Name: Domuz Kalbinde Kapasitif İmmünoprob ile Nöropeptit Dinamiğinin İn Vivo Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Keşfedin kapasitif immünoprob biyosensör ile domuz kalbinde neuropeptit dinamiğinin zaman çözümlü ölçüm yöntemini. Bu teknik, tek deneklerde ve belirli konumlarda yakın gerçek zamanlı analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

İn vivo deneyler için uzman desteği için Dr. Olu Ajijola'ya (UCLA Kardiyak Aritmi Merkezi) teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH U01 EB025138 (JLA, CS) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri, Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles Hayvan Araştırma Komitesi tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (8. baskı, 2011) tarafından belirtilen yönergeleri izleyerek gerçekleştirilmiştir. Yaklaşık 75 kg'lık yetişkin erkek Yorkshire domuzları in vivo çalışmalar için kullanılmıştır10.
1. Kapasitif immünoprob üretimi ve işlevselleştirme
<ol><li>25 cm uzunluğunda perfloroalkoksi (PFA) kaplı platin teli kesin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve platin teli kesmemeye dikkat ederek bir neşter kullanarak bir ucundan yaklaşık 5 mm PFA kaplamayı sıyırın.</li>
	<li>Platin telin soyulmuş ucunu altın kaplama 1 mm'lik bir erkek konektör pimine yerleştirin ve iğne burunlu pense kullanarak konektör pimi dişlerini platin telin soyulmuş ucunun etrafına sıkın (bkz.</li>
	<li>Platin teli altın kaplama konektör pimine lehimleyin. Aşırı miktarda lehim kullanmamaya dikkat edin.</li>
	<li>50 mg dopamin HCl'yi karıştırarak 10 mM fosfat tamponlu salinin (PBS, pH 6.0) 50 mL'sinde çözerek dopamin çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Dopamin tamamen çözündükten sonra, platin telin ucunu taze yapılmış dopamin takviyeli PBS'yi içeren kaba yerleştirin. Altın konektör pimini başlığın bir kanalına takın (bkz.</li>
	<li>AgCl disk elektrodunu (topraklama elektrodu, bakınız Malzeme Tablosu) baş sahnesindeki toprak kanalına bağlayın. AgCl diskini dopamin takviyeli PBS ve platin tel içeren kaba yerleştirin; sadece disk elektrodunu suya batırmaya dikkat edin, telin veya lehimin herhangi bir uzunluğuna dikkat etmeyin. Devam etmeden önce başlığın referans kanallarına bir tel şönt bağlayın.</li>
	<li>Etkileşimli veri toplama yazılımını açın (bkz. Aşağıdaki parametrelerle bir testere dişi elektrodepozisyon komutu potansiyel protokolü hazırlayın: başlangıç potansiyeli = -0,6 V; bitiş potansiyeli = +0,65 V; tarama hızı = 0,04 V∙s-1; biriktirme süresi = 420 s. Tüm tellerin düzgün bir şekilde bağlandığından emin olmak için polidopamin biriktirme protokolüne başlayın.</li>
	<li>Polidopamin birikimini tamamladıktan sonra, AgCl öğütülmüş peleti ve platin telin ucunu gemiden çıkarın, platin tel elektrodunun ucunu rahatsız etmemeye dikkat edin. Telin ucunu, antikor çözeltisi hazırlanırken 2-5 dakika boyunca PBS (pH 7.4) içeren bir mikrotüpe yerleştirin; tel ucunun mikrotüpün yanlarına veya altına temas etmediğinden emin olun. NOT: Polidopamin birikimi sırasında antikor çözeltisi yapılabilir; Bununla birlikte, polidopamin birikimini takiben platin telin dopamin içeren damardan PBS mikrotüpüne aktarılması atlanmamalıdır.</li>
	<li>Antikor çözeltisini hazırlayın. İlgili antikoru PBS (pH 7.4) ile uygun büyüklükte bir kapta (örneğin, bir mikrotüp) 1:20 oranında birleştirin. NOT: Burada kullanılan anti-NPY monoklonal antikoru (bakınız Malzeme Tablosu) 1 mg/mL'de aliquoted edilmiştir; Buradaki örnek bir antikor preparatı, 76 μL PBS'ye karşı 4 μL antikor olacaktır.</li>
	<li>Platin elektrodun polidopamin biriktirilmiş ucunu oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca antikor çözeltisine batırın, yine platin tel ucunun çözelti içinde asılı kalmasını ve mikrotüpün iç yüzeyinde durmamasını sağlayın. NOT: Bu tekniğin yakın zamanda uygulanması, daha sonra kullanmak üzere ıslak veya kuru depolama yerine bu adımdan hemen sonra platin tel elektrodunun kullanılmasını tercih etmiştir.</li>
	<li>Antikor çözeltisine batırıldıktan sonra, yeni işlevselleştirilmiş kapasitif immünoprob (CI probu) ucunu PBS'de (pH 7.4) kısaca durulayın. Prob artık kullanıma hazırdır.</li>
</ol>2. Peptitin in vitro tespiti ve ölçümü için deneysel kurulum
<ol><li>CI probunun fonksiyonel ucunu akış odasına yerleştirin, elektrotun ucunu hiçbir şekilde rahatsız etmemeye dikkat edin, çünkü bunu yapmak probun duyusal ucuna zarar verebilir. NOT: Akış odası, silikon elastomerin (bakınız Malzeme Tablosu) 35 mm'lik bir kültür kabına dökülmesiyle ve kabın ortasında uzun bir oval boşluk dolgusu ile oluşturulmuştur. Sertleştikten sonra, oval şekil elastomerden çıkarılır. Oda daha sonra Tris tamponlu salin (TBS) ile süperfüzyona tabi tutulur ve 3 mL / dak'lık bir akış hızına izin verilir. Giriş ve çıkışın odadaki sıvı seviyesini koruduğundan emin olun, böylece süperfüzyonatın gelgit hareketi gözlenmez. Akış, CI probu kullanımda olduğu sürece yerinde kalmalıdır.</li>
	<li>İlk deneysel testten önce, CI probunu koşullandırmak için TBS standart çalıştırması gerçekleştirin. Aşağıdaki komut voltajı protokolünü ayarlayın: pozitif adım potansiyeli = +100 mV; negatif adım potansiyeli = −5 mV; adım süresi = 20 ms; edinme süresi = 600 s. NOT: Veri toplamadan önce döngü komuta potansiyelinin ilk aşamasında probun dengelenmesine izin vermek önemlidir.</li>
	<li>Süperfusatın bileşimini korumak için aynı TBS'yi kullanarak ilgilenilen peptidin bir çözeltisini oluşturun. Süperfüzyonun, boru sistemine veya akış odasına kabarcıklar sokmadan TBS ve peptid takviyeli TBS arasında değiştirilebileceği bir manifold sistemi kurun. NOT: Bu çalışmada sentetik domuz NPY peptidi (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılmıştır.</li>
	<li>TBS standart parametrelerini kullanarak peptid algılama veri toplama protokolünü ayarlayın (bkz. adım 2.2.). NOT: Bu uygulamada, her deneysel testin süresi 360 s idi (120 s TBS, 120 s peptid takviyeli TBS, 120 s TBS).</li>
</ol>3. Kİ probunun in vivo kullanım için uyarlanması
<ol><li>Polidopamin birikiminden önce (adım 1.7.), platin tel elektrodunun açıkta kalan ucunu 22 G hipodermik bir iğneden geçirin ve iğnenin ucunun yaklaşık 2 mm ötesinde bırakın. Forseps kullanarak, platin tel elektrodunun ucunu yavaşça geriye doğru bükün ve hipodermik iğnenin ucundan sarkan bir "diken" oluşturun.<ol>
<li>İğneyi dikenli uçtan yavaşça çekin, iğne sıvıya temas etmeden kaba yerleştirmek için yeterli tel bırakın. 1.4.-1.11 adımlarıyla devam edin. NOT: İn vivo kuruluma bağlı olarak, 25 cm'den daha uzun bir platin tel uzunluğunun kesilmesi gerekebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CI probunu ana merkeze bağlamadan önce, tüm elektrik kurulumunun doğru şekilde topraklandığından emin olun. Bunun yapılmaması, deneysel kayıtlar sırasında istenmeyen elektriksel parazitlere neden olabilir.</li>
	<li>Daha önce yayınlanmış bir rapor10'u takiben hayvanları uyuşturun.</li>
	<li>İlgilenilen bölgeyi ortaya çıkarmak için ameliyat yapın. NOT: Bu çalışmada kalbi açığa çıkarmak için medyan sternotomi uygulanmıştır. Hayvan cerrahisi ile ilgili ayrıntılar için lütfen Kluge ve ark.10'a bakınız.</li>
	<li>İşlevselleştirilmiş ucu PBS durulamasından nazikçe çıkarın (adım 1.11.), hidodermik iğneyi dikenli C.I. probuna ilerletin ve altın konektör pimini baş kısmına takmadan önce nazikçe ilgili bölgeye yerleştirin. İmplante edildikten sonra, elektrodu yerinde bırakarak hipodermik iğneyi geri çekin. NOT: Bu çalışmada prob sol ventrikül miyokard10'un orta-lateral duvarına yerleştirildi.</li>
	<li>Uygun elektrik kurulumunu sağladıktan sonra, standart ve deneysel test protokolleriyle devam edin (adım 2.2. ve adım 2.4.).</li>
	<li>Deneylerin tamamlanmasının ardından, kurumsal olarak onaylanmış teknikleri izleyerek hayvanı ötenazi yapın. NOT: Bu çalışmada, hayvanlar derin anestezi altında ventriküler fibrilasyon indüksiyonu ile ötenazi10.</li>
</ol>

<ol><li>Chow, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Biomarkers+for+the+prevention%2C+assessment%2C+and+management+of+heart+failure%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).</li>
<li>Goldstein, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenal+responses+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Adrenal responses to stress.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (8), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+plasma+neuropeptide-Y+in+coronary+care+unit+patients+with+and+without+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).</li>
<li>Farrell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+modulates+catecholamine+release+into+interstitial+fluid+of+canine+myocardium+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).</li>
<li>Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathectomy+and+spinal+cord+stimulation+attenuate+reflex-mediated+norepinephrine+release+during+ischemia+preventing+ventricular+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation.</a> JCI Insight. 4 (23), 131648(2019).</li>
<li>Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+Y+and+sympathetic+control+of+heart+contractility+and+coronary+vascular+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).</li>
<li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+neurocardiology%3A+development%2C+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li>
<li>Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+activation+circumvents+high-dose+beta+blocker+therapy+in+part+through+release+of+neuropeptide+Y%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y.</a> JCI Insight. 5 (11), 135519(2020).</li>
<li>Rigel, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neuropeptides+on+heart+rate+in+dogs%3A+comparison+of+VIP%2C+PHI%2C+NPY%2C+CGRP%2C+and+NT%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT.</a> American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).</li>
<li>Kluge, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+cardiac+neuropeptide+dynamics+by+capacitive+immunoprobe+in+the+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).</li>
<li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitive+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Electroanalysis%22%5BJournal%5D)">Capacitive biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li>
<li>Prodromidis, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedimetric+immunosensors-A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Electrochimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Impedimetric immunosensors-A review.</a> Electrochimica Acta. 55 (14), 4227-4233 (2010).</li>
<li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318 (5849), 426-430 (2007).</li>
<li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+catecholamines+from+individual+adrenal+medullary+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells.</a> Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).</li>
<li>Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+selective+cyclic+voltammetric+measurements+of+epinephrine+and+norepinephrine+as+a+method+to+measure+secretion+from+single+bovine+adrenal+medullary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells.</a> Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).</li>
<li>Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrasynaptic+vesicular+transmitter+release+from+the+somata+of+substantia+nigra+neurons+in+rat+midbrain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).</li>
<li>Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+splanchnic+nerve+and+chromaffin+cell+stimulation+in+mouse+adrenal+slices+with+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).</li>
<li>Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+recombinant+Ca%28v%293.2%2C+T-type%2C+Ca%282%2B%29+channel+currents+by+CaMKIIgamma%28C%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C).</a> The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).</li>
<li>Chan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+in+vivo+detection+of+myocardial+norepinephrine+levels+in+the+beating+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).</li>
<li>Chow, R. H., von Rüden, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChow%2C+RH+%22Single-Channel+Recording%2C+Second+Edition%22">Single-Channel Recording, Second Edition</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 245-275 (1995).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile%2C+high+efficiency+immobilization+of+lipase+enzyme+on+magnetic+iron+oxide+nanoparticles+via+a+biomimetic+coating%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating.</a> BMC Biotechnology. 11, 63(2011).</li>
</ol>

Yazarlar, finansal veya başka türlü hiçbir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Mevcut protokol, hem in vitro hem de in vivo ortamlarda ilgilenilen biyobelirteçleri tespit edebilen ve ölçebilen kapasitif bir immünoprobun (CI probu) üretimini ve test edilmesini açıklamaktadır. Algılama, biyobelirtecin elektrot ucunda hapsedilmesiyle elde edilir. Yakalama olayı, bir platin tel kapasitif immünoprob ile çevresindeki iletken sıvı ortamı arasındaki kapasitif bağlantıyı değiştirir ve probun potansiyel bir kaymasına yanıt olarak yük akımında bir değişiklik olarak ölçülür. Ayrıca, sıkışmış ...

Biyobelirteçlerin tespiti ve nicelleştirilmesi için çeşitli kimyasal yöntemler, hem protein kimyasında hem de klinik tanılarda, özellikle kanser tanılarında ve kardiyovasküler hastalık progresyonunun değerlendirilmesinde rutin olarak kullanılmaktadır. Günümüzde, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ve kütle spektrometresi gibi yöntemler, toplu sıvı çekme yoluyla vasküler bölme 1,2,3'ten veya mikrodiyaliz ile interstisyel bölmeden numune toplanmasına dayanmaktadır. Mikrodiyaliz, ilgilenilen bir bölgeye yerleştirilen bilinen uzunlukta yarı geçirgen bir membran tüpü kullanır. Toplama sıvısı, analiz5 içinnumuneyi toplamak için birkaç dakika 4 boyunca tüpün içinden geçirilir, böylece zamansal çözünürlüğü sınırlar. Bu şekilde, toplanan örnekler sadece yerel mikro çevrenin zaman içinde ortalama bir değerini sağlar ve perfüzyon hızı ve yeterli numune hacminin toplanması ile sınırlıdır. Ayrıca, bu yöntemler deneysel verilerin ve sinyal ortalamasının bir araya getirilmesini gerektirir; bu nedenle, denekler arasındaki değişkenliği hesaba katmayabilir. Daha da önemlisi, numune toplama ve sonraki çevrimdışı analiz arasındaki süre, acil klinik müdahale ve terapötikleri engellemektedir.
Mevcut protokolde, spesifik biyoaktif peptitlerin zamana bağlı elektriksel tespiti için kapasitif immünoprob biyosensörünün (CI probu) kullanımı özetlenmiştir. Vaskülatür, endokard, kardiyomiyositler ve intrakardiyak gangliyonları innerve eden post-gangliyonik sempatik nöronlardan salınan nöropeptit Y (NPY), kardiyovasküler sistemde majör bir nöromodülatör peptid vericisidir 6,7,8,9. Burada sunulan yöntem NPY'yi ölçmek için tasarlanmıştır ve deneysel fizibilite bir domuz kalp modelinde gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, seçici bir antikorun mevcut olduğu herhangi bir biyoaktif peptit için geçerlidir10. Bu yöntem, bir platin tel probu ile işlevselleştirilmiş uç11,12'deki iletken sıvı arasındaki kapasitif bağlantıya dayanır. Bu uygulamada, elektrot ucuna bağlanan ve iletken sıvı ortamına bakan hedef nöropeptide (NPY) karşı bir antikor aracılığıyla etkileşime aracılık edildi. Bu işlevselleştirme, reaktif polidopaminin platin tel probu10,13'ün ucuna elektrodepozisyonu ile sağlandı.
Antikor işlevselleştirilmiş prob in vivo olarak ilgi çekici bir bölgeye yerleştirildiğinde, uyarılmış endojen NPY salınımı prob ucundaki tutucu antikorlara bağlanmaya yol açar ve elektrot yüzeyindeki iletken sıvı NPY proteini tarafından yer değiştirir. Elektriksel ortamdaki lokal değişiklik, yüksek hareketlilikli, yüksek dielektrik sıvının hareketsiz, statik yüklü bir molekülle yer değiştirmesine neden olur. Bu, elektrot-akışkan arayüzünü ve dolayısıyla bir adım fonksiyonlu komut potansiyeline yanıt olarak yük akımındaki bir değişiklik olarak ölçülen kapasitansını değiştirir. Her bir ölçüm döngüsünün hemen ardından, bağlı NPY'yi elektrostatik etkileşim yoluyla antikordan itmek için negatif bir "sıfırlama" potansiyeli kullanılır, böylece sonraki ölçüm10 turları için antikor bağlanma bölgeleri temizlenir. Bu, NPY'nin zaman çözümlü bir şekilde ölçülmesine etkili bir şekilde izin verir. Benzersiz CI tekniği, veri havuzu oluşturmadan veya birkaç deney üzerinde sinyal ortalaması olmadan tek bir deneyden dinamik biyobelirteç seviyelerini ölçmek için yukarıda özetlenen mikrodiyaliz tabanlı immünokimyasal yöntemlerin sınırlamalarının üstesinden gelir9 ve neredeyse gerçek zamanlı olarak veri sağlar. Ayrıca, bu yöntemi, zaman içinde çözülmüş ve lokalize bir ölçekte uygun bir antikorun bulunduğu herhangi bir biyobelirteç ile uyarlama yeteneği, hastalık progresyonunun değerlendirilmesi ve terapötik müdahalelerin yönlendirilmesi için immünokimyasal ölçümlerde önemli bir teknik ilerleme sağlamaktadır.
Veri toplama ve analiz yazılımı, IGOR Pro'da (tamamen etkileşimli bir yazılım ortamı) özel olarak yazılmıştır. Bir analogdan dijitale dönüştürücü (A/D) sistemi, bilgisayar kontrolü altında bir komut voltajı yayınladı ve özel bir amplifikatörden veri aldı. Amplifikatör bazı benzersiz özelliklere sahipti. Bunlar, elektrotun değişkenliğini entegre etmek için 1 MOhm veya 10 MOhm geri besleme voltajı kelepçesi devresinin seçilmesine izin veren dört edinme kanalının her biri için bir geri besleme direnci (değiştirilebilir) içeriyordu. Dört edinme kanalının tümü için tek bir kafaya ve karşılıklı topraklama / referans devresine sahip bir sahne ünitesi de cihazı göğsün yakınına tek bir fiziksel modüle yerleştirmek için inşa edildi. Bildirilen tüm verileri toplamak için 1 MOhm geri besleme direnci ayarı kullanılmıştır.
Filtre ve kazanç ayarları amplifikatörden telgrafla çekildi ve veri dosyasına kaydedildi. Veriler, 10 kHz'de sayısallaştırılmış 2 kutuplu analog Bessel filtresi ile 1 kHz'de filtrelendi. Prob ve çevresindeki iletken çözelti arasındaki potansiyel farkı, prob ucunda bir Helmholtz kapasitif tabaka oluşturur. Ligandın prob ucundaki antikora bağlanması, lokal yükün değişmesine ve dolayısıyla Helmholtz kapasitansında bir değişikliğe neden olur. Devrenin kapasitif bileşenindeki bu değişiklik, probu adım fonksiyonlu voltaj protokolündeki potansiyele getirmek için gereken enjekte edilen yükün büyüklüğünde bir kaymaya neden olur. Böylece, belirli bir ligandın işlevselleştirilmiş proba bağlanması, pik kapasitif akımda bir değişiklik olarak elektrot kapasitans ölçümünde bir değişikliğe neden olur.

<table><tbody><tr><td>AgCl disk elektrot</td><td>Warner Instruments (Holliston, MA)</td><td>64-1307</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NPY monoklonal antikor</td><td>Abcam, (Cambridge, MA)</td><td>ab112473</td><td></td></tr><tr><td>Özel çok kanallı amplifikatör/ 1 M&Omega; geri besleme direnci çok kanallı headstage</td><td>NPI Electronic, (Tamm, Almanya)</td><td>NA</td><td>NPI'ye dayalı VA-10M çok kanallı amplifikatör</td></tr><tr><td>Dopamin HCl</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>H8502-10G</td><td></td></tr><tr><td>Altın kaplama erkek konnektör pimi</td><td>AMP-TE Bağlantı (Amplimite)</td><td>6-66506-1</td><td></td></tr><tr><td>HEKA LIH 8+8 analogdan dijitale/dijitalden analoğa cihaz</td><td>HEKA Elektronik, (Holliston, MA)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro veri toplama yazılımı, v. 7.08</td><td>WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)</td><td></td><td>Yazılım sürüş komut potansiyeli ve veri toplama özel olarak yazılmıştır</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Standart Dijital peristaltik pompa</td><td>Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA kaplı platin tel</td><td>A-M Sistemleri, (Sequim, WA)</td><td>773000</td><td>0,005" çıplak çap, 0,008" kaplamalı çap</td></tr><tr><td>Silikon elastomer</td><td>World Precision Instruments (Sarasota, FL)</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Sentetik domuz NPY peptidi</td><td>Bachem (Torrance, CA)</td><td></td><td></td>4011654</tr><tr><td>Sentetik domuz NPY peptidi</td><td>Bachem (Torrance, CA)</td><td>4011654</td><td></td></tr></tbody></table>

domuz kalbinde kapasitif İmmünoprob ile nöropeptit dinamiğinin İn vivo Ölçümü

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Hastalığın ilerlemesinin değerlendirilmesi ile ilgili biyobelirteçleri in vivo olarak ölçme yeteneği, bilimsel ve tıbbi topluluklar için büyük ilgi çekicidir. Belirli biyobelirteçleri ölçmenin mevcut yöntemlerinden elde edilen sonuçların çözünürlüğü, hem mekansal hem de geçici olarak çözünürlükte sınırlı olabileceğinden elde edilmesi birkaç gün veya hafta sürebilir (örneğin, enzime bağlı immünosorbent testi [ELISA], yüksek performanslı sıvı kromatografisi [HPLC] veya kütle spektrometrisi ile analiz edilen interstisyel sıvının sıvı bölmesi mikrodiyalizi); böylece zamanında tanı ve tedavi rehberlikleri bozulur. Bu çalışmada, kapasitif immünoprob biyosensörü (CI probu) kullanılarak peptid transmitterlerinin in vivo olarak saptanması ve ölçülmesi için benzersiz bir teknik bildirilmiştir. Bu probların üretim protokolü ve in vitro karakterizasyonu tanımlanmıştır. Sempatik stimülasyonla uyarılan nöropeptit Y (NPY) salınımının in vivo ölçümleri sağlanmaktadır. NPY salınımı referans olarak norepinefrin sempatik salınımı ile ilişkilidir. Veriler, nöropeptitlerin in vivo hızlı ve lokalize ölçümü için bir yaklaşım göstermektedir. Gelecekteki uygulamalar, hastalık progresyonunun intraoperatif gerçek zamanlı değerlendirmesini ve bu probların minimal invaziv kateter bazlı yayılımını içermektedir.

Elektrot üretimi ve karakterizasyonu Esnek bir kapasitif immünoprob (CI probları) üretildi ve Şekil 1A'da temsili bir görüntü tasvir edildi. Elektrot potansiyeli, bilgisayar kontrollü bir voltaj kelepçesi devresi tarafından ayarlandı (Şekil 1B) ve elektrot, PBS'de yapılan bir polidopamin çözeltisine daldırıldı. Polidopamin, işlevselleştirme için iletken elektrot ucu13 üzerine elektro-olarak yatırıldı. Komuta potansiyel...

Peptit vericilerini in vivo olarak ölçmek için yerleşik immünokimyasal yöntemler, çevrimdışı analiz için numune almak üzere mikrodiyaliz veya dökme sıvı çekilmesine dayanır. Bununla birlikte, bunlar mekansal zamansal sınırlamalardan muzdariptir. Mevcut protokol, mevcut tekniklerin sınırlamalarının üstesinden gelen kapasitif bir immünoprob biyosensörünün üretimini ve uygulanmasını açıklamaktadır.

Domuz Kalbinde Kapasitif İmmünoprob ile Nöropeptit Dinamiğinin İn Vivo Ölçümü

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Bu, peptid verici seviyelerinin in vivo olarak zamana bağlı ölçümü için ilk kez bir yöntem geliştirilmiştir. Tek deneklerdeki ve ayrık konumlardaki peptid verici seviyelerini neredeyse gerçek zamanlı analizlerle ölçebiliriz. İlk olarak, 25 santimetre uzunluğunda perfloroalkoksi kaplı platin tel kesin.Daha sonra, bir neşter kullanarak, platin teli kesmemeye dikkat ederek, bir ucundan yaklaşık beş milimetre perfloroalkoksi kaplamayı sıyırın. Şimdi, platin telin soyulmuş ucunu altın kaplamalı, bir milimetrelik erkek konektör pimine yerleştirin. Daha sonra, iğne burunlu pense kullanarak, konektör pimi dişlerini platin telin soyulmuş ucunun etrafına sıkın ve platin teli altın kaplama konektör pimine lehimleyin.Daha sonra, pH altı ile 50 mililitre 10 milimolar PBS'ye 50 miligram dopamin hidroklorür ekleyerek dopamin çözeltisini hazırlayın ve karıştırarak karıştırın. Dopamini tamamen çözdükten sonra, platin telin ucunu taze yapılmış dopamin takviyeli PBS'yi içeren kaba yerleştirin. Gümüş klorür disk elektrodunu baş aşamasındaki toprak kanalına bağlayın.Daha sonra, gümüş klorür diskini dopamin takviyeli PBS ve platin tel içeren kaba yerleştirin. Daha fazla ilerlemeden önce, baş sahnenin referans kanallarına bir tel şönt bağlayın. Etkileşimli veri toplama yazılımını açın ve Başlangıç potansiyelini eksi 0,6 volt, Bitiş potansiyelini 0,65 volt, Tarama hızını saniyede 0,04 volt ve Biriktirme süresini 420 saniye olarak ayarlayarak bir testere dişi elektro-biriktirme komutu potansiyel protokolü ayarlayın.Poli-dopamin birikimini tamamladıktan sonra, gümüş klorür öğütülmüş peleti ve platin telin ucunu damardan çıkarın. Tel ucunu iki ila beş dakika boyunca pH 7.4 PBS içeren bir mikrotüpe yerleştirin ve tel ucunun mikrotüpün yanlarına veya altına temas etmediğinden emin olun. Daha sonra, ilgili antikoru pH 7.4 PBS ile uygun büyüklükte bir kapta 1:20 oranında birleştirerek antikor çözeltisini hazırlayın.Daha sonra, platin elektrodun poli-dopamin biriken ucunu oda sıcaklığında iki saat boyunca antikor çözeltisine batırın, platin tel ucunun çözelti içinde asılı kalmasını ve mikrotüpün iç yüzeyinde durmamasını sağlayın. Kapasitif immünoprobun fonksiyonel ucunu akış odasına yerleştirin, elektrotun ucunu hiçbir şekilde rahatsız etmemeye dikkat edin, çünkü bunu yapmak probun duyusal ucuna zarar verebilir. İlk deneysel testten önce, kapasitif immünoprob probunu koşullandırmak için TBS standart çalışmasını gerçekleştirin ve voltaj protokolü için pozitif adım potansiyelini 110 milivolta, negatif adım potansiyelini eksi beş milivolta, adım süresini 20 milisaniyeye ve edinme süresini 600 saniyeye ayarlayın.Daha sonra, süperfüzyonun bileşimini korumak için aynı TBS'yi kullanarak ilgilenilen peptid çözeltisini oluşturun. Süperfüzyonun TBS ve peptid takviyeli TBS arasında değiştirilebileceği bir manifold sistemi kurun. TBS standart parametrelerini kullanın ve edinme süresini 360 saniyeye ayarlayarak peptid algılama veri toplama protokolünü ayarlayın.Poli-dopamin birikiminden önce, platin tel elektrodunun açıkta kalan ucunu 22 gauge hipodermik bir iğneden geçirin ve iğnenin ucunun yaklaşık iki milimetre ötesinde bırakın. Forseps kullanın ve hipodermik iğnenin ucundan sarkan bir diken oluşturmak için platin tel elektrodunun ucunu hafifçe bükün. İğneyi dikenli uçtan yavaşça çekin, iğne sıvıya temas etmeden kaba yerleştirmek için yeterli tel bırakın ve daha önce gösterildiği gibi dopamin birikimine devam edin.Şimdi, dikenli prob ucunu PBS ile durulayın ve antikor çözeltisine yerleştirin. Ardından, işlevselleştirilmiş ucu PBS'den yavaşça çıkarın. Hipodermik iğneyi dikenli kapasitif immünoproba taşıyın ve altın konektör pimini baş aşamasına takmadan önce nazikçe ilgilenilen bölgeye implante edin.İmplante edildikten sonra, elektrodu yerinde bırakarak hipodermik iğneyi geri çekin. Komuta potansiyelindeki olumlu bir adım, prob voltajını sıkıştırmak için gereken enjeksiyon akımını ölçer ve kapasitif akımın ölçülmesini sağlar. Negatif komut potansiyel adımı, bağlı peptidi elektrostatik itme yoluyla antikordan temizler.Adım fonksiyonu komutu dalga formu, peptidin zamana bağlı yinelemeli tespitini ve nicelleştirilmesini tasvir etti. Alt iz, komut potansiyelini ve TBS'deki probun süperfüzyonu altında ortaya çıkan akımı temsil ediyordu. Dengeli kapasitif immünoprob, daha küçük başlangıç çürümesi ve altı dakika boyunca stabil bir taban çizgisi gösterdi.Nöropeptit Y'nin akış odasına akışı, kapasitif akımları taban çizgisi üzerinde arttırdı. Bir nöropeptit Y antikoru işlevselleştirilmiş prob ile ölçülen kapasitif immünoprob akımları, düşük pikomol nöropeptid Y'ye duyarlı konsantrasyona bağımlı bir sinyal gösterdi Kalibrasyon için, test edilen tüm konsantrasyonlar için standart bir eğri ölçüldü. Bilateral stellat ganglionun uyarılması, negatif kontrol kapasitif akımları ile birlikte çizildiğinde yüksek nöropeptid Y gösterdi.Stellat stimülasyonu altında ölçülen norepinefrin salınım, uyarılmış bir sempatik yanıt ile tutarlı olarak nöropeptit Y ile senkron bir salınım gösterdi. Bu tekniklerin geliştirilmesi, kardiyak aktivitenin anahtar modülatörlerinin intraoperatif okumalarını sağlayabilir, böylece potansiyel hızlı terapötik veya girişimsel rehberlik sağlayabilir. Burada sunulan teknik kardiyovasküler dağılım için spesifiktir, ancak tekniğin kendisi idrar, iskelet kası, böbrekler, yağ dokusu vb. gibi diğer fizyolojik ayarlar için uygundur.

time-resolved-vivo-measurement-neuropeptide-dynamics-capacitive

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, kapasitif bir immünoprob biyosensörü kullanarak peptit vericilerini tespit etmek ve ölçmek için bir yöntemi gösterir. Antikorlarla kaplanmış işlevselleştirilmiş elektrot, ilgilenilen peptitlerle etkileşime girerek, peptitlerin hassas ölçümüne ve tespitine izin veren bir sinyal değişikliğine yol açar.

Kapasitif İmmünoprob Biyosensörü Kullanarak Hedef Peptit Tespiti ve Ölçümü

Bu makalede, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde ayrıntılı protokol ve transmembran potansiyeli (V m) ikili optik haritalama ve ücretsiz içi sarkoplazmik retikulum (SR) için gerekli donanımın Ca 2+ açıklanır. Bu yöntem, sağlam kalbinde, doğrudan gözlem ve V m ölçümü ve SR Ca 2 + dinamikleri sağlar.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

kalbinde, moleküler olaylar organın elektrik ve kasılma fonksiyonunu koordine ederler. Burada sunulan yerel alan floresan mikroskopi teknikleri bir dizi sağlam kalplerinde hücresel değişkenlerin kaydedilmesini sağlar. kalp fonksiyonlarını tanımlayan mekanizmaları belirleme kalp patolojik durumlar altında nasıl çalıştığını anlamada önemlidir.

Yerel Alan Floresan Mikroskopi: Bozulmamış Kalpler Hücresel Sinyalleri Görüntüleme

Burada, bir iletişim kuralı modülasyonu intrakardiyak otonom sinir sistemi ve temel Elektrofizyoloji, arrhythmogenesis ve ex vivo Langendorff kurulumu kullanarak kamp dinamikleri üzerindeki etkisi değerlendirilmesi için mevcut.

Kardiyak Elektrofizyoloji ve Arrhythmogenesis bir Ex Vivo Langendorff sisteminde intrakardiyak nöronların etkisi

Bu makale, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyosit (hiPSC-CM) ağlarının gelişimi için bir dizi protokolün yanı sıra, hücre membranı hareket potansiyeli ölçümleri için ters şekilde electroporate etmek için multiwell MEA plakaları üzerinde kültürlü bir set içerir. Yüksek verimlilik kayıtları aynı hücre sitelerinden gün içinde tekrar tekrar elde edilir.

Tekrarlayan eylem potansiyel kayıtlar için Multiwell mikro elektrot diziler üzerinde insan iPSC-türetilen Kardiyomiyoksit ağları

Bu çalışmanın amacı, kardiyak dinamiği n çevirisel bir hayvan modeli kullanarak araştırmak için bir yöntem oluşturmaktır. Açıklanan deneysel yaklaşım, izole, bozulmamış bir domuz kalp modelindeki elektriksel aktiviteyi değerlendirmek için elektrofizyolojik bir çalışma ile birlikte çift emisyonlu optokardiografi içerir.

Ex Vivo Langendorff perfüzyonlu Kalplerin Optokardiyografi ve Elektrofizyoloji Çalışmaları

Eksvivo görüntüleme sistemlerini kullanan hücre penetran peptidler ile transdüksiyon derecesini değerlendirmek için protokolleri, parafin katıştırma, kesitleme ve konfokal floresan mikroskopisi kalp hedefleme peptidini örnek olarak kullanarak açıklıyoruz. Protokolümüzde, tek bir hayvan aynı organların her iki tür de görüntüleme değerlendirmesini elde etmek için kullanılabilir ve bu da çalışmalar için gerekli hayvan sayısını yarı yarıya azaltabilir.

Kardiyak Hedefleme Peptidin Transdüksiyon Verimlerinin Vivo Görüntülemesinde

Bu protokol, farelerdeki hız yapma kusurlarını tanımlamak için tüm sinoatriyal düğüm dokusunun mikroelekrod dizi kaydını kullanarak içsel kardiyak ateşleme hızını ölçmek için yeni bir metodoloji tanımlamayı amaçlamaktadır. Farmakolojik ajanlar, içsel tempo yapımı üzerindeki etkilerini incelemek için bu yöntemde de tanıtılabilir.

Farelerde İçSel Kardiyak Pacemaking Kusurlarını Belirlemek için Sinoatrial Düğüm Ateşleme Hızının Mikroelekrod Dizisi Kaydı

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hastalık modellemesi için umut verici bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Burada, hiPSC-CM'lerin kontraktilitesini ve elektrofizyolojisini ölçmek için bir protokol detaylandırıyoruz.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositler Üzerindeki Mikroelektrot Dizisi ve Yama Kelepçesi Kayıtlarının Teknik Uygulamaları

Bu protokol, biyoelektronik araştırmaları için hassas kardiyak stimülasyon, kayıt ve enfarktüs modellemesi sağlayan optik ve elektriksel çift yönlü biyoarayüz için gelişmiş malzeme üretimi ve ex vivo sıçan kalbi yöntemlerini ana hatlarıyla belirtir.

Sağlıklı ve İskemik Ex Vivo Sıçan Kalplerinde Çift Yönlü Elektrik ve Optoelektronik Arayüzler

Keşfedin kapasitif immünoprob biyosensör ile domuz kalbinde neuropeptit dinamiğinin zaman çözümlü ölçüm yöntemini. Bu teknik, tek deneklerde ve belirli konumlarda yakın gerçek zamanlı analiz sağlar.

Domuz Kalbinde Kapasitif İmmünoprob ile Nöropeptit Dinamiğinin İn Vivo Ölçümü

Daha fazla video keşfet