ölçüm yapılabilir.

Hedef protein hücresel lokalizasyonu, hedef gen nakavtı, transkripsiyonel muhabirler ve bir dizi doku boyama yapılabilir. Bu teknik, fizyolojik ve patofizyolojik koşullar sırasında kastaki moleküler sinyalleşmedeki çok çeşitli değişiklikleri tanımlamak için kullanılmıştır. Gen transferini takiben kas kontraktilitesinin araştırılması bu teknik kullanılarak mümkündür.