Name: Hücresel Düzeyde Mantar-Mikrobiyal Etkileşimleri Probalamak için Mikroakışkan Araçlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Öğrenin, mikroakışkan cihazlar kullanarak mantar-mikrobiyal etkileşimleri hücresel düzeyde nasıl incelenir. Bu yöntem, toprak mikrobiyomunun korunması ve sürdürülebilir tarım için biyokontrol ajanları geliştirmeye katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Imperial College London Biyomühendislik Bölümü ve The Leverhulme Trust'ın (Araştırma Hibe Referansı: RPG-2020-352) finansal desteğini kabul ediyoruz.

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Bu makalede, kanal mikroakışkanları kullanılarak mantar-mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi için bir protokol sunulmaktadır. Yazarlar, bu cihazların çok yönlülüğünü göstermeyi ve araştırmacının ilgi alanlarına uyacak şekilde adaptasyonu teşvik etmeyi amaçlamaktadır. Örnek BFI ve FFI cihazları kullanılarak, mantar-mikrobiyal etkileşimler daha önce erişilenden daha ayrıntılı olarak incelenebilir. Toprağın arka plan karmaşıklığını ve heterojenliğini ortadan kaldırarak, hiflerin büyümesini tek bir tek katmanla sınırlı kala...

Toprak, karbon ve fosfor döngüleriiçin etkili olan mikroorganizmaların bolluğunu içeren olağanüstü çeşitli bir ortamdır 1,2. Filamentli mantarlar, organik ve inorganik maddelerin ayrıştırıcıları olarak çok sayıda ekosistemin önemli bir bileşenidir ve simbiyotik ilişkilerin oluşumu yoluyla bitkilerin beslenmesini artırabilir 3,4. Toprakta, mantarlar diğer mantarlar5, bakteri6, virüsler7 ve nematodlar8 gibi çok sayıda mikropla dinamik olarak etkileşime girer. Bu etkileşimlerin toprak ve bitki sağlığı için önemli sonuçları vardır. Bununla birlikte, etkileşime giren mikroorganizmaları yüksek çözünürlükte görüntüleyebilen uygun deneysel sistemlerin bulunmaması nedeniyle, birçoğu tanımlanmamıştır.
Bakteriyel-fungal etkileşimler (BFI'ler) ve mantar-mantar etkileşimleri (FFI'ler) ile ilgili araştırmalar, tıpta antimikrobiyaller ve tarımda biyolojik kontrol ajanları da dahil olmak üzere bir dizi alanda değerli uygulamalara sahiptir. Örneğin, Coprinopsis cinerea mantarı, insan patojeni Listeria monocytogenes9'a karşı antibakteriyel aktivite sergilediği gösterilen peptid copsin'i üretir. Benzer şekilde, mantar kaynaklı bileşik olan griseofulvin, insan mantar enfeksiyonları için bir tedavi olarak yaygın olarak kullanılır ve ayrıca bitki patojenik mantarı Alternaria solani10,11'in büyümesini inhibe edebilir. Toprakta yaşayan bakteri Bacillus subtilis'in çeşitli suşlarının da mantar bitkisi patojeni Rhizoctonia solani12,13'ün etkili biyokontrol ajanları olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, geleneksel metodolojilerle ilişkili sınırlamalar nedeniyle, BFI'lar ve FFI'lar tek hücreler düzeyinde yeterince anlaşılmamıştır.
Geleneksel çalışmalar tipik olarak BFI'ları ve FFI'ları, çatışmada iki veya daha fazla türe sahip agar plakaları kullanarak makro ölçekte araştırmaktadır. Etkileşimleri, karşı karşıya kalan türlerin büyüme oranlarını ve metabolit üretimini ölçerek değerlendirilir14,15,16; ancak, bu metodoloji sadece koloni seviyesine kadar çözülmüştür. Hücresel düzeyde etkileşimleri incelemek için, bakteriyel ve fungal aşılayıcılar, daha sonra mikroskop altında görüntülenen agar ile kaplanmış cam mikroskop slaytlarında yetiştirilebilir17. Bununla birlikte, hapsedilme eksikliği nedeniyle mikroskop slaytlarını kullanarak tek bir hifayı takip etmek zor olabilir, bu da hızlandırılmış görüntülerin elde edilmesinin daha zor olduğu anlamına gelir. Ayrıca, mantar miselyumunun tanımlanmış bölgeleri içindeki diğer mikroorganizmaları mekansal olarak sınırlama veya örneğin bozulabilecek tanımlanmış kimyasal ortamlar yaratma fırsatı, bu tür kurulumlarda mümkün değildir. Toprağın "kara kutu" doğası, mantar-mikrobiyal etkileşimleri tek hücreler düzeyinde incelemenin karmaşıklığına da katkıda bulunur18. Etkileşen türleri toprak mikrobiyomunun inanılmaz çeşitliliğinden uzakta gözlemleyerek, bireysel üyelerin etkileşime girme şekli tam olarak değerlendirilebilir. Bu nedenle, BFI'ların ve FFI'ların yüksek çözünürlüklü, tek hücreli görüntülenmesini sağlayan çok yönlü platformlara sürekli bir ihtiyaç vardır.
Çip üzerinde laboratuvar sistemleri olarak adlandırılan mikroakışkan teknolojiler, BFI'ların ve FFI'ların tek hücreler düzeyinde incelenmesi için ideal bir platform sağlar. Kimyasal analiz ve mikroelektronik için geliştirilen teknolojilerden kaynaklanan mikroakışkanlar alanı, biyolojik bilimler tarafından benimsenmiştir19. Mikroakışkan teknolojileri, mikrometre ölçeğinde en az bir boyuta sahip, ısmarlama bir minyatür kanallar ağı içindeki küçük hacimli sıvıları düzenler ve biyolojik araştırmalarda kullanımları20 genişlemektedir. Özellikle, filamentli mantarların büyümesini incelemek için mikroakışkan cihazlar geliştirilmiştir 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Bu teknolojiyi kullanmanın bir yararı, hifaların hapsedilmesi ve besin maddelerinin mikro kanallar içindeki dağılımının, toprak ortamının yapısına geleneksel agar yöntemlerinden daha çok benzemesidir31. Son zamanlarda, insan nötrofiller ve mantar patojenleri 32, bakteri ve bitki kökleri33, mantarlar ve nematodlar34,35 arasındaki etkileşimleri araştırmak için mikroakışkan platformlar kullanılmıştır.
Mikrobiyal etkileşimleri incelemek için mikroakışkanlar kullanmanın birçok avantajından biri, mikrokanal ortamının spesifik kontrolünü içerir. Örneğin, laminer akış rejimleri, bakteriyel kemotaksis36'yı incelerken özellikle yararlı olan tanımlanmış konsantrasyon gradyanları üretmek için kullanılabilir. Diğer bir avantaj, mikroakışkan cihazların üretiminde yaygın olarak kullanılan ucuz, biyouyumlu bir elastomerik polimer olan poli (dimetilsiloksan) (PDMS) şeffaf doğasının, parlak alan ve floresan mikroskobu kullanılarak tek hücrelerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini kolaylaştırmasıdır37. Benzer şekilde, mikropların mikrokanallar içinde hapsedilmesi, tek hücreleri izleyen hızlandırılmış deneylerin yapılabileceği anlamına gelir ve bireysel hücresel tepkilerin kaydedilmesine ve nicelleştirilmesine izin verir37. Son olarak, mikroakışkan cihazlar kullanıcı dostu olacak şekilde tasarlanabildiğinden, uzman olmayanlar tarafından kolayca kullanılabilirler38.
Toprakta yaşayan mikroorganizmalar arasındaki etkileşimler hakkında daha fazla bilgi sahibi olmak, biyolojik çeşitliliği koruyan sürdürülebilir ekosistem yönetimi uygulamalarını geliştirmek ve iklim değişikliğinin karasal ortamlar üzerindeki etkisini azaltmak için önemlidir39. Bu nedenle, yeni mikroakışkan araçların geliştirilmesi, mantarların ve hücresel düzeydeki etkileşimlerinin anlaşılmasını genişletmek için esastır. Buradaki protokol, Şekil 1'de gösterildiği gibi BFIs40 ve FFI41'in çalışması için üretilen iki mikroakışkan cihaza odaklanacaktır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg"> Şekil 1: Bakteriyel-fungal etkileşim (BFI) ve mantar-fungal etkileşim (FFI) cihazlarının görsel ve şematik gösterimi. (A) BFI cihazının görüntüsü. Hifal büyümesinin cihaza girmesine izin vermek için mikro kanalların bir ucunun girişine bir misel tıkacı yerleştirilir. Bakteri girişi karşı uçtadır. Ölçek çubuğu = 5 mm. (B) Bakteri girişlerinin konumlandırılmasını ve etkileşim mikrokanalları aracılığıyla hifal büyümesinin yönünü gösteren BFI cihazına şematik genel bakış. Kanallar 10 μm derinliğinde, 100 μm genişliğinde ve 7 mm uzunluğundadır ve toplamda 28 gözlem kanalıdır. (C) Coprinopsis cinerea ve Bacillus subtilis NCIB 3610 arasındaki agar plakası üzerinde yüzleşme testi, ölçek çubuğu = 20 mm (solda). C. cinerea ve B. subtilis NCIB 3610 arasındaki mikrokanal içindeki etkileşimi (orta ve sağ), yani bakterilerin mantar hiflerine polar bağlanmasını gösteren mikroskopi görüntüleri. Ölçek çubuğu = 25 μm (orta) ve 10 μm (sağ). (D) FFI cihazının cam tabanlı bir Petri kabına bağlanmış, misel tıkaçları ile çift aşılanmış görüntüsü. Ölçek çubuğu = 1 cm. (E) FFI cihazına şematik genel bakış. Cihazın her iki ucundaki girişlere iki mantar aşılayıcı tıkaç sokulur ve mikrokanalların hifal keşfine izin verilir. Kontrol kanalları sadece bir mantar girişine bağlanır ve test mantarları arasındaki etkileşimleri önleyen bir çıkmaz kanala sahiptir. Etkileşim kanalları hem mantar girişlerini birbirine bağlar hem de mikrokanal içindeki test denekleri arasında hifal etkileşimlerine izin verir. Her etkileşim kanalı, toplam uzunluğu 8,8 mm (elmas başına 490 x 430 μm), 10 μm derinliğinde ve her elmas arasında 20 μm'lik bir bağlantı bölgesine sahip olan 18 elmas şeklindeki bölümden oluşur. Kanal tipleri çoğaltılır, ölçek çubukları = 1 mm. (F) Birbirine bağlı etkileşim kanalının zıt uçlarından büyüyen, yaklaşan iki hifal cephesi arasındaki etkileşim bölgesi. Faz kontrastlı mikroskopi görüntüsü, ölçek çubuğu = 250 μm. Bu şekildeki paneller Stanley ve ark., 2014 (A-C)40 ve Gimeno ve ark., 2021 (D-F)41'den değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>214010</td><td>Petri kapları içinde bakteri ve mantar yetiştiriciliği için kültür ortamını katılaştırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Alüminyum folyo</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11759408</td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD 2021</td><td>Autodesk, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Otoklav (VX-75)</td><td>Systec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj (5810R)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klorotrimetilsilan</td><td>Merck Yaşam Bilimleri</td><td>386529</td><td>DİKKAT: Klorotrimetilsilan tehlikeli bir maddedir. Uygun KKD giyin ve dikkatli kullanın. Cilt ve gözlerle temasından kaçının ve solunmasını önleyin. Tutuşturucu kaynaklardan uzak tutun ve iyi havalandırılan bir alanda kullanın.</td></tr><tr><td>Mantar delici</td><td>SLS</td><td>COR1000</td><td></td></tr><tr><td>Geliştirici çözümü (mr-Dev 600)</td><td>Microresist Technologies</td><td></td><td>DİKKAT: mr-Dev 600 geliştirici çözümü yanıcıdır</td></tr><tr><td>Erlenmeyer şişeleri</td><td>VWR</td><td>214-1108</td>, <td>örneğin 200 mL; İhtiyaçlarınıza tam olarak uygun boyutu seçin</td></tr><tr><td>Etanol (%70 v/h)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>E/0650DF/15</td><td>%99,8'den seyreltilmiş (Analitik Reaktif Sınıfı)</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Görüntüleme işleme için örnek yazılım paketi</td></tr><tr><td>Filtrelenmiş, basınçlı hava</td><td></td><td></td><td>Çoğu laboratuvarda standart olarak mevcuttur. Alternatif olarak, hava regülatörlü yağsız bir kompresör kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Düz başlı gofret cımbız</td><td>SLS</td><td>INS5026</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10008051</td><td>Bükülmüş, keskin</td></tr><tr><td>Cam tabanlı petri kabı</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>FD35-100</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>Cam tabanlı petri kabı</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>FD5040-100</td><td>50 mm</td></tr><tr><td>Cam kristalizasyon kapları</td><td>VWR</td><td>216-1865</td><td>Kullanılmış PDMS plakalarının yıkanması için</td></tr><tr><td>Cam kristalizasyon kapları</td><td>VWR</td><td>216-1866</td><td>Ana kalıpların geliştirilmesinde kullanılır</td></tr><tr><td>Cam medya şişeleri</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15456113</td><td>örneğin 250 mL; ihtiyaçlarınıza tam olarak uygun boyutu seçin</td></tr><tr><td>Cam şırınga (Hamilton)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10625251</td><td>Klorotrimetilsilan dağıtmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Sıcak plaka (HP 160 III BM)</td><td>SAWATEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aşılama döngüsü</td><td>VWR</td><td>COPA175CS01</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil alkol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>Laminer akış başlığı</td><td>Hava Bilimi (PCR)</td><td></td><td>Cihaz imalatı için kullanılan örnek laminer akış başlığı</td></tr><tr><td>LB ortamı</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>BP9723-500</td><td>Bakteriyel gece kültürü</td></tr> <tr><td>için örnek besin suyuIşık yayan diyot ışık motoru (LedHUB)</td><td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td><td></td><td>Mantar-mikrobiyal etkileşimleri görüntülemek için kullanılabilecek örnek ışık kaynağı (floresan)</td></tr><tr><td>MA6 Ultraviyole maske hizalayıcı</td><td>Suss Microtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Malt özü</td><td>VWR</td><td>84618</td><td>Örnek mantar kültürü ortamı yapmak için kullanılır (Malt özü agar)</td></tr><tr><td>Maske Yazarı</td><td>Uygulamalı Malzemeler</td><td>4700DP</td><td>Fotolitografi için fotoğraf maskesi basmak için kullanılabilecek bir maske yazarı örneği</td></tr>: <tr><td>Ana kalıp, plastik montaj</td><td></td><td></td>, <td>3D baskı, ısmarlama tutucu, şirket içinde üretilmiştir,</td></tr><tr><td>Mikrobiyolojik güvenlik kabini&nbsp; (BiyoMat2)</td><td>İçerdiği Hava Çözümleri</td><td></td><td>Mikrobiyal kültür ve cihaz aşılaması için kullanılan örnek MSC</td></tr><tr><td>Milli-Q arıtılmış su</td><td></td><td></td><td>Biyoloji laboratuvarlarında standart olarak mevcuttur.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Advanced Research görüntüleme yazılımı</td><td>Görüntü</td> alma için Nikon <td></td><td>Exemplar yazılım paketi</td></tr><tr><td>NIS-Elements Free Viewer</td><td>Elde</td><td>edilen görüntüleri görüntülemek için</td>Nikon <td></td> Exemplar yazılım paketi</tr><tr><td>Fırın (Binder BD115)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15602126</td><td>Poli (dimetilsiloksan) (PDMS) kürlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>)Fırın (CLO-2AH-S)</td><td>KOYO</td><td></td><td>Silikon gofret hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>HS234526B</td><td>şeffaf film</td></tr><tr><td>Petri kapları, kare steril</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11708573</td><td>120,5 mm</td></tr><tr><td>Petri kapları, steril</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15370366</td><td>90 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Fotolitografi maskesi</td><td>Mikro Litografi Hizmetleri Ltd. İngiltere</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plazma temizleyici (Zepto)</td><td>Diener Elektronik</td><td>100012601</td><td></td></tr><tr><td>Plastik bardak</td><td>Semadeni</td><td>8323</td><td></td></tr><tr><td>Plastik spatula</td><td>Semadeni</td><td>3340</td><td></td></tr><tr><td>Taşınabilir hassas terazi (OHAUS Scout)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15519631</td><td>PDMS, ortamı tartmak için kullanılır bileşenler vb.</td></tr><tr><td>Hassas kesici</td><td>Syneo</td><td>HS1251135P1183</td><td>Kesme kenarı çapı: 3,18 mm</td></tr><tr><td>Hassas kesici&</td><td>Syneo</td><td>HS1871730P1183S</td><td>Kesme kenarı çapı: 4,75 mm</td></tr><tr><td>Profilometre&nbsp;</td><td>Bruker</td><td></td><td>Dektak XT-stylus</td></tr><tr><td>Tıraş bıçakları</td><td>H&auml; berle Labortechnik</td><td>9156110</td><td></td></tr><tr><td>Buzdolabı</td><td>Haden</td><td></td><td>4-6 & derece; C</td></tr><tr><td>Retiga R1 CCD kamera</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Mantar-mikrobiyal etkileşimleri görüntülemek için kullanılabilecek örnek kamera</td></tr><tr><td>Scotch sihirli bant</td><td>Ofis Deposu</td><td>3969954</td><td>19 mm görünmez bant; şeffaf bant</td></tr><tr><td>Çalkalama kuvözü (Cole-Parmer SI500)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10257954</td><td></td></tr><tr><td>Silikon gofret</td><td>Inseto</td><td></td><td>100 mm</td></tr><tr><td>Soda kireç camı plaka</td><td>Inseto</td><td></td><td>125 mm x 125 mm x 2 mm. Fotolitografi maskesini maske hizalayıcıda tutmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Spincoater&nbsp;</td><td>SAWATEC</td><td>SM-180-BM</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2010 fotorezist</td><td>MicroChem</td><td></td><td>DİKKAT: SU-8 fotorezist tehlikelidir, kullanırken dikkatli olun ve solunmasını ve cilt ile temasını önleyin. Yanıcı, potansiyel olarak kanserojen ve çevre için toksiktir.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 elastomer kiti</td><td>VWR</td><td>634165S</td><td>Poli (dimetilsiloksan) (PDMS) cihazlarının hazırlanması için kullanılır</td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrollü inkübatör</td><td>Okolab</td><td></td><td>Mantar-mikrobiyal etkileşimleri görüntülemek için kullanılabilen örnek inkübatör</td></tr><tr><td>Ti2-E ters epifloresan mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>MEA54000</td><td>Mantar-mikrobiyal etkileşimleri görüntülemek için kullanılabilen örnek mikroskop</td></tr><tr><td>Ultrasonik temizleyici S-Line</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>FB15050</td><td></td></tr><tr><td>Vakumlu kurutucu</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10528861</td><td>Silianizasyon ve PDMS gaz giderme ayrı desikatörlerde yapılmalıdır</td></tr><tr><td>x10 / 0.3 NA CFI Plan Fluor DL objektif lensi</td><td>Nikon</td><td>MRH20105</td><td>Mantar-mikrobiyal etkileşimleri görüntülemek için kullanılabilecek örnek objektif lens</td></tr><tr><td>x20 / 0.45 NA CFI Plan Fluor DL objektif lens</td><td>Nikon</td><td>MRH48230</td><td>Mantar-mikrobiyal etkileşimleri görüntülemek için kullanılabilen örnek objektif objektif lensi</td></tr></tbody></table>

hücresel düzeyde mantar-mikrobiyal etkileşimleri probalamak için mikroakışkan araçlar

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentli mantarlar toprağın başarılı sakinleridir ve organik ve inorganik maddenin ayrışması ve besin seviyelerinin düzenlenmesi gibi toprak ekosistemlerinde önemli bir rol oynarlar. Orada ayrıca bakteri veya diğer mantarlar gibi çeşitli diğer mikroplarla etkileşime girmek için sayısız fırsat bulurlar. Bununla birlikte, mantar etkileşimlerini hücresel düzeyde incelemek, toprağın kara kutu benzeri doğası nedeniyle zor olabilir. Mantar etkileşimlerinin incelenmesi için yeni mikroakışkan araçlar geliştirilmektedir; bakteriyel-fungal ve mantar-fungal etkileşimlerini incelemek için tasarlanmış iki platform vurgulanmıştır. Bu mikrokanallar içinde, mantar-mikrobiyal etkileşimler, kontrollü fiziko-kimyasal ortamlarda, daha önce mümkün olandan daha yüksek zamansal ve mekansal çözünürlükte izlenebilir. Bu araçların uygulanması, hifalara bakteriyel polar bağlılığın gözlemlenmesi veya karakterize edilmemiş mantar-mantar antagonizmalarının ortaya çıkarılması gibi çok sayıda yeni biyolojik anlayış sağlamıştır. Bu metodolojilerin önemli bir özelliği, bu aracın uzman olmayanlar tarafından kullanım kolaylığı ile ilgilidir ve mikrobiyoloji laboratuvarlarında kullanılmak üzere oldukça çevrilebilir teknolojiler ortaya koymaktadır.

Örnek BFI40 ve FFI41 cihazlarından temsili sonuçlar sunulmuştur. Hifal büyüme hızı ölçümleri, temel mikroskopi teknikleri ile birlikte bu cihazlar kullanılarak kolayca elde edilebilir. Şekil 3A-B, C. CINEREA HYPHAE ve B. subtilis NCIB 3610 arasındaki bakteriyel-fungal etkileşimleri göstermektedir. B. subtilis varlığı, ko-aşılamadan yaklaşık 5 saat sonra C. cinerea'nın büyümes...

Toprağın opaklığı nedeniyle, kurucu mikroplar arasındaki etkileşimler hücresel çözünürlükle kolayca görselleştirilemez. Burada, mantar-mikrobiyal etkileşimleri araştırmak için yeni fırsatlar sunan iki mikroakışkan araç sunulmaktadır. Cihazlar çok yönlü ve kullanımı kolaydır, bu da hücresel düzeyde yüksek mekansal zamansal kontrol ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

Hücresel Düzeyde Mantar-Mikrobiyal Etkileşimleri Probalamak için Mikroakışkan Araçlar

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Sunulan mikroakışkan cihazları kullanarak, mantarlar ve diğer mikroplar arasındaki dinamik etkileşimleri, hassas uzaysal ve çevresel kontrolün yanı sıra tek hücre düzeyinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile inceleyebiliriz. Önemli olarak, mantar büyümesi mikroakışkan kanal içinde sınırlandırılabilir ve yönlendirilebilir. Yüksek kaliteli hızlandırılmış görüntülerin elde edilmesini sağlar.Bu nedenle, mantar-mantar ve mantar-bakteri etkileşimlerinin karmaşıklığı araştırılabilir. Mantar mikrobiyal etkileşimlerini anlamak, toprak mikrobiyomunun tanımlanmasında ve korunmasında önemli bir adımdır. Bu bilgi, sürdürülebilir tarım ile yeni biyokontrol ajanlarının geliştirilmesi için kullanılabilir.Başlamak için, temiz bir plastik kapta bir spatula kullanarak tabanı ve kürleme maddesini 10 ila 1 oranında iyice karıştırarak yaklaşık 40 gram poli (dimetilsiloksan) veya PDM'ler hazırlayın. Tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için, bardağı bir saat boyunca bir vakum odasına yerleştirin. Daha sonra, şeffaf bant kullanarak, ana kalıbı plastik bir montaja sabitleyin ve toz parçacıklarını gidermek için sıkıştırılmış filtrelenmiş hava kullanın, ardından PDM'leri ana kalıbın ortasına dökün ve yerleşmesine izin verin.Toz parçacıklarının PDM'lerin yüzeyine yerleşmesini önlemek için, ana kalıbı gevşek bir şekilde plastik bir kapakla örtün, ardından ana kalıbı bir fırına aktarın ve gece boyunca 70 santigrat derecede kürleyin. Ana kalıbı fırından çıkardıktan ve soğumasını sağladıktan sonra, kürlenmiş PDM'leri PDM'lerdeki ana kalıba zarar vermeden ana kalıptan ve plastik çerçeveden soyun. Daha sonra tozsuz bir yüzey sağlamak için, PDM'lere kabartılmış mikro kanalların üzerine şeffaf bant yerleştirin.Daha sonra, PDM'leri tasarımın belirlediği şekilde plakalar halinde kesmek için monte edilmiş bir giyotin veya tıraş bıçağı kullanın. Bakteriyel-fungal etkileşim cihazı veya BFI cihazı için kullanılan PDM levhasının yanal açıklığını keserken, mikro kanalların tamamen açık olduğundan emin olun. Bununla birlikte, mantar-mantar etkileşim cihazının veya FFI'nın montajında kullanılan PDM plakaları için, her köşe bir cam tabanlı Petri kabına sığacak şekilde kesilmelidir.Ardından, cihaz tasarımına göre giriş veya çıkış deliklerini delmek için hassas bir kesici kullanın. Daha sonra, PDM plakalarını 0,5 molar sodyum hidroksit çözeltisine batırın. Plakaları% 70'lik bir etanol çözeltisine aktarmadan önce steril çift damıtılmış suda durulayın.Etanol çıkardıktan ve plakaları tekrar çift damıtılmış steril suyla duruladıktan sonra, plakaları steril çift damıtılmış suya batırın ve beş dakika boyunca sonikat yapın, ardından PDM'lerin levhasını sudan çıkarın, sıkıştırılmış filtrelenmiş hava ile kurutun ve steril kare Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, Petri kabını PDM'ler levha ile bir saat boyunca 70 santigrat derecede bir fırında inkübe edin. Plakalar tozsuz bir ortamda soğuduktan sonra, bant ve sıkıştırılmış filtrelenmiş hava kullanarak yüzeylerindeki tozları temizleyin.PDM'lerin plakalarının ve cam tabanlı Petri kaplarının yüzeylerini aktive etmek için, daha sonra birbirine bağlanacak şekilde, bunları aktive edilecek yüzeyler yukarı bakacak şekilde bir plazma temizleyiciye yerleştirin. Petri kaplarındaki PDM levhasını plazma temizleyiciden çıkardıktan sonra, aktif yüzeyleri birbirleriyle konformal temas halinde yerleştirerek nazikçe bağlayın. Başarılı yapıştırmayı kontrol etmek için sırasıyla 35 milimetre ve 55 milimetre çapında Petri tabakları ile Bond BFI ve FFI PDM'ler levhası, PDM'lerin laboratuvarını Petri kabından cımbızla çekmeye çalışır.Aşılama girişlerinin veya mikrokanallarının çökmemesini sağlamak için cihazı gözle veya jenerik mikroskopi ile dikkatlice görselleştirin. Suya doymuş veya besin açısından zengin koşullar için, BFI cihazlarını yapıştırdıktan hemen sonra doldurmak için istenen çözeltinin 100 mikrolitresini pipetleyin. FFI cihazları için, her girişe 30 mikrolitre ortam ekleyin.Son olarak, nemi korumak için Petri kabına 100 ila 200 mikrolitre steril çift damıtılmış su ekleyin. Bununla birlikte, doymamış su koşulları için, nemi korumak için Petri kabına 100 ila 200 mikrolitre steril çift damıtılmış su ekleyin. Mantar aşılaması için, laminer bir akış davlumbazının içinde, sterilize edilmiş bir mantar delici kullanarak, üç günlük bir kültürün çevresindeki bir koloniden bir agar tapası çıkarın ve büyüyen hifal cephesini sağlam tutmayı sağlayın.Daha sonra agar fişini BFI ve / veya FFI cihazının mantar girişine, kanalların hifal infiltrasyonunu teşvik etmek için miselyum tarafı hifal ön kısımda mikrokanal açıklıklarına doğru yönlendirilmiş olarak yerleştirin. FFI cihazı için, karşı girişe ikinci bir mantar türü içeren başka bir agar fişi yerleştirin. Daha sonra, Petri kabını şeffaf bir filmle kapatın ve görüntülemeye kadar karanlıkta 25 ila 28 santigrat derecede inkübe edin.Bakteriyel aşılama için, BFI cihazını inkübatörden çıkardıktan sonra, steril bir ortamda bakteri girişine 10 mikrolitre bakteriyel süspansiyon pipetin. Petri kabı şeffaf bir filmle kapatıldıktan sonra, görüntüleme başlayana kadar cihazı karanlıkta 25 santigrat derecede dik olarak saklayın. Bu protokolü kullanarak, Coprinopsis cinerea mantarı ile Bacillus subtilis bakterisi arasındaki etkileşim başarılı bir şekilde görselleştirilebilir.Bakterinin varlığında, mantarın büyüme hızının yaklaşık beş saatlik madeni parakülasyondan sonra büyük ölçüde azalmaya başladığı gözlenmiştir. Ayrıca, bakterilerle ilişkili mantar hifleri ince ve şeffaf bir görünüme sahipti. Zaman atlamalı floresan mikroskopisi ayrıca Bacillus subtilis ile beş saatlik sikkeülasyondan sonra mantar hifaj çöküşünü de ortaya çıkardı.Bununla birlikte, altı saatten itibaren, bakteri popülasyonu da azalmaya başladı. Mantar-mantar etkileşimlerinin görselleştirilmesi, Fusarium graminearum'un, floresan mikroskobu kullanılarak belirgin olan Trichoderma rossicum'un büyümesini güçlü bir şekilde inhibe ettiğini göstermiştir. Bu protokol ayrıca, Pseudomonas synxantha ve Pseudomonas fluorescens bakterilerinin varlığında Verticillium longisporum mantarında önemli morfolojik değişiklikler olduğunu ortaya koymuştur.Çalışmada kullanılan yüksek çözünürlüklü dinamik görüntüleme tekniğinde Fusarium graminearum'da Clonostachys rosea mantarı varlığında septa oluşumu da saptandı. Floresan etiketleme, FFI cihazında Clonostachys rosea hyphal proliferasyonunun dinamik olarak ölçülmesini sağlamıştır. Bu cihazlar, farklı ilgi alanlarını dahil etmek ve mantar mikrobiyal etkileşimleri ile ilgili spesifik deneysel sorularını ele almak için kullanıcı tarafından uyarlanabilir ve değiştirilebilir.Hem BFI hem de FFI cihazları, mantarların mantarların, virüslerin, nematodların saldırısı üzerine savunma sinyallerini ve besin maddelerini nasıl yaydığını ortaya koyan ve bakteriyel dağılım üzerine araştırmalara olanak tanıyan bilimsel sınırları zorladı.

microfluidic-tools-for-probing-fungal-microbial-interactions-at

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Mikroakışkan cihazlar gerçek zamanlı olarak ve uygun fiziksel ölçeklerde karmaşık doğal süreçler görselleştirmek için kullanılabilir. Biz yeraltı bakteri büyüme ve taşımacılık eğitimi için doğal gözenekli ortamın temel özellikleri taklit basit bir mikroakışkan cihaz geliştirdik.

Gözenekli Ortam Mikrobiyal Ulaştırma incelenmesi için basit mikroakışkan Sistemleri: Mikrodünya Pencere

Biz temiz oda ya da yumuşak litografi gerek kalmadan, birden çok farklı suşları için benzer dinamik koşullar uygulanarak yeteneğine microfluidic cihazlar üretmek için basit bir yöntem sunulmaktadır.

Birden Farklı Suşlarının incelenmesi için bir mikroakışkan Cihazı

Kaynak: Miquel Guennoc, C. ve diğerleri. Filamentli mantar kolonilerinde bakteriyel biyofilmlerin konfokal ve elektron mikroskopisi kullanılarak niteliksel çok ölçekli analizi için yeni yöntem. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, koloni oluşumunu ve radyal büyümeyi desteklemek için işlenmiş selofan zarlarında mantar kültürünün hazırlanmasını göstermektedir. Daha sonra toprak bakteri hücrelerinin etkileşim testleri için yetiştirilip hazırlanması gösterilir. Son olarak, bakteriyel hücrelerin mantar...

Biyofilm oluşumu için mantar-bakteriyel ortak kültür oluşturmak

Bu protokolde, prokaryotik mikroorganizmaların tek hücreli analizi için bir mikroakışkan pikolitre biyoreaktörün (PLBR) üretimi, kurulumu ve temel çalışması tanıtılmaktadır. Endüstriyel olarak ilgili mikroorganizmalar, geleneksel yöntemlerle neredeyse imkansız olan, belirli zaman dilimlerinde büyüme hızı, morfoloji ve fenotipik heterojenlik hakkında bilgi sahibi olmaya izin veren ilke kanıtı olarak analiz edildi.

Mikrobiyal Tek Hücreli Analiz için Mikroakışkan Pikolitre Biyoreaktör: Fabrikasyon, Sistem Kurulumu ve Çalışması

Bu yazıda tek bir hücre analizi için bir mikroakışkan çip sunuyoruz. Bu sağlar: hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörler, ve floresan deneyleri veya bağışıklık aracılığıyla ikinci haberciler miktar.

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

Bu protokol büyümek ve niteliksel konfokal ve elektron mikroskobu ile mantar hif bakteri biyofilm analiz etmek için yeni bir yöntem açıklanır.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Bitki defensins patojenlere karşı bitki savunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Etkili eylem (MOA) onların mod anlama antifungal ajanları olarak antifungal Bu peptidler kullanımı önemlidir için. Burada, Bu peptidler MOA kritik yönlerini incelemek için canlı hücre görüntüleme yöntemi açıklanmıştır.

Canlı hücre görüntüleme modları giriş ve Antifungal bitki Defensins hücre altı yerelleştirme araştırmak için mantar hücrelerinin

Biz örnek olarak Bacillus subtilis kullanarak bireysel bakteri hücre soy mikrosıvısal çözümlenmesi için bir yöntem mevcut. Yöntemi gözlem, hücre nesiller sıkı bir şekilde kontrol edilebilir ve düzgün büyüme koşullar altında yüzlerce izin vererek Mikrobiyoloji geleneksel analitik yöntemleri eksikliklerin üstesinden gelir.

Bacillus subtilis tek hücreli mikrosıvısal analizi

Hayati floresan boyalar modern mantar hücre biyolojisinde canlı hücre görüntüleme analizleri için gerekli araçlardır. Bu yazıda, filamentöz mantarlarda plazma membran dinamiği, endo-/eksositoz ve hücre duvarı morfogenezinin izlenmesi için kurulmuş ve daha az bilinen floresan boyaların uygulanması ayrıntılı olarak anlatılır.

Filamentöz Mantarların Canlı Hücre Görüntülemesi İçin Membran ve Hücre Duvarı Seçici Floresan Boyaların Uygulanması

Burada, kitle spektrometresi bazlı proteomik enfeksiyon sırasında konak ve patojen arasındaki etkileşimin profilini çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, tek bir deneyde hem konakçının (örneğin, makrofajlar) hem de patojenin (örneğin Cryptococcus neoformans)protein bolluğundaki değişiklikleri ölçmek için etiketsiz niceleme kullanır.

Keşif Odaklı Konak-Patojen Etkileşimleri için Etiketsiz Nicel Proteomik İş Akışı

Filamentli mantar A. nidulanslarının hem batık kültürlerde hem de katı ortamda görüntülerini yakalamak, analiz etmek ve büyüme kinetiğini ölçmek için iletilen ışık mikroskopi tekniklerini kullanarak etiketsiz canlı görüntüleme protokolü sunuyoruz. Bu protokol floresan mikroskopi ile birlikte kullanılabilir.

Canlı Mikroskopi ve Açık Kaynaklı Yazılım Kullanılarak Aspergillus nidulans Büyüme Hızının Nicel Analizi

Öğrenin, mikroakışkan cihazlar kullanarak mantar-mikrobiyal etkileşimleri hücresel düzeyde nasıl incelenir. Bu yöntem, toprak mikrobiyomunun korunması ve sürdürülebilir tarım için biyokontrol ajanları geliştirmeye katkı sağlar.

Hücresel Düzeyde Mantar-Mikrobiyal Etkileşimleri Probalamak için Mikroakışkan Araçlar

Daha fazla video keşfet