Domuz Kalbinde Kapasitif İmmünoprob ile Nöropeptit Dinamiğinin İn Vivo Ölçümü

Bu, peptid verici seviyelerinin in vivo olarak zamana bağlı ölçümü için ilk kez bir yöntem geliştirilmiştir. Tek deneklerdeki ve ayrık konumlardaki peptid verici seviyelerini neredeyse gerçek zamanlı analizlerle ölçebiliriz. İlk olarak, 25 santimetre uzunluğunda perfloroalkoksi kaplı platin tel kesin.

Daha sonra, bir neşter kullanarak, platin teli kesmemeye dikkat ederek, bir ucundan yaklaşık beş milimetre perfloroalkoksi kaplamayı sıyırın. Şimdi, platin telin soyulmuş ucunu altın kaplamalı, bir milimetrelik erkek konektör pimine yerleştirin. Daha sonra, iğne burunlu pense kullanarak, konektör pimi dişlerini platin telin soyulmuş ucunun etrafına sıkın ve platin teli altın kaplama konektör pimine lehimleyin.

Daha sonra, pH altı ile 50 mililitre 10 milimolar PBS'ye 50 miligram dopamin hidroklorür ekleyerek dopamin çözeltisini hazırlayın ve karıştırarak karıştırın. Dopamini tamamen çözdükten sonra, platin telin ucunu taze yapılmış dopamin takviyeli PBS'yi içeren kaba yerleştirin. Gümüş klorür disk elektrodunu baş aşamasındaki toprak kanalına bağlayın.

Daha sonra, gümüş klorür diskini dopamin takviyeli PBS ve platin tel içeren kaba yerleştirin. Daha fazla ilerlemeden önce, baş sahnenin referans kanallarına bir tel şönt bağlayın. Etkileşimli veri toplama yazılımını açın ve Başlangıç potansiyelini eksi 0,6 volt, Bitiş potansiyelini 0,65 volt, Tarama hızını saniyede 0,04 volt ve Biriktirme süresini 420 saniye olarak ayarlayarak bir testere dişi elektro-biriktirme komutu potansiyel protokolü ayarlayın.

Poli-dopamin birikimini tamamladıktan sonra, gümüş klorür öğütülmüş peleti ve platin telin ucunu damardan çıkarın. Tel ucunu iki ila beş dakika boyunca pH 7.4 PBS içeren bir mikrotüpe yerleştirin ve tel ucunun mikrotüpün yanlarına veya altına temas etmediğinden emin olun. Daha sonra, ilgili antikoru pH 7.4 PBS ile uygun büyüklükte bir kapta 1:20 oranında birleştirerek antikor çözeltisini hazırlayın.

Daha sonra, platin elektrodun poli-dopamin biriken ucunu oda sıcaklığında iki saat boyunca antikor çözeltisine batırın, platin tel ucunun çözelti içinde asılı kalmasını ve mikrotüpün iç yüzeyinde durmamasını sağlayın. Kapasitif immünoprobun fonksiyonel ucunu akış odasına yerleştirin, elektrotun ucunu hiçbir şekilde rahatsız etmemeye dikkat edin, çünkü bunu yapmak probun duyusal ucuna zarar verebilir. İlk deneysel testten önce, kapasitif immünoprob probunu koşullandırmak için TBS standart çalışmasını gerçekleştirin ve voltaj protokolü için pozitif adım potansiyelini 110 milivolta, negatif adım potansiyelini eksi beş milivolta, adım süresini 20 milisaniyeye ve edinme süresini 600 saniyeye ayarlayın.

Daha sonra, süperfüzyonun bileşimini korumak için aynı TBS'yi kullanarak ilgilenilen peptid çözeltisini oluşturun. Süperfüzyonun TBS ve peptid takviyeli TBS arasında değiştirilebileceği bir manifold sistemi kurun. TBS standart parametrelerini kullanın ve edinme süresini 360 saniyeye ayarlayarak peptid algılama veri toplama protokolünü ayarlayın.

Poli-dopamin birikiminden önce, platin tel elektrodunun açıkta kalan ucunu 22 gauge hipodermik bir iğneden geçirin ve iğnenin ucunun yaklaşık iki milimetre ötesinde bırakın. Forseps kullanın ve hipodermik iğnenin ucundan sarkan bir diken oluşturmak için platin tel elektrodunun ucunu hafifçe bükün. İğneyi dikenli uçtan yavaşça çekin, iğne sıvıya temas etmeden kaba yerleştirmek için yeterli tel bırakın ve daha önce gösterildiği gibi dopamin birikimine devam edin.

Şimdi, dikenli prob ucunu PBS ile durulayın ve antikor çözeltisine yerleştirin. Ardından, işlevselleştirilmiş ucu PBS'den yavaşça çıkarın. Hipodermik iğneyi dikenli kapasitif immünoproba taşıyın ve altın konektör pimini baş aşamasına takmadan önce nazikçe ilgilenilen bölgeye implante edin.

İmplante edildikten sonra, elektrodu yerinde bırakarak hipodermik iğneyi geri çekin. Komuta potansiyelindeki olumlu bir adım, prob voltajını sıkıştırmak için gereken enjeksiyon akımını ölçer ve kapasitif akımın ölçülmesini sağlar. Negatif komut potansiyel adımı, bağlı peptidi elektrostatik itme yoluyla antikordan temizler.

Adım fonksiyonu komutu dalga formu, peptidin zamana bağlı yinelemeli tespitini ve nicelleştirilmesini tasvir etti. Alt iz, komut potansiyelini ve TBS'deki probun süperfüzyonu altında ortaya çıkan akımı temsil ediyordu. Dengeli kapasitif immünoprob, daha küçük başlangıç çürümesi ve altı dakika boyunca stabil bir taban çizgisi gösterdi.

Nöropeptit Y'nin akış odasına akışı, kapasitif akımları taban çizgisi üzerinde arttırdı. Bir nöropeptit Y antikoru işlevselleştirilmiş prob ile ölçülen kapasitif immünoprob akımları, düşük pikomol nöropeptid Y'ye duyarlı konsantrasyona bağımlı bir sinyal gösterdi Kalibrasyon için, test edilen tüm konsantrasyonlar için standart bir eğri ölçüldü. Bilateral stellat ganglionun uyarılması, negatif kontrol kapasitif akımları ile birlikte çizildiğinde yüksek nöropeptid Y gösterdi.

Stellat stimülasyonu altında ölçülen norepinefrin salınım, uyarılmış bir sempatik yanıt ile tutarlı olarak nöropeptit Y ile senkron bir salınım gösterdi. Bu tekniklerin geliştirilmesi, kardiyak aktivitenin anahtar modülatörlerinin intraoperatif okumalarını sağlayabilir, böylece potansiyel hızlı terapötik veya girişimsel rehberlik sağlayabilir. Burada sunulan teknik kardiyovasküler dağılım için spesifiktir, ancak tekniğin kendisi idrar, iskelet kası, böbrekler, yağ dokusu vb. gibi diğer fizyolojik ayarlar için uygundur.