Radyoaktif Etiketli Antikorların İmmobilize Antijenlere Bağlanma Afinitesinin (K_D) Belirlenmesi

Bu yöntem, radyoaktif işaretli bir antikorun antijeni için bağlanma afinitesini belirleyebilir. Ayrıca bağlamanın özgüllüğünü de ölçecektir. Bu basit yöntemin temel avantajı, konjuge edilmemiş ebeveyn antikorundan girişim olmaksızın sadece radyoaktif etiketli antikorun bağlanma afinitesinin spesifik karakterizasyonudur.

Bu teknik, radyoaktif etiketli bir antikorun hedefine bağlanma yeteneğini nicel olarak doğrular. Bu, nükleer görüntülemedeki uygulamalar ve çeşitli hastalıklarda nükleer terapideki uygulamalar için önemlidir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan lisansüstü bir ortak olan Erika Belitzky olacak.

Başlamak için, 50 mililitrelik konik bir tüpe 191 miligram sodyum bikarbonat ve 23.9 miligram sodyum karbonat ekleyerek bir immobilizasyon tamponu hazırlayın. Daha sonra, 40 mililitre 18 megaohm su ekleyin ve girdap yaparak çözün. Şimdi, toplam hacmi 50 mililitreye getirmeden önce pH'ı 9.0'a ayarlayın.

Daha sonra, 250 mililitrelik bir şişeye 200 mililitre PBS ve 100 mikrolitre Ara 20 ekleyerek 200 mililitre yıkama tamponu hazırlayın. Ayrıca 50 miligram BSA ve 25 mikrolitre Ara 20 ila 50 mililitre PBS ekleyerek 50 mililitre bağlayıcı tampon hazırlayın ve vorteks yaparak karıştırın. Blokaj tamponunu hazırlamak için 50 mililitre PBS'ye 1,5 gram BSA ekleyin ve vorteksi nazikçe karıştırın.

Antijeni immobilizasyon tamponunda seyreltin. Ardından, kırılabilir, 96 kuyucuklu, düz tabanlı bir plaka alın ve sekize üç dizide 24 kuyucuğun her bir kuyucuğunun dibine 100 mikrolitre antijen ekleyin. Plakayı sızdırmazlık bandı ile örtün ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, plakayı yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Sıvıyı atmak için plakayı lavaboda hızlı bir şekilde ters çevirin ve fazla sıvıyı çıkarmak için plakayı bir kağıt havlu yığınına dokunun. Daha sonra, antijeni içeren kuyucuklara, çok kanallı bir pipet kullanarak kuyu başına 300 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin.

Hem 24 antijen kaplı kuyuya hem de 96 delikli plakanın 24 boş kuyucuğuna kuyu başına 300 mikrolitre blokaj tamponu ekleyin. Daha sonra, plakayı ortam sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin ve plakanın her bir kuyusunu 300 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Bağlayıcı tampondaki radyoaktif etiketli antikorun plaka üzerinde A'dan H'ye kadar olan sekiz sıra boyunca üç kat seri seyreltilmesini yapın.

İlk olarak, ilk konsantrasyonun 1.2 mililitrelik bir çözeltisini yapmak için gereken stok radyoaktif etiketli antikorun hacmini hesaplayın. Daha sonra, B ila H etiketli mikrosantrifüj tüplerine 800 mikrolitre bağlayıcı tampon ekleyin ve gerekli miktarda bağlayıcı tamponu A etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Ardından, tüpün altındaki tüm sıvıyı toplamak için mini bir mikrosantrifüj kullanarak aşağı doğru döndürün.

Daha sonra, iki A'dan B tüpüne 400 mikrolitre sıvı ekleyin.Girdaptan sonra, bir mini mikrosantrifüj kullanarak aşağı doğru döndürün. Benzer şekilde, B tüpünden C tüpüne, C'den D'ye, H tüpüne kadar çözelti ekleyin.Antijenle hareketsiz hale getirilmiş üç kuyucuğa ve sadece BSA ile tıkanmış üç kuyucuğa kuyu başına her seyreltmenin 100 mikrolitresini ekleyin. Şimdi, A standardından H standardına etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine her seyreltmenin 100 mikrolitresini ekleyin ve bu tüpleri gama sayacında test edilmek üzere radyoaktif etiketli antikor standartları olarak saklayın.

Plakayı 37 santigrat derecede bir saat boyunca hafifçe sallanarak inkübe edin. Makalede açıklandığı gibi her bir kuyu için mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin. Radyoaktif etiketli antikoru vakum aspiratörü kullanarak 96 delikli plakanın kuyucuklarından aspire edin.

Şimdi, çok kanallı bir pipet kullanarak, her bir kuyucuğa 300 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. Yıkama tamponunu aspire edin ve yıkamayı dört kez daha tekrarlayın. Kuyucukları uygun mikrosantrifüj tüplerine ayırın.

Tüplerdeki radyoaktiviteyi H1, H2, H3, H3 ila A1, A2, A3 olarak işaretlenmiş antijenle ve daha sonra BSA ile sadece H4, H5, H6, A4, A5, A6 olarak işaretlenmiş bir gama sayacı kullanarak sayın. Radyoaktif işaretli amivantamab, EGFR ve cMET proteinleri için spesifik bağlanma gösterdi. Benzer şekilde, bağlanma afiniteleri, EGFR ve cMET proteinlerine bağlı tek kollu radyoetiketli fablar tarafından da korunmuştur.

Doygunluk bağlama grafikleri, radyoaktif işaretli antikorların konsantrasyonları çok düşük olduğunda, doğrusal eğri tarafından belirtildiği gibi doygunluğa ulaşılamadığını göstermiştir. Çok yüksek olan radyoaktif işaretli antikorların konsantrasyonları, yatay plato tarafından gösterildiği gibi, belirgin logaritmik büyüme olmadan doygunluğa yol açtı. Ayrıca, radyoaktif işaretli antikorların yüksek konsantrasyonları nedeniyle yüksek spesifik olmayan bağlanma görüldü.

Bu prosedür, her bir spesifik radyoaktif antikor için konsantrasyon aralığını optimize etmek için birden fazla girişimde bulunabilir. Gelecekteki denemeleri tasarlamaya yardımcı olması için olumsuz sonuçlardan elde edilen verileri kullanın. Bağlanma afinitesi bilindikten sonra, radyoaktif etiketli bir antikorun karakterizasyonunun bir parçası olarak diğer in vitro testler için bir ölçüt olarak kullanılabilir.