Hücresel Düzeyde Mantar-Mikrobiyal Etkileşimleri Probalamak için Mikroakışkan Araçlar

Sunulan mikroakışkan cihazları kullanarak, mantarlar ve diğer mikroplar arasındaki dinamik etkileşimleri, hassas uzaysal ve çevresel kontrolün yanı sıra tek hücre düzeyinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile inceleyebiliriz. Önemli olarak, mantar büyümesi mikroakışkan kanal içinde sınırlandırılabilir ve yönlendirilebilir. Yüksek kaliteli hızlandırılmış görüntülerin elde edilmesini sağlar.

Bu nedenle, mantar-mantar ve mantar-bakteri etkileşimlerinin karmaşıklığı araştırılabilir. Mantar mikrobiyal etkileşimlerini anlamak, toprak mikrobiyomunun tanımlanmasında ve korunmasında önemli bir adımdır. Bu bilgi, sürdürülebilir tarım ile yeni biyokontrol ajanlarının geliştirilmesi için kullanılabilir.

Başlamak için, temiz bir plastik kapta bir spatula kullanarak tabanı ve kürleme maddesini 10 ila 1 oranında iyice karıştırarak yaklaşık 40 gram poli (dimetilsiloksan) veya PDM'ler hazırlayın. Tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için, bardağı bir saat boyunca bir vakum odasına yerleştirin. Daha sonra, şeffaf bant kullanarak, ana kalıbı plastik bir montaja sabitleyin ve toz parçacıklarını gidermek için sıkıştırılmış filtrelenmiş hava kullanın, ardından PDM'leri ana kalıbın ortasına dökün ve yerleşmesine izin verin.

Toz parçacıklarının PDM'lerin yüzeyine yerleşmesini önlemek için, ana kalıbı gevşek bir şekilde plastik bir kapakla örtün, ardından ana kalıbı bir fırına aktarın ve gece boyunca 70 santigrat derecede kürleyin. Ana kalıbı fırından çıkardıktan ve soğumasını sağladıktan sonra, kürlenmiş PDM'leri PDM'lerdeki ana kalıba zarar vermeden ana kalıptan ve plastik çerçeveden soyun. Daha sonra tozsuz bir yüzey sağlamak için, PDM'lere kabartılmış mikro kanalların üzerine şeffaf bant yerleştirin.

Daha sonra, PDM'leri tasarımın belirlediği şekilde plakalar halinde kesmek için monte edilmiş bir giyotin veya tıraş bıçağı kullanın. Bakteriyel-fungal etkileşim cihazı veya BFI cihazı için kullanılan PDM levhasının yanal açıklığını keserken, mikro kanalların tamamen açık olduğundan emin olun. Bununla birlikte, mantar-mantar etkileşim cihazının veya FFI'nın montajında kullanılan PDM plakaları için, her köşe bir cam tabanlı Petri kabına sığacak şekilde kesilmelidir.

Ardından, cihaz tasarımına göre giriş veya çıkış deliklerini delmek için hassas bir kesici kullanın. Daha sonra, PDM plakalarını 0,5 molar sodyum hidroksit çözeltisine batırın. Plakaları% 70'lik bir etanol çözeltisine aktarmadan önce steril çift damıtılmış suda durulayın.

Etanol çıkardıktan ve plakaları tekrar çift damıtılmış steril suyla duruladıktan sonra, plakaları steril çift damıtılmış suya batırın ve beş dakika boyunca sonikat yapın, ardından PDM'lerin levhasını sudan çıkarın, sıkıştırılmış filtrelenmiş hava ile kurutun ve steril kare Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, Petri kabını PDM'ler levha ile bir saat boyunca 70 santigrat derecede bir fırında inkübe edin. Plakalar tozsuz bir ortamda soğuduktan sonra, bant ve sıkıştırılmış filtrelenmiş hava kullanarak yüzeylerindeki tozları temizleyin.

PDM'lerin plakalarının ve cam tabanlı Petri kaplarının yüzeylerini aktive etmek için, daha sonra birbirine bağlanacak şekilde, bunları aktive edilecek yüzeyler yukarı bakacak şekilde bir plazma temizleyiciye yerleştirin. Petri kaplarındaki PDM levhasını plazma temizleyiciden çıkardıktan sonra, aktif yüzeyleri birbirleriyle konformal temas halinde yerleştirerek nazikçe bağlayın. Başarılı yapıştırmayı kontrol etmek için sırasıyla 35 milimetre ve 55 milimetre çapında Petri tabakları ile Bond BFI ve FFI PDM'ler levhası, PDM'lerin laboratuvarını Petri kabından cımbızla çekmeye çalışır.

Aşılama girişlerinin veya mikrokanallarının çökmemesini sağlamak için cihazı gözle veya jenerik mikroskopi ile dikkatlice görselleştirin. Suya doymuş veya besin açısından zengin koşullar için, BFI cihazlarını yapıştırdıktan hemen sonra doldurmak için istenen çözeltinin 100 mikrolitresini pipetleyin. FFI cihazları için, her girişe 30 mikrolitre ortam ekleyin.

Son olarak, nemi korumak için Petri kabına 100 ila 200 mikrolitre steril çift damıtılmış su ekleyin. Bununla birlikte, doymamış su koşulları için, nemi korumak için Petri kabına 100 ila 200 mikrolitre steril çift damıtılmış su ekleyin. Mantar aşılaması için, laminer bir akış davlumbazının içinde, sterilize edilmiş bir mantar delici kullanarak, üç günlük bir kültürün çevresindeki bir koloniden bir agar tapası çıkarın ve büyüyen hifal cephesini sağlam tutmayı sağlayın.

Daha sonra agar fişini BFI ve / veya FFI cihazının mantar girişine, kanalların hifal infiltrasyonunu teşvik etmek için miselyum tarafı hifal ön kısımda mikrokanal açıklıklarına doğru yönlendirilmiş olarak yerleştirin. FFI cihazı için, karşı girişe ikinci bir mantar türü içeren başka bir agar fişi yerleştirin. Daha sonra, Petri kabını şeffaf bir filmle kapatın ve görüntülemeye kadar karanlıkta 25 ila 28 santigrat derecede inkübe edin.

Bakteriyel aşılama için, BFI cihazını inkübatörden çıkardıktan sonra, steril bir ortamda bakteri girişine 10 mikrolitre bakteriyel süspansiyon pipetin. Petri kabı şeffaf bir filmle kapatıldıktan sonra, görüntüleme başlayana kadar cihazı karanlıkta 25 santigrat derecede dik olarak saklayın. Bu protokolü kullanarak, Coprinopsis cinerea mantarı ile Bacillus subtilis bakterisi arasındaki etkileşim başarılı bir şekilde görselleştirilebilir.

Bakterinin varlığında, mantarın büyüme hızının yaklaşık beş saatlik madeni parakülasyondan sonra büyük ölçüde azalmaya başladığı gözlenmiştir. Ayrıca, bakterilerle ilişkili mantar hifleri ince ve şeffaf bir görünüme sahipti. Zaman atlamalı floresan mikroskopisi ayrıca Bacillus subtilis ile beş saatlik sikkeülasyondan sonra mantar hifaj çöküşünü de ortaya çıkardı.

Bununla birlikte, altı saatten itibaren, bakteri popülasyonu da azalmaya başladı. Mantar-mantar etkileşimlerinin görselleştirilmesi, Fusarium graminearum'un, floresan mikroskobu kullanılarak belirgin olan Trichoderma rossicum'un büyümesini güçlü bir şekilde inhibe ettiğini göstermiştir. Bu protokol ayrıca, Pseudomonas synxantha ve Pseudomonas fluorescens bakterilerinin varlığında Verticillium longisporum mantarında önemli morfolojik değişiklikler olduğunu ortaya koymuştur.

Çalışmada kullanılan yüksek çözünürlüklü dinamik görüntüleme tekniğinde Fusarium graminearum'da Clonostachys rosea mantarı varlığında septa oluşumu da saptandı. Floresan etiketleme, FFI cihazında Clonostachys rosea hyphal proliferasyonunun dinamik olarak ölçülmesini sağlamıştır. Bu cihazlar, farklı ilgi alanlarını dahil etmek ve mantar mikrobiyal etkileşimleri ile ilgili spesifik deneysel sorularını ele almak için kullanıcı tarafından uyarlanabilir ve değiştirilebilir.

Hem BFI hem de FFI cihazları, mantarların mantarların, virüslerin, nematodların saldırısı üzerine savunma sinyallerini ve besin maddelerini nasıl yaydığını ortaya koyan ve bakteriyel dağılım üzerine araştırmalara olanak tanıyan bilimsel sınırları zorladı.