Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Kütle Spektrometrisi Görüntüleme Kullanarak Drosophila Beyinde Hızlı Lipid Analizi için Örnek Hazırlama

Maldi MS spektrometri görüntüleme, aşırı numune modifikasyonu olmadan lipit bolluğunu ve dağılımını tanımlamak ve görselleştirmek için kurulmuş ve kullanışlı bir araçtır. Maldi görüntülemenin temel avantajı, lipitleri etiketlemeden yerinde tespit etme ve aynı anda büyük örnek popülasyonunu analiz etme yeteneğidir. Pratik mükemmelleştirir.

Gerçek deneysel örnekleri işlemeden önce iyi pratik yaptığınızdan emin olun. Numune hazırlama süresini en aza indirin ve prosedür boyunca kontaminasyonu önleyin. Başlamak için, kabarcık oluşumunu önlerken kriyo kalıbının derinliğinin yarısına kadar plastik bir kriyomolda optimum kesme sıcaklığını veya OCT'yi ekleyin.

Kalıbı birkaç dakika düz bir yüzeyde bırakın ve ardından kuru buz üzerine aktarın. Cryomold'u kuru buz üzerinde düz tutun ve OCT'nin düz ve eşit bir yüzey oluşturmasına izin verin. OCT kalıpta tamamen katılaşana kadar bekleyin.

Dondurulmuş OCT aşamalarını hemen kullanın veya eksi 80 santigrat derecede saklayın. Yetişkin sinekleri anestezi altına aldıktan sonra karbondioksit kullanarak, bir parça laboratuvar mendili içeren bir Petri kabı hazırlayın. Statik elektriği azaltmak için mendilin bir kısmını nemlendirmek için su kullanın.

Mendili yarı ıslak ve yarı kuru tutun. Sinek kafasını diseksiyon kapsamı altında kestikten sonra, dört ila beş kafa toplayın ve bunları laboratuvar mendilinin kuru alanına koyun. OCT aşamasını kuru buzdan mikroskop ikisine alın.

Kafaları hemen OCT aşamasına aktarın ve OCT erimesini önlemek için yaklaşık 30 ila 60 saniye süren hızlı bir şekilde düzenleyin. OCT'den yeterli destek sağlamak için her sinek beyninin etrafında yaklaşık bir milimetre boş alan ve bölümü işlemek için yeterli alan sağlamak için bloğun kenarından dört ila beş milimetre boş alan bırakın. OCT aşamasını tekrar kuru buzun üzerine koyun ve OCT aşamasının donmuş ve katı kalmasını sağlamak için yaklaşık üç dakika bekletin.

Tüm sinek kafaları hizalandıktan sonra, OCT aşamasının beş ila 10 dakika daha kuru buz üzerinde oturmasına izin verin. OCT aşamasını kuru buzdan düz bir yüzeye aktarın ve ardından tüm numuneleri kapsayacak ve yaklaşık üç saniye süren tüm kriyokalbı doldurmak için hızlı bir şekilde büyük miktarda OCT bileşiği ekleyin. Cryomold'u derhal kuru buza geri aktarın ve gömülü dokuları içeren tüm OCT bloğunu dondurun.

OCT aşamasının kuru buz üzerinde beş ila 10 dakika daha oturmasına izin verin. Numuneleri kriyomoldun kenar boşluğunda etiketleyin ve dondurulmuş numuneleri kesitlemeye hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Direnç olarak ayarlanmış bir voltmetre kullanarak ITO slaytlarının iletkenliğini test ederek ITO kodlu tarafı onaylayın.

Tarafı, dokunun yapışacağı taraf olarak bir direnç ölçümü ile işaretleyin. Slaydın kirlenmesini önlemek için her zaman slaydın altına bir laboratuvar mendili koyun. Daha sonra, dokuların kriyostat odasında 30 ila 45 dakika boyunca dengelenmesine izin verin.

Kriyostatı, tercihen% 70 etanol ile temizleyin. Rulo plakasını sahnede silin ve kullanılmış bıçakları çıkarın. Etanolün buharlaştığından ve bölümleme başlamadan önce tüm yüzeylerin kuru olduğundan emin olmak için ek temiz mendiller kullanın.

Daha sonra, kriyostat odası kum numune başının sıcaklığını dokunun tipine göre ayarlayın. OCT bloğunun tabanını örtmek için yeterli OCT kullanmaya dikkat edin ve bloğu mümkün olduğunca düz bir şekilde monte edin.

Sahneye temiz bir bıçak yerleştirin ve kilitleyin. İstenilen kesme açısını elde etmek için numunenin kafasını gerektiği gibi sahneye doğru konumlandırın. Ardından, ilgilenilen bölge bulunana kadar kalın bölümlerde kesime başlayın.

Sahneyi temiz tutmak için ekstra parçaları önceden soğutulmuş bir sanatçı fırçasıyla sürekli fırçalayın. Oda sıcaklığını gerektiği gibi hafifçe ayarlayın ve istenen bölgeye ulaşıldığında bölümlerin kalınlığını 10 ila 12 mikrometreye değiştirin. İstediğiniz bölümü dikkatlice toplayın.

Oda sıcaklığında bir ITO sürgüsü alın ve bölümün üzerine yerleştirin. Bölüme yavaşça yaklaşın ve kriyostat aşamasında iz bırakmadan slayda yapıştırın. Slaytı bir rafta bir kenara koyun veya kriyostatın dışında, birden fazla bölümün koleksiyonları arasında laboratuvar mendili silin.

Aynı kohortun farklı örnekleri arasında karşılaştırma yapmak istenirse, varyasyonu en aza indirmek için aynı anda analiz edilebilmeleri için birden fazla numuneden bölümleri tek bir slayta yerleştirin. Gerekirse, Maldi hedef tutucu tek bir çalıştırmada iki slaytı barındırabileceğinden, iki slayta ayırın. Slaytları bir vakum kutusunda, alt tabaka olarak kurutucu olan bir kurutucuya taşıyın.

Slaytları 30 ila 60 dakika boyunca vakum altında sürün, ardından matris biriktirmeye devam edin. Metanol suda matris olarak iki beş dihidroksi benzoik asit veya DHB kullanın. Slaytları bir slayt taşıyıcıya yerleştirin ve açıklığı balmumu filmi ile güvenli bir şekilde kapatın.

Fermuarlı torba ile kapatın. Kurutucu içeren başka bir fermuarlı torbaya yerleştirin. Dışını etiketleyin ve numuneyi yeterli kuru gözlerle Maldi çekirdek tesislerine gönderin.

Matris birikimi için, matris olarak mililitre DHB ve metanol suyu başına 40 miligram kullanın ve otomatik bir HTX M5 matris püskürtücü kullanarak püskürtün. 10 PSI azot gazı basıncı kullanın. Bir kütle spektrumu elde etmek için bir Maldi uçuş zamanı, MS cihazı ve pozitif iyon modu kullanın.

ITO slaytları üzerinde aceto Nitro'da 0,5 mikrolitre kırmızı fosfor emülsiyonu tespit ederek cihazı kalibre edin. İkinci dereceden bir kalibrasyon eğrisi uygulayarak cihazı 100 ila 1000 MZ kütle aralığında kalibre etmek için bu spektrumları kullanın. 40 mikrometre raster genişliği için modüle edilmiş ışın profili olduğu için lazer nokta çaplarını orta olarak ayarlayın ve dizi konumu başına 1000 hertz'lik bir lazer tekrarlama hızında 500 atış toplayarak görüntüleme verilerini toplayın.

Ardından spektral verileri kaydedin. Artı eksi 0,10 Dalton bant genişliğinde iyon görüntüleri oluşturmak için kök ortalama kare normalleştirmesini kullanarak görüntüleme veri analizini gerçekleştirin. OCT'nin iyon bastırma girişimindeki örtüşen zirveleri değerlendirmek için yazılımı kullanarak hem OCT hem de beyin dokusunun spektrumlarını aynı deneyden hizalayın.

Son olarak, doku örneklerini içeren MALDI slaytlarını hematoksilin ve eozin veya H ve E boyama ile işleyin. Maldi MS analizinden elde edilen görüntüler, LPR1 nakavt mutant beynindeki lipit içeriğinde genel bir azalma olduğunu ortaya koydu. Temsili H ve E lekeli yetişkin sinek beyni bölümleri burada gösterilmiştir.

Lipid türleri, bunların MZ değerleri ve ısı haritasının ölçekleri de bu resimde belirtilmiştir. LPR1 nakavt mutantındaki ortalama azalma katı, en az dört biyolojik kopyadan gelen kontrollere kıyasla, okların yanındaki sayılar olarak gösterilir. Beyin dokusu bölgesinde seçilen boş OCT bölgesinin hem kontrol hem de mutant sineklerden kütle spektrumu MZ1 ila 1000 ve MZ520 ila 900 aralığında gösterilmiştir.

OCT'nin girişimi hem iyon bastırma fenomeni hem de örtüşen sinyal sorunları ile ilişkilidir. Lipidomik verilerin doğruluğunu korumak için, uygun numune hazırlama, diseksiyon ve kriyo kesitleme çok önemlidir. Maldi deneyini gerçekleştirdikten sonra, lipitlerin kimlikleri, sıvı kromatografisi, kütle spektrometrisi bazlı lipodomikler olarak da bilinen LCMS ile doğrulanabilir.

Bu teknik, beyindeki insan hastalığına bağlı metabolik değişiklikleri anlamanın yolunu açan güçlü ila yumuşak model sistemini kullanarak beyin lipitleri homeostazı hakkında moleküler bilgiler kazanır.