Name: Diferansiyel Dinamik Mikroskopi Kullanarak Sitoiskelet Dinamiğinin Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Öğrenin, Diferansiyel Dinamik Mikroskopi ile sitoiskelet ağlarının dinamiklerini nasıl ölçebilirsiniz. PyDDM yazılım paketi kullanılarak vimentin ve aktin-mikrotübül kompozitlerinin alt difüzyon ve balistik hareketleri analiz edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırmanın bazı bölümleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri R15 Ödülü (Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü ödül no. R15GM123420, R.M.R.-A.'ya verildi. ve R.J.M.), Research Corporation for Science Advancement'tan bir Cottrell Scholar Ödülü (ödül no. 27459, R.J.M.'ye verilir) ve William M. Keck Vakfı Araştırma Bursu (R.M.R-A.'ya verilir). GHK, Hollanda Araştırma Konseyi'nin (NWO; NWO Yetenek Programı'nın VI.C.182.004 proje numarası) mali desteğini minnetle kabul eder.

NOT: Aşağıdaki protokoldeki her adımla birlikte gidecek kodu içeren bir Jupyter Notebook dosyası, aşağıdaki GitHub deposunda bulunabilir https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples. Bu dosyanın PDF'si Ek Dosya 1'de bulunur. Ek olarak, her işlevin ve sınıfın kodunun ve belgelerinin izlenecek yolu web sitesinde, https://rmcgorty.github.io/PyDDM/ bulunabilir.
1. Yazılım kurulumu
<ol><li>Örnek DDM çözümleme dosyalarıyla birlikte gitmek için, kodu çalıştırmak üzere Jupyter Not Defteri'ni yükleyin. NumPy ve Matplotlib de dahil olmak üzere diğer gerekli ortak Python paketlerini yükleyin. Bu paketlerin hepsi Anaconda dağıtımı ile birlikte gelir (https://www.anaconda.com/products/individual bakınız).</li>
	<li>Python paketi xarray63'ü yükleyin. Bu paket, meta verileri ve analiz parametrelerini düzenlemek ve depolamak için gereklidir. Anaconda dağıtımını kullanıyorsanız, komutu kullanarak xarray'i (önerilen bağımlılıklarıyla birlikte) yükleyin: conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 darboğazı
</li>
	<li>Şu komutu kullanarak PyYAML paketini yükleyin: conda install -c anaconda yaml Bu paket, analiz edilecek görüntüler ve kullanıcı tarafından analiz ve montaj için ayarlanan parametreler hakkındaki meta verileri okumak için gereklidir.</li>
	<li>GitHub deposundan indirerek veya git komutunu kullanarak PyDDM paketini yükleyin: git klon https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git
</li>
</ol>2. Görüntüleme oturumlarının planlanması
<ol><li>Mevcut en uygun görüntüleme yöntemini ve optik ayarları seçin. Belirtildiği gibi, DDM bir dizi mikroskopi yöntemiyle kullanılabilir.</li>
	<li>Kullanılacak uygun objektif lens ve görüntü boyutunun planlanmasına yardımcı olmak için, piksel boyutuna ve toplam görüntü boyutuna göre incelenecek dalga sayılarının (q) aralığını belirleyin. Bu hesaplamalara dayanarak, büyütme ve görüş alanı seçiminin deney için en uygun olduğunu onaylayın. Burada analiz edilen görüntüler için, aktif aktin-mikrotübül kompozit ağı için 60x 1.4 NA objektif ve 0.83 μm piksel boyutuna sahip 256 x 256 piksel görüntü boyutu kullanılmıştır. Bir vimentin ağına gömülü boncukların görüntüleri için, 100x 1,4 NA objektif ve 0,13 μm piksel boyutuna sahip 512 x 512 piksel görüntü boyutu kullanılmıştır. NOT: Minimum q, 2π/NΔ x ileayarlanır, burada görüntü boyutu (kare olduğu varsayılır) piksel boyutu Δ x olan N × N pikseldir. Maksimum q, minimum π/Δx ve 2π NA/λ'dur, burada NA, görüntüleme hedefinin sayısal açıklığıdır ve λ, ışığın dalga boyudur (parlak alan görüntüleme için, NA'yı (NAobjektif + NAkondansatör)/2 ile değiştirebilirsiniz).</li>
	<li>Ardından, araştırılacak zaman ölçekleri aralığını göz önünde bulundurun. Tipik olarak, DDM analizi en az 1000 karelik diziler üzerinde yapılır.<ol>
<li>Uygun kare hızını belirlemek için, örneklemdeki özelliklerin minimum çözümlenebilir uzunluk ölçeği (maksimum q'ya karşılık gelen) sırasına göre bir mesafeyi hareket ettirmesi için gereken beklenen süreyi göz önünde bulundurun.</li>
		<li>İncelenen zaman ölçekleri aralığının üst sınırını göz önünde bulundurarak, tipik olarak, belirli bir gecikme süresi Δt'nin yüzlerce görüntü farkının güç spektrumunun, gürültüyü azaltmak için yeterli istatistik sağlamak için birlikte ortalamasının alındığını kabul edin. Bu nedenle, maksimum zaman ölçeği incelendiğinden daha uzun görüntü dizileri elde edin. NOT: Beklenen bir difüzyon katsayısı, D veya hız, v, biliniyorsa, beklenen karakteristik bozunma sürelerini, görüş alanına ve piksel boyutuna göre belirlenen q aralığıyla birlikte τ = 1/Dq2 veya τ = 1/vq kullanarak tahmin edebilirsiniz. Erişilebilir q-aralığı üzerinden beklenen τ değerlerinin aralığı, kare hızı seçimini ve elde edilecek kare sayısını yönlendirmeye yardımcı olabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Numune hazırlama ve görüntü alma
NOT: Temsili sonuçlar bölümünde sunulan veriler için kullanılan örnek hazırlama ve görüntüleme ayarlarının ayrıntıları için, yazarların önceki yayınları11,51,64 ve Ek Dosya 2'ye bakınız.
<ol><li>Prob için zaman ve uzunluk ölçeklerinin dikkate alınmasına dayanarak, ideal olarak 1000'den fazla karenin görüntü dizilerini elde edin. NOT: Kod, görüntü içindeki kare görüntüleri veya ilgi çekici kare bölgeleri analiz eder, bu nedenle çerçeve boyutunu buna göre ayarlayın.</li>
	<li>Görüntü dizilerini üç boyutlu gri tonlamalı TIFF yığını olarak kaydedin. Alternatif olarak, Nikon Instruments sistemleri tarafından kullanılan format, ND2 formatı, kurulu paket tarafından okunabilir. Görüntüler farklı bir biçimde kaydedilmişse, görüntüleri bir TIFF yığınına dönüştürmek için ImageJ veya başka bir görüntüleme işleme programı kullanın. Not: ND2 dosyaları kullanıyorsanız, https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader nd2reader paketi yüklü olmalıdır.</li>
</ol>4. Parametre kurulumu
<ol><li>Örnekler klasörünün altındaki PyDDM kod deposunda sağlanan example_parameter_file.yml parametre dosyasının bir kopyasını oluşturun. Bu YAML dosyasını NotePad++ gibi bir metin düzenleyicisiyle veya JupyterLab'daki metin düzenleyicisiyle açın. Temsili sonuçlar bölümünde sunulan verilerin analizinde kullanılan örnek bir YAML parametreleri dosyası için Ek Dosya 2'ye bakın.</li>
	<li>Kopyalanan YAML dosyasında, analiz edilecek görüntü dizisine karşılık gelen veri dizinini ve dosya adını sağlayın. Meta veriler bölümünün altında, piksel boyutunu ve kare hızını belirtin.</li>
	<li>Analysis_parameters bölümünün altında, DDM matrisinin nasıl hesaplanması gerektiğine ilişkin ayrıntıları sağlayın. Buradaki bazı parametreler isteğe bağlıdır.<ol>
<li>En azından, number_lag_times parametreler ve last_lag_time için değerler sağlayın. Bunlar, sırasıyla DDM matrisinin hesaplanacağı farklı gecikme sürelerinin sayısına ve kullanılacak en uzun gecikme süresine (çerçeveler halinde) karşılık gelir. Burada kullanılan vimentin ağlarındaki izleyici boncukların verileri için, number_lag_times ve last_lag_time parametreleri sırasıyla 60 ve 1000 idi. Kod, gecikme süreleri için DDM matrisini 1 kareden (veya isteğe bağlı parametre first_lag_time belirtilmişse başka bir minimum gecikme süresinden) logaritmik aralıklı last_lag_time kadar hesaplar. NOT: M çerçeveleri elde edilirse, DDM matrisi M-1 kadar büyük bir gecikme süresi için hesaplanabilir. Bununla birlikte, bu kadar büyük bir gecikme süresinde zayıf istatistiklerle, verilerin gürültülü olması muhtemeldir. DDM matrisinin hesaplanacağı en uzun gecikme süresi, verilerin ayrıntılarına bağlı olacaktır, ancak toplam görüntü serisi süresinin yaklaşık üçte birini denemenizi öneririz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DDM matrisinin veya ara saçılma fonksiyonunun (ISF) Fitting_parameters bölümüne nasıl sığması gerektiğine ilişkin ayrıntılar sağlayın. Model parametresinin altına modelin adını verin. Seçilen modeldeki uydurma parametrelerinin her biri için ilk tahmini, alt sınırı ve üst sınırı sağlayın. NOT: Olası montaj modellerinin bir listesini görüntülemek için, print_fitting_models işlevini çalıştırın. Modeller ayrıca PyDDM web sitesindeki çevrimiçi belgelerde de bulunabilir.</li>
</ol>5. DDM matrisinin hesaplanması
<ol><li>DDM_Analysis sınıfının bir örneğini başlatın. Bunu yapmak için, YAML dosyasının dosya adını tam dosya yolu dahil olmak üzere DDM_Analysis geçirerek yukarıda açıklanan meta verileri ve analiz parametrelerini sağlayın. Alternatif olarak, meta verileri ve parametreleri Python sözlük veri yapısı olarak geçirin.</li>
	<li>DDM matrisini hesaplamak için calculate_DDM_matrix işlevini çalıştırın. Bu hesaplama, çerçeve boyutuna ve gecikme sürelerinin sayısına bağlı olarak birkaç dakika veya daha uzun sürebilir. Tipik çalışma süreleri için Şekil 2'ye bakın.</li>
	<li>Veri Kümesi olarak bilinen xarray paketinden bir veri yapısında olacak döndürülen verileri inceleyin. Bu veri yapısı, ddm_dataset özniteliği altında depolanır. NOT: Yalnızca DDM matrisi değil, ilişkili değişkenler ve meta veriler de bu veri yapısında depolanır. Ayrıca Ağ Ortak Veri Formu (netCDF) biçiminde diske kaydedilir.</li>
	<li>Oluşturulacak ve görüntülenecek grafikleri ve şekilleri inceleyin. Bu rakamlar ayrıca veri dizinine PDF dosyası olarak kaydedilir.<ol>
<li>Oluşturulan grafiklerden birinin, <img alt="Equation031" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq031.png" style="margin-bottom: 0px;"> q'nun bir fonksiyonu olarak Fourier dönüştürülmüş görüntülerin topluluk ortalamalı kare modülünü gösterdiğini görün. Varsayılan olarak, kod arka plan parametresi B'yi tahmin etmek için bunu kullanır. Büyük q sınırında, B'nin arka plan olduğu B/2'ye <img alt="Equation031" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq031.png" style="margin-bottom: 0px;"> yaklaşacağını varsayarak arka planı tahmin edin.</li>
		<li><img alt="Equation031" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq031.png" style="margin-bottom: 0px;"> Büyük q'da bir platoya ulaşmıyorsa, B'yi tahmin etmek için başka bir yöntem kullanın. Bunu gerçekleştirmek için, parametre background_method YAML dosyasında veya isteğe bağlı bir anahtar sözcük bağımsız değişkeni olarak işlev calculate_DDM_matrix ayarlayın. B'yi tahmin etme yöntemleri hakkında daha fazla ayrıntı temsili sonuçlar bölümünde sunulmaktadır.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63931/63931fig2v2.jpg"> Şekil 2: DDM matrisini hesaplamak için hesaplama süresi. (A) ve (B)'de DDM matrisinin <img alt="Equation009" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq009.png" style="margin-bottom: 0px;">hesaplanma zamanı gösterilir. Her durumda kullanılan veriler, görüntü boyutu 512 x 512 piksel olan 5000 karelik bir filmdir. DDM matrisi, logaritmik olarak 1 kare (0.01 s) ile 1000 kare (10 s) arasında aralıklı 30 gecikme süresi için hesaplandı. Kod, 32 GB RAM'e sahip bir Intel i7-10700 2.90 GHz masaüstü bilgisayarda çalıştırıldı. (A)'da, her gecikme süresi için DDM matrisinin hesaplanmasında kaç görüntü farklılığının kullanıldığının değişen etkisi gösterilmiştir. Bunun için, görüntüler 256 x 256 görüntü boyutuyla sonuçlanacak şekilde bağlanır. Her gecikme süresi Δ tiçin, bu Δt ile ayrılmış görüntüler çıkarılır ve elde edilen matris Fourier dönüştürülür. Belirli bir Δ t için, bu Δ t ile ayrılmış tüm görüntü çiftleri kullanılabilir (mavi renkle gösterilir), yalnızca örtüşmeyen görüntü çiftleri kullanılabilir (örneğin, çerçeve 1 ve 10, 10 ve 19, vb.; kahverengi renkle gösterilmiştir) veya her Δt için 300 görüntü çifti veya daha azıkullanılabilir. (B) bendinde, görüntü boyutunun değiştirilmesinin hesaplama süresi üzerindeki etkisi gösterilir. Görüntüler 2 x 2, 4 x 4 veya 8 x 8 piksel gruplandırılarak birleştirildi ve sırasıyla 256 x 256, 128 x 128 veya 64 x 64 görüntü boyutlarıyla sonuçlandı. Her biri için, her Δ t için DDM matrisinin hesaplanmasında yaklaşık 300 görüntüçifti kullanılır. (C) DDM matrisinden, ara saçılma fonksiyonu (ISF) çıkarılabilir. Bu, (A)'daki üç durum için gösterilmiştir. Mavi veri noktaları (ofset olmadan), her Δ t için maksimum görüntü çifti sayısı kullanıldığındaISF'ye karşılık gelir; kahverengi veri noktaları (0,1 ofseti ile), her Δ t için örtüşmeyen görüntü çiftleri kullanıldığındaISF'ye karşılık gelir; pembe veri noktaları (0,2 ofseti ile), her Δ t için en fazla 300 görüntü çifti kullanıldığındaISF'ye karşılık gelir. Örtüşmeyen görüntü çiftleri kullanılarak bulunan ISF, uzun Δt'de gürültülülük gösterir. Bu durumda, uzun Δ t'de birkaç görüntü çifti kullanılır (örneğin; 1000 karelik Δt için yalnızca 4 görüntü çifti kullanılır). (D) ISF'yi üstel bir fonksiyona uydurarak, her dalga sayısı için karakteristik bozunma süresi, τ, q, belirlenir. Pembe renkte, sonuçlar orijinal görüntüleri 2 x 2 ile ciltledikten sonra gösterilir ve görüntü boyutu 256 x 256 olur. Gri renkte, sonuçlar 8 x 8 ile ciltlendikten sonra gösterilir ve görüntü boyutu 64 x 64 olur. Verileri ciltleyerek, daha yüksek dalga sayılarındaki dinamikler hakkındaki bilgiler kaybolur, ancak 64 x 64 görüntüler için DDM matrisini hesaplamak, 256 x 256 görüntülerden yaklaşık 16 kat daha hızlıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63931/63931fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
6. DDM matrisini veya ISF'yi takma
<ol><li>DDM_Fit sınıfının bir örneğini başlatın. Bunu yapmak için, görüntü meta verilerini ve sığdırma parametrelerini içeren YAML dosyasının dosya adını DDM_Fit geçirin.</li>
	<li>Verileri sığdırmak için DDM matrisi veya ISF için hangi modelin kullanılacağına karar verin. İşlev print_fitting_models çalıştırarak kullanılabilir modelleri listeleyin. YAML parametre dosyasında veya işlev reload_fit_model_by_name kullanarak kullanılacak modeli belirtin.</li>
	<li>Sağlanan YAML parametre dosyasında seçilen modeldeki her parametre için ilk tahminleri ve sınırları ayarlayın. Herhangi bir parametrenin başlangıç tahminini değiştirmek için, set_parameter_initial_guess işlevini kullanın. İşlev set_parameter_bounds parametreler için sınırlar ayarlayın. Örneğin, Ek Dosya 2'de görüldüğü gibi, vimentin ağındaki izleyici boncukların verileri için, bozunma süresi için ilk tahmin 1 s ve bu parametredeki sınırlar 0.01 s ve 2000 s idi.</li>
	<li>İşlev uyumu ile uyumu gerçekleştirin. Sonuçlara kolayca erişmek için bu işlevin çıktısına bir değişken atayın. NOT: Bu işlev birçok isteğe bağlı bağımsız değişken alabilir. Bu tür bağımsız değişkenlerin listesi ve bunları varsayılan olmayan değerlere ayarlamanın ne zaman düşünülmesi gerektiği konusunda kod belgelerine ve sağlanan örneklere bakın.</li>
</ol>7. Uyum sonuçlarının yorumlanması
<ol><li>Uyum parametrelerinin fonksiyon fit_report ile uyumlarını ve q-bağımlılığını incelemek için grafikler oluşturun. NOT: Bu işlev, PDF olarak da kaydedilecek bir dizi çizim oluşturacaktır. Bu işlevin isteğe bağlı bağımsız değişkenleri, üretilen grafikleri değiştirmek için kullanılabilir.</li>
	<li>Oluşturulan grafikler arasında, DDM matrisini veya ISF'yi (seçilen uygun modele bağlı olarak) dört q-değerinde (fit_report isteğe bağlı bir argüman olarak belirtilen) gösteren 2 x 2 alt grafiklere sahip bir şekil ile birlikte hesaplanan DDM matrisi veya ISF, model ve en uygun parametreler kullanılarak hesaplanacaktır. DDM matrisini veya ISF'yi en uygun olanla birlikte etkileşimli bir şekilde çizmek için, Jupyter Notebook ortamı kullanıldığında sağlanan örneklerde gösterildiği gibi sınıf Browse_DDM_Fits kullanın.</li>
	<li>Karakteristik bozunma süresi τ ve dalga sayısı q'nun grafiğinden, dinamiklerin difüzif, subdifüzif, balistik veya başka bir hareket türünü takip edip etmediğini belirleyin. Bu, τ ve q arasındaki güç yasası ilişkisini arayarak yapılabilir. NOT: fit_report fonksiyonu tarafından oluşturulan τ ve q günlük grafiğinde, belirli bir q değerleri aralığındaki güç yasasına karşılık gelen üç satır gösterilecektir. Düz siyah çizgi, τ ve q'nun bir güç yasasına, τ = 1 / Kq β takılmasına karşılık gelir, burada K ve β serbest parametrelerdir. Turuncu renkli kesikli çizgi, basit difüzyona uymaya karşılık gelir, τ = 1 / Dq2, burada D bir difüzyon katsayısıdır. Mavi renkteki nokta kesikli çizgi, τ = 1 / vq'ya sığmaya karşılık gelir, burada v bir hızdır.</li>
</ol>8. Sonuçların kaydedilmesi
<ol><li>Sığdırmanın sonuçları bir xarray veri kümesine kaydedilir. Bu veri yapısını diske kaydetmek için xarray işlevini to_netcdf veya Python'un yerleşik turşu modülünü kullanın. Bu netCDF dosyalarını yüklemek için open_dataset xarray işlevini kullanın.</li>
	<li>Sığdırma sonuçlarını, verilerle birlikte bir çalışma sayfası dosyasına kaydetmek için save_fit_results_to_excel işlevini kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks. Nature Reviews Physics. 1 (4), 249-263 (2019).</li>
	<li>Amblard, F., Maggs, A. C., Yurke, B., Pargellis, A. N., Leibler, S. Subdiffusion and anomalous local viscoelasticity in actin networks. Physical Review Letters. 77 (21), 4470-4473 (1996).</li>
	<li>Mizuno, D., Tardin, C., Schmidt, C. F., MacKintosh, F. C. Nonequilibrium mechanics of active cytoskeletal networks. Science. 315 (5810), 370-373 (2007).</li>
	<li>Bendix, P. M. et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li>
	<li>Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Physical Review Letters. 102 (18), 188303 (2009).</li>
	<li>Stuhrmann, B., Soares e Silva, M., Depken, M., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Nonequilibrium fluctuations of a remodeling in vitro cytoskeleton. Physical Review E. 86 (2), 020901 (2012).</li>
	<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
	<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li>
	<li>Anderson, S. J. et al. Filament rigidity vies with mesh size in determining anomalous diffusion in cytoskeleton. Biomacromolecules. 20 (12),4380-4388 (2019).</li>
	<li>Anderson, S. J., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).</li>
	<li>Lee, G. et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), eabe4334 (2021).</li>
	<li>Wong, I. Y. et al. Anomalous diffusion probes microstructure dynamics of entangled F-actin networks. Physical Review Letters. 92 (17), 178101 (2004).</li>
	<li>K&#246;ster, S., Lin, Y.-C., Herrmann, H., Weitz, D. A. Nanomechanics of vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 6 (9), 1910-1914 (2010).</li>
	<li>Chandrakar, P. et al. Engineering stability, longevity, and miscibility of microtubule-based active fluids. Soft Matter. 18 (9), 1852-1835 (2022).</li>
	<li>Alvarado, J., Cipelletti, L., H. Koenderink, G. Uncovering the dynamic precursors to motor-driven contraction of active gels. Soft Matter. 15 (42), 8552-8565 (2019).</li>
	<li>Linsmeier, I. et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).</li>
	<li>Stam, S. et al. Filament rigidity and connectivity tune the deformation modes of active biopolymer networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10037-E10045 (2017).</li>
	<li>Malik-Garbi, M. et al. Scaling behaviour in steady-state contracting actomyosin networks. Nature Physics. 15 (5), 509-516 (2019).</li>
	<li>Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (5), e2115895119 (2022).</li>
	<li>Roostalu, J., Rickman, J., Thomas, C., N&#233;d&#233;lec, F., Surrey, T. Determinants of polar versus nematic organization in networks of dynamic microtubules and mitotic motors. Cell. 175 (3), 796-808.e714 (2018).</li>
	<li>Cerbino, R., Trappe, V. Differential dynamic microscopy: probing wave vector dependent dynamics with a microscope. Physical Review Letters. 100 (18), 188102 (2008).</li>
	<li>Giavazzi, F., Brogioli, D., Trappe, V., Bellini, T., Cerbino, R. Scattering information obtained by optical microscopy: differential dynamic microscopy and beyond. Physical Review E. 80 (3), 031403 (2009).</li>
	<li>Giavazzi, F., Cerbino, R. Digital Fourier microscopy for soft matter dynamics. Journal of Optics. 16 (8), 083001 (2014).</li>
	<li>He, K., Spannuth, M., Conrad, J. C., Krishnamoorti, R. Diffusive dynamics of nanoparticles in aqueous dispersions. Soft Matter. 8 (47), 11933-11938 (2012).</li>
	<li>Lu, P. J. et al. Characterizing concentrated, multiply scattering, and actively driven fluorescent systems with confocal differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 108 (21), 218103 (2012).</li>
	<li>Giavazzi, F. et al. Viscoelasticity of nematic liquid crystals at a glance. Soft Matter. 10 (22), 3938-3949 (2014).</li>
	<li>Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Dark-field differential dynamic microscopy. Soft Matter. 12 (8), 2440-2452 (2016).</li>
	<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. Light-sheet microscopy with digital Fourier analysis measures transport properties over large field-of-view. Optics Express. 24 (18), 20881-20894 (2016).</li>
	<li>Richards, J. A., Martinez, V. A., Arlt, J. Particle sizing for flowing colloidal suspensions using flow-differential dynamic microscopy. Soft Matter. 17 (14), 3945-3953 (2021).</li>
	<li>Ferri, F. et al. Kinetics of colloidal fractal aggregation by differential dynamic microscopy. The European Physical Journal Special Topics. 199 (1), 139-148 (2011).</li>
	<li>Lanfranco, R. et al. Adaptable DNA interactions regulate surface triggered self assembly. Nanoscale. 12 (36), 18616-18620 (2020).</li>
	<li>Cho, J. H., Cerbino, R., Bischofberger, I. Emergence of multiscale dynamics in colloidal gels. Physical Review Letters. 124 (8), 088005 (2020).</li>
	<li>Giavazzi, F., Trappe, V., Cerbino, R. Multiple dynamic regimes in a coarsening foam. Journal of Physics: Condensed Matter. 33 (2), 024002 (2020).</li>
	<li>He, K. et al. Diffusive dynamics of nanoparticles in arrays of nanoposts. ACS Nano. 7 (6), 5122-5130 (2013).</li>
	<li>Jacob, J. D. C., He, K., Retterer, S. T., Krishnamoorti, R., Conrad, J. C. Diffusive dynamics of nanoparticles in ultra-confined media. Soft Matter. 11 (38), 7515-7524 (2015).</li>
	<li>Sentjabrskaja, T. et al. Anomalous dynamics of intruders in a crowded environment of mobile obstacles. Nature Communications. 7, 11133 (2016).</li>
	<li>Hitimana, E., Roopnarine, B. K., Morozova, S. Diffusive dynamics of charged nanoparticles in convex lens-induced confinement. Soft Matter. 18 (4), 832-840 (2022).</li>
	<li>Wilson, L. G. et al. Differential dynamic microscopy of bacterial motility. Physical Review Letters. 106 (1), 018101 (2011).</li>
	<li>Martinez, V. A. et al. Differential dynamic microscopy: a high-throughput method for characterizing the motility of microorganisms. Biophysical Journal. 103 (8), 1637-1647 (2012).</li>
	<li>Germain, D., Leocmach, M., Gibaud, T. Differential dynamic microscopy to characterize Brownian motion and bacteria motility. American Journal of Physics. 84 (3), 202-210 (2016).</li>
	<li>Croze, O. A. et al. Helical and oscillatory microswimmer motility statistics from differential dynamic microscopy. New Journal of Physics. 21 (6), 063012 (2019).</li>
	<li>Safari, M. S., Vorontsova, M. A., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of weakly scattering and polydisperse protein-rich clusters. Physical Review E. 92 (4), 042712 (2015).</li>
	<li>Wang, J., McGorty, R. Measuring capillary wave dynamics using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 15 (37), 7412-7419 (2019).</li>
	<li>Cerbino, R., Giavazzi, F., Helgeson, M. E. Differential dynamic microscopy for the characterization of polymer systems. Journal of Polymer Science. 60 (7), 1079-1089 (2021).</li>
	<li>Cerbino, R., Cicuta, P. Perspective: differential dynamic microscopy extracts multi-scale activity in complex fluids and biological systems. The Journal of Chemical Physics. 147 (11), 110901 (2017).</li>
	<li>Drechsler, M., Giavazzi, F., Cerbino, R., Palacios, I. M. Active diffusion and advection in Drosophila oocytes result from the interplay of actin and microtubules. Nature Communications. 8 (1), 1-11 (2017).</li>
	<li>Burla, F., Sentjabrskaja, T., Pletikapic, G., Beugen, J. v., H. Koenderink, G. Particle diffusion in extracellular hydrogels. Soft Matter. 16 (5), 1366-1376 (2020).</li>
	<li>Regan, K., Wulstein, D., Rasmussen, H., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. M. Bridging the spatiotemporal scales of macromolecular transport in crowded biomimetic systems. Soft Matter. 15 (6), 1200-1209 (2019).</li>
	<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), eaay5912 (2019).</li>
	<li>Lee, G. et al. Active cytoskeletal composites display emergent tunable contractility and restructuring. Soft Matter. 17 (47), 10765-10776 (2021).</li>
	<li>Achiriloaie, D. H. et al. Kinesin and myosin motors compete to drive rich multi-phase dynamics in programmable cytoskeletal composites. arXiv:2112.11260 .(2021).</li>
	<li>Chen, X. et al. Coaxial differential dynamic microscopy for measurement of Brownian motion in weak optical field. Optics Express. 26 (24), 32083-32090 (2018).</li>
	<li>Reufer, M., Martinez, V. A., Schurtenberger, P., Poon, W. C. K. Differential dynamic microscopy for anisotropic colloidal dynamics. Langmuir. 28 (10), 4618-4624 (2012).</li>
	<li>Giavazzi, F., Haro-P&#233;rez, C., Cerbino, R. Simultaneous characterization of rotational and translational diffusion of optically anisotropic particles by optical microscopy. Journal of Physics: Condensed Matter. 28 (19), 195201 (2016).</li>
	<li>Cerbino, R., Piotti, D., Buscaglia, M., Giavazzi, F. Dark field differential dynamic microscopy enables accurate characterization of the roto-translational dynamics of bacteria and colloidal clusters. Journal of Physics: Condensed Matter. 30 (2), 025901 (2017).</li>
	<li>Safari, M. S., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of bidisperse colloidal suspensions. npj Microgravity. 3 (1), 21 (2017).</li>
	<li>Giavazzi, F., Pal, A., Cerbino, R. Probing roto-translational diffusion of small anisotropic colloidal particles with a bright-field microscope. The European Physical Journal E. 44 (4), 61 (2021).</li>
	<li>Schwarz-Linek, J. et al. Escherichia coli as a model active colloid: a practical introduction. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 137, 2-16 (2016).</li>
	<li>Kurzthaler, C. et al. Probing the spatiotemporal dynamics of catalytic Janus particles with single-particle tracking and differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).</li>
	<li>Mandal, S., Kurzthaler, C., Franosch, T., L&#246;wen, H. Crowding-enhanced diffusion: an exact theory for highly entangled self-propelled stiff filaments. Physical Review Letters. 125 (13), 138002 (2020).</li>
	<li>Norouzisadeh, M., Chraga, M., Cerchiari, G., Croccolo, F. The modern structurator: increased performance for calculating the structure function. The European Physical Journal E. 44 (12), 146 (2021).</li>
	<li>Gu, M., Luo, Y., He, Y., Helgeson, M. E., Valentine, M. T. Uncertainty quantification and estimation in differential dynamic microscopy. Physical Review E. 104 (3), 034610 (2021).</li>
	<li>Hoyer, S., Hamman, J. xarray: N-D labeled arrays and datasets in Python. Journal of Open Research Software. 5 (1), 10 (2017).</li>
	<li>Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. Stiffening and inelastic fluidization in vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 15 (36), 7127-7136 (2019).</li>
	<li>Guo, M. et al. The role of vimentin intermediate filaments in cortical and cytoplasmic mechanics. Biophysical Journal. 105 (7), 1562-1568 (2013).</li>
	<li>Lavenus, S. B., Tudor, S. M., Ullo, M. F., Vosatka, K. W., Logue, J. S. A flexible network of vimentin intermediate filaments promotes migration of amoeboid cancer cells through confined environments. Journal of Biological Chemistry. 295 (19), 6700-6709 (2020).</li>
	<li>Patteson, A. E. et al. Loss of vimentin enhances cell motility through small confining spaces. Small. 15 (50), 1903180 (2019).</li>
	<li>Lin, Y.-C. et al. Origins of elasticity in intermediate filament networks. Physical Review Letters. 104 (5), 058101 (2010).</li>
	<li>Pawelzyk, P., M&#252;cke, N., Herrmann, H., Willenbacher, N. Attractive interactions among intermediate filaments determine network mechanics in vitro. PLOS ONE. 9 (4), e93194 (2014).</li>
	<li>Schepers, A. V. et al. Multiscale mechanics and temporal evolution of vimentin intermediate filament networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (27), e2102026118 (2021).</li>
	<li>Wu, H. et al. Effect of divalent cations on the structure and mechanics of vimentin intermediate filaments. Biophysical Journal. 119 (1), 55-64 (2020).</li>
	<li>Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).</li>
	<li>Giavazzi, F., Malinverno, C., Scita, G., Cerbino, R. Tracking-free determination of single-cell displacements and division rates in confluent monolayers. Frontiers in Physics. 6, 120 (2018).</li>
	<li>Cho, J. H. Multiscale Probing of Colloidal Gelation Dynamics., Massachusetts Institute of Technology (2018).</li>
	<li>Krall, A. H., Weitz, D. A. Internal dynamics and elasticity of fractal colloidal gels. Physical Review Letters. 80 (4), 778-781 (1998).</li>
	<li>Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Probe microrheology without particle tracking by differential dynamic microscopy. Rheologica Acta. 56 (11), 863-869 (2017).</li>
	<li>Edera, P., Bergamini, D., Trappe, V., Giavazzi, F., Cerbino, R. Differential dynamic microscopy microrheology of soft materials: a tracking-free determination of the frequency-dependent loss and storage moduli. Physical Review Materials. 1 (7), 073804 (2017).</li>
	<li>Wang, B., Kuo, J., Bae, S. C., Granick, S. When Brownian diffusion is not Gaussian. Nature Materials. 11 (6), 481-485 (2012).</li>
	<li>soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0.&#160;Zenodo&#160;(2021).</li>
	<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li>
	<li>Nixon-Luke, R., Arlt, J., Poon, W. C. K., Bryant, G., Martinez, V. A. Probing the dynamics of turbid colloidal suspensions using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 18 (9), 1856-1867 (2022).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Burada açıklanan yazılım paketi, optik mikroskop kullanılarak elde edilen görüntülerde gözlenen yoğunluk dalgalanmalarını analiz etmek için DDM'yi kullanır. İlk olarak vimentin ağlarına gömülü izleyici parçacıkların verilerinden elde edilen temsili sonuçlar gösterilmiştir. Bu tür verilerin analizi, ağın ağ boyutunu ve sertliğini, tek parçacık izlemenin sitoiskelet ağlarının geçmiş birçok çalışmasında nasıl kullanıldığına benzer şekilde karakterize etmek için kullanılabilir 6,12,13. DDM'yi tek parçacık izlemeye göre kullanmanın bir avantajı, DDM'nin parçacıkların lokalize edilmesini gerektirmemesidir. Bu nedenle, parçacık yoğunluğunun çok yüksek olduğu veya parçacıkların lokalize edilemeyecek ve izlenemeyecek kadar küçük olduğu görüntülerde bile, DDM dinamikleri belirleyebilir. Tek parçacık izlemenin avantajlı olacağı yer, parçacık-parçacık değişkenliğini incelerken. DDM ile, topluluk ortalama dinamikleri bulunurken, tek parçacık izleme ile hem tek bir parçacığın MSD'sini hem de topluluk ortalaması MSD'sini hesaplayabilir. Bununla birlikte, DDM, geniş bir görüş alanındaki birden fazla ilgi alanını analiz ederek heterojen dinamikleri araştırmak için kullanılabilir.
Daha sonra, iki farklı etiketli sitoiskelet filament tipinden oluşan aktif bir ağdaki floresan olarak etiketlenmiş filamentlerin verilerinden elde edilen temsili sonuçlar11 gösterilmiştir. Bu verilerle, balistik hareket, görüntü içinde herhangi bir yerelleştirilebilir özelliğe ihtiyaç duymadan karakterize edildi. DDM, topluluğun ortalama dinamiklerini az sayıda kullanıcı girdisiyle çıkardığından, farklı koşullarla elde edilen görüntü serilerinin karşılaştırılmasını kolaylaştırır (örneğin; farklı aktin oranlarına sahip numunelerin mikrotübüllere veya50'de yapıldığı gibi farklı miyozin konsantrasyonlarına sahip numunelerin karşılaştırılması). Ek olarak, floresan görüntülemeyi kullanarak, çok renkli etiketleme kullanarak bir ağın farklı bileşenlerinin dinamiklerini araştırabiliriz. Bu, aktin ve mikrotübüllerin dinamiklerinin, çok renkli görüntüleme kullanılarak aktif bir aktin-mikrotübül kompozit ağında ayrı ayrı analiz edildiği 11,50'de yapıldı. Buradaki temsili sonuçlar bölümünde, sadece mikrotübül kanalından elde edilen sonuçlar gösterildi, ancak önceki çalışmalarda mikrotübül ve aktin filamentlerinin dinamiklerini karşılaştırdık11.
Bu temsili sonuçların ya pasif subdifüzyonu ya da aktif balistik hareketi sergilediğini not ediyoruz. Daha da önemlisi, DDM, ara zaman veya uzunluk ölçeklerinde dinamik tipinde bir geçişin olduğu sistemleri analiz etmek için kullanılabilir. Örnek olarak, Kurzthaler ve ark. DDM'yi kısa zaman ölçeklerinde aktif yönlendirilmiş hareketi ve daha uzun zaman ölçeklerinde oryantasyonun randomizasyonunu keşfetmek için aktif Janus kolloidleri sistemi ile birlikte kullanmışlardır59; Giavazzi ve ark. DDM'yi kaba bir köpükle kullandılar ve bir kabarcık33'ün uzunluk ölçeğine karşılık gelen dinamiklerde bir çapraz geçiş buldular; ve Cho ve ark. DDM'yi kolloidal jellerle kullandılar ve fraktal kümelerden tüm ağa kadar uzanan farklı uzunluk ölçeklerinde üç ayırt edilebilir rejim buldular32.
Temsili sonuçlar bölümünde yer alan veriler parlak alan mikroskobu ve lazer taramalı konfokal mikroskopi ile elde edilmiştir. Bununla birlikte, daha önce de belirtildiği gibi, DDM birçok görüntüleme yöntemiyle kullanılabilir. Herhangi bir görüntüleme yönteminde, kullanıcılar optik kesitleme derecesi veya alan derinliği gibi optik ayarları göz önünde bulundurmalıdır. Yüksek derecede optik bölümleme, odak dışı nesnelerden gelen sinyali azaltabilir, ancak nesnelerin alan derinliğinden25,28 dışına çıkması için zaman ölçeğinden daha büyük zaman ölçekleri üzerindeki dinamikleri doğru bir şekilde ölçemeyecektir. Q-bağımlı alan derinliğinin DDM analizini nasıl etkilediğine dair daha kapsamlı bir tartışma22'de bulunabilir. Parlak alan görüntüleme için, kullanıcıların numune kalınlığını da göz önünde bulundurmaları gerekebilir. Zayıf saçılan numuneler için, daha kalın numuneler daha fazla sinyalsağlayabilir 42, bulanık numuneler ise analizin birden fazla saçılma81'i hesaba katacak şekilde değiştirilmesini gerektirebilir. Son olarak, doğrusal uzay değişmezi olmayan görüntüleme yöntemleri için (yani, bir nesnenin kamerası tarafından kaydedilen yoğunluğun, o nesnenin x-y örnek düzleminde nerede olduğuna bağlı olduğu yerlerde), karanlık alan DDM27'de gösterildiği gibi doğrusal alan varyansının hesaba katılması gerekebilir.
DDM'ye başlayanlar için, mekansal ve zamansal çözünürlüğü göz önünde bulundurmanın önemini vurgulamak istiyoruz. Belirlenen bozunma sürelerini dalga sayısının bir fonksiyonu olarak incelerken, kişinin çözünürlüğünün sınırlarını işaretlemek önemlidir (yani, Şekil 5'te yapıldığı gibi, maksimum ve minimum gecikme süreleri ve maksimum dalga sayısı). Veri toplamadan önce bu sınırlar hakkında dikkatlice düşünülmelidir, böylece en uygun objektif lens, görüntü boyutu, kare hızı ve film süresi seçilebilir. Diğer önemli husus, arka plan parametresi B'nin nasıl tahmin edileceğidir. Literatürde arka planı tahmin etmek için birçok yöntem kullanılmış ve B'yi fazla veya küçümsemenin etkileri önceki yayınlarda 62,77'de tanımlanmıştır. Şekil 10'da gösterildiği gibi, PyDDM, kullanıcıların B'yi tahmin etmek için farklı yöntemler uygulamalarına izin verir ve yeni kullanıcıların bu yöntemleri denemelerini ve hangilerinin kullanımına uygun olduğunu değerlendirmelerini öneririz.
Bu paketin güçlü bir gücü, örnek verileri içeren kapsamlı dokümantasyonu ve izlenecek yolları, analizlerin nasıl gerçekleştirildiğini takip etmek için meta verilerin depolanması ve düzenlenmesi ve DDM matrisinin nasıl analiz edileceği esnekliğidir (çeşitli montaj modelleri, arka plan parametresi B'yi tahmin etmek için birden fazla yöntem, MSD'yi bulma yeteneği). Ancak, bu kodun geliştirilebilecek birçok yönü vardır. Şu anda, kod hızlı hesaplama hızı için optimize edilmemiştir. Hesaplamayı hızlandırma yöntemleri61,62 olarak bildirilmiştir ve bunlar gelecekteki sürümlerde uygulanacaktır. Ek olarak, belirsizlikleri daha iyi tahmin etmek ve kullanıcıları uygun ISF modeli62'ye yönlendirmek için simülasyonlar kullanmak için yakın zamanda bildirilen yöntemleri uygulamayı planlıyoruz. Diğer iyileştirmeler için, kullanıcıların önerileriyle bizimle iletişime geçeceğini umuyoruz.

Hücre iskeleti, ökaryotik hücrelerin sitoplazması boyunca uzanan ve hücre yüzeyini çekirdeğe bağlayan bir protein filamentleri ağıdır. Büyük ve tekrarlanan mekanik yüklere karşı mekanik koruma sağlayan benzersiz malzeme özelliklerine sahiptir, ancak aynı zamanda dinamik hücre şekli değişikliklerini de yönlendirir1. Yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağları, gömülü parçacıkların kafeslenmesinden moleküler motorlar tarafından tahrik edilen balistik harekete kadar bir dizi ilginç dinamik davranışa yol açabilir 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Bu tür ağların dinamiklerini analiz etme yöntemleri arasında gömülü izleyici mikrosferlerinin hareketini izleme 6,7,12,13,14, zaman içinde protein yoğun kümelerin boyutunu izlemek için görüntü analizi8, dinamik ışık saçılması 15, parçacık görüntü velosimetrisi 4,16,17,18,19 , zaman içinde görüntülerin güç spektral yoğunluğunun hesaplanması19 ve kimograf analizi20. Yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağları üzerine daha fazla çalışma yapıldıkça, hücresel mekaniği veya aktif maddeyi anlamak için, dinamikleri karakterize etmek için sağlam, tarafsız ve tekrarlanabilir yöntemler giderek daha fazla gerekli hale gelmektedir. Diferansiyel dinamik mikroskopi (DDM) 21,22, sitoiskelet dinamiklerini incelemek için kullanılan nispeten yeni bir tekniktir, dinamikleri az sayıda kullanıcı tanımlı parametreyle verimli bir şekilde ölçen böyle bir tekniktir. Burada açıklanan yazılım paketiyle, programlama veya görüntü analizi konusunda çok az deneyime sahip araştırmacılar, DDM'yi kendi çalışmaları için kullanabileceklerdir.
DDM, bir numunenin dinamiklerini çıkarmak için kullanılan bir görüntü analiz tekniğidir. Parçacık izleme veya parçacık görüntü velosimetrisi gibi, DDM de tipik olarak mikroskopla kaydedilen bir dizi görüntü (genellikle binlerce görüntü) gerektirir. Parçacık izlemenin aksine, bireysel özelliklerin veya izleyici boncukların görüntüde yerelleştirilmesi (hatta yerelleştirilebilir) gerekmez. Hem partikül izleme hem de partikül görüntü velosimetrisinden farklı olarak, DDM ile topluluk dinamikleri nispeten az sayıda kullanıcı tarafından belirlenen parametrelerle kurtarılır. DDM ile görüntüler, bir dalga sayıları aralığı üzerindeki yoğunluk dalgalanmalarının bozunma süresini belirlemek için Fourier uzayında analiz edilir, q, burada q = 2πu ve u, uzamsal frekansların <img alt="Equation004" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq004.png"> büyüklüğüdür. Biri saçılma benzeri bilgiler elde eder, ancak mikroskopta elde edilen gerçek uzay görüntüleriile 21,22,23. Bu nedenle, geniş alan floresan 22,24, konfokal floresan 25, polarize26, karanlık alan 27 veya ışık tabakası floresan 28 mikroskopi gibi çeşitli kontrast üretenmikroskopi yöntemlerinden yararlanılabilir. Ayrıca, DDM analizi için kullanılan görüntüler, tamamlayıcı bilgi sağlamak için partikül izleme veya partikül görüntü velosimetrisi için kullanılabilir.
Dinamik ışık saçılması ve optik mikroskopiden gelen özelliklerin bu kombinasyonu, DDM'yi güçlü ve çok yönlü bir teknik haline getirir. DDM'nin 73 nm kolloidal parçacıkların difüzyonunu ölçtüğü 2008 21'de Cerbino ve Trappe tarafından ilk tanımından bu yana, DDM, akan kolloidleriölçmek için kullanılmıştır 29, kolloidal agregasyon30,31, nematik sıvı kristallerin viskoelastisitesi26, kolloidal jellerin dinamikleri 32, kabalaştırıcı köpükler 33, sınırlı ortamlarda nanopartiküller 34, 35,36,37, bakteriyel hareketlilik 38,39,40,41, zayıf saçılan protein kümelerinin difüzyonu 42, sıvı arayüzlerinde kılcal dalgalar 43 ve diğer sistemler. DDM'yi kullanan yayınların daha eksiksiz bir listesini arayanlar, konuyla ilgili kapsamlı inceleme makalelerine başvurabilirler 22,23,44,45.
DDM, biyolojik ağların dinamiklerini araştırmak için de kullanılmıştır. Drechsler ve ark. canlı Drosophila oositlerinde aktinin dinamiklerini ölçmek için DDM'yi kullandılar46. Burla ve ark. hyaluronan ve hyaluronan-kollajen kompozitleri ağlarındaki izleyici parçacıkların dinamiklerini ölçmüştür47. DDM'nin yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarındaki izleyici parçacıkların dinamiklerini incelemek için çeşitli kullanımları9,10, bu tür ağlardaki DNA moleküllerinin taşınması48,49 ve aktif yeniden yapılandırılmış ağların dinamikleri de belgelenmiştir 11,50,51. DDM'nin bu tür sistemlerdeki dinamikleri ölçmedeki bir avantajı, bireysel parçacıkların veya moleküllerin lokalize edilmesine ve izlenmesine gerek olmamasıdır. Bu nedenle, örneğin, kalabalık ortamlardaki DNA moleküllerinin dinamikleri, bu kadar küçük ve küresel olmayan moleküllerin izlenmesindeki zorluğa rağmen DDM ile ölçülebilir. Ayrıca, floresan mikroskobu ile, karmaşık bir kompozitteki bireysel bileşenlerin dinamiklerini seçici olarak ölçmek için çok renkli etiketleme kullanılabilir.
DDM'yi gerçekleştirmek için, zaman içinde bir dizi görüntü alınır, I(x,y,t). Belirli bir gecikme süresi için, Δt, bu gecikme süresiyle ayrılmış tüm (veya bir alt kümesi) görüntü çiftleri bulunur. Her çiftin farkının kareli Fourier dönüşümü,
<img alt="Equation007" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq007.png" style="margin-bottom: 0px;">
birlikte hesaplanır ve ortalaması alınır. Bu miktar, <img alt="Equation008" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq008.png" style="margin-bottom: 0px;">dinamiklerin izotropik olması koşuluyla radyal olarak ortalamadır. Bu, DDM matrisini (görüntü yapısı işlevi olarak da adlandırılır) verir <img alt="Equation009" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq009.png" style="margin-bottom: 0px;">. Bu işlem Şekil 1'de grafiksel olarak gösterilmiştir. Bu DDM matrisinden numunenin dinamiklerini belirlemek için, DDM matrisinin formu aldığı varsayılır.
<img alt="Equation010" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq010.png" style="margin-bottom: 0px;">
burada A, mikroskobun ayrıntılarına ve numunenin yapısına bağlı olan genliktir, B, görüntülerdeki gürültüye bağlı olan arka plandır ve f (q, Δt),dinamikler 21,22 hakkında bilgi içeren ara saçılma fonksiyonudur (ISF). Basit durumlarda,
<img alt="Equation014" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq014.png" style="margin-bottom: 0px;">
burada τ karakteristik bir bozunma veya korelasyon süresidir. Böyle bir ISF, seyreltik kolloidal süspansiyonlar21,24,27,37,40,52 gibi ergodik sistemler üzerinde DDM kullanan çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. Bununla birlikte, ISF'nin diğer biçimleri çeşitli dinamik türlerini modellemek için kullanılabilir. Örneğin, polidispers numuneler için ISF'yi modellemek üzere kümülatif bir genişleme kullanılabilir.
<img alt="Equation016" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq016.png" style="margin-bottom: 0px;">
burada μ polidispersitenin bir ölçüsüdür42,53; yoğunluk dalgalanmaları iki ayrı mod tarafından bozunursa, aşağıdaki gibi bir ISF kullanılabilir.
<img alt="Equation018" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq018.png" style="margin-bottom: 0px;">26, 54, 55, 56 , 57;
Diğer ISF'ler mikroorganizmaları veya diğer aktif parçacıklarıyüzdürmek için kullanılabilir 38,39,40,41,58,59.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63931/63931fig1v2.jpg"> Şekil 1: DDM analizine genel bakış. Görüntülerin zaman serilerinden, DDM matrisini hesaplamak için görüntü farklılıklarının Fourier dönüşümü hesaplanır. DDM matrisi, bir q değerleri aralığındaki yoğunluk dalgalanmalarının zaman ölçeğini belirlemek için bir modele sığdırılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63931/63931fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Burada Python'da geliştirilen bir DDM analiz yazılım paketinin kullanımı, PyDDM, anlatılmaktadır. Bu yazılım paketi, araştırma laboratuvarlarımız tarafından yapılan çalışmalara ve son birkaç yılda yayınlanan diğer çalışmalara dayanmaktadır. Bu yazılım paketini oluşturmak için birincil motivasyon kaynakları arasında (1) analizde kullanılan meta verileri ve parametreleri takip etme ve depolama; (2) baştan sona ayrıntılı analiz örnekleri içeren kapsamlı dokümantasyon; ve (3) verileri sığdırmak için farklı matematiksel modeller kullanmanın (veya yeni) matematiksel modeller oluşturmanın kolay bir yolu (örneğin, aktif filamentler60 için yakın zamanda geliştirilenler gibi ISF modellerinin eklenmesi basit olacaktır). DDM analizi için diğer yazılım paketleri de mevcuttur, ancak hepsi iyi belgelenmemiş ve açık kaynaklı bir programlama dilinde yazılmamıştır. Örneğin, GPU'larda hesaplama ile C++ kodu (https://github.com/peterlu/ConDDM)25, hesaplamaları hızlandırmak için zaman içinde Fourier dönüşümlerini kullanan C++ kodu (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61, MATLAB ve Python sürümleri (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, MATLAB kodu (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27 ve belirsizlik ölçümüne sahip MATLAB kodu ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. Bu PyDDM paketi iyi belgelendiğinden ve DDM matrisinin nasıl hesaplandığı ve analiz edildiği konusunda çok fazla esneklik sağladığından, programlama veya görüntü analizindeki geçmişlerine bakılmaksızın DDM'yi uygulamak isteyen araştırmacılar için yararlı olabilir.
Protokol, bu yazılım paketinin in vitro yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarının dinamiklerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu, iki farklı görüntüleme verisi seti kullanılarak yapılır: (1) parlak alan mikroskobu ile alınan bir vimentin ağına gömülü mikron altı izleyici parçacıklarının görüntüleri ve (2) lazer taramalı konfokal mikroskopi ile alınan miyozin tahrikli aktiviteye sahip dolaşık bir kompozit ağdaki floresan etiketli aktin ve mikrotübül filamentlerinin görüntüleri. Bu iki veri kümesinin analizleri, çeşitli görüntüleme yöntemleriyle (örneğin, parlak alan veya konfokal floresan) çekilen görüntüleri analiz etme, gömülü izleyicilerden veya etiketli filamentlerden dinamikleri çıkarma ve çeşitli dinamikleri (örneğin, alt difüzyon ve kısıtlı veya balistik) ölçme yeteneği de dahil olmak üzere DDM'nin dikkate değer güçlü yönlerini vurgulamaktadır.

<table><tbody><tr><td>CMOS kamera, Orca-Flash 4.0,</td><td>Hamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F-127, Pluronic</td><td>Sigma, Aldrich</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Jupyter, Notebook</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Nanodrop</td>, <td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Nikon Ti-Eclipse mikroskobu</td><td>, Nikon,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLL-PEG-bio</td><td>, SuSos AG, D&uuml; bendorf, İsviçre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polistiren boncuklar</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein diyalizi mini kaset</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PyDDM</td><td>San Diego Üniversitesi</td><td>N/A</td><td>Açık kaynaklı yazılım şu adresten edinilebilir: https://github.com/rmcgorty/PyDDM</td></tr></tbody></table>

diferansiyel dinamik mikroskopi kullanarak sitoiskelet dinamiğinin Ölçülmesi

Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy

Hücreler sürünebilir, kendi kendini iyileştirebilir ve dikkat çekici derecede dinamik sitoiskeletleri nedeniyle sertliklerini ayarlayabilir. Bu nedenle, sitoiskelet biyopolimerlerinin ağlarının yeniden oluşturulması, bir dizi aktif ve uyarlanabilir malzemeye yol açabilir. Bununla birlikte, hassas bir şekilde ayarlanmış özelliklere sahip bu tür malzemelerin mühendisliği, dinamiklerin ağ bileşimine ve sentez yöntemlerine nasıl bağlı olduğunu ölçmeyi gerektirir. Bu tür dinamiklerin nicelleştirilmesi, kompozit ağların zaman, mekan ve formülasyon uzayı boyunca farklılıklarla karşı karşıya kalmaktadır. Buradaki protokol, Fourier analiz tekniğinin, diferansiyel dinamik mikroskopinin (DDM), biyopolimer ağlarının dinamiklerini nasıl ölçebildiğini ve özellikle sitoiskelet ağlarının çalışmaları için çok uygun olduğunu açıklamaktadır. DDM, lazer taramalı konfokal, geniş alan floresan ve parlak alan görüntüleme dahil olmak üzere bir dizi mikroskopi modalitesi kullanılarak elde edilen görüntülerin zaman dizileri üzerinde çalışır. Bu tür görüntü dizilerinden, dalga vektörlerinin bir aralığı boyunca yoğunluk dalgalanmalarının karakteristik korelasyon süreleri çıkarılabilir. DDM analizi yapmak için kullanıcı dostu, açık kaynaklı bir Python paketi de geliştirilmiştir. Bu paketle, burada ara filament (vimentin) ağları ve aktif aktin-mikrotübül ağlarının verileriyle gösterildiği gibi, etiketli sitoiskelet bileşenlerinin veya gömülü izleyici parçacıklarının dinamikleri ölçülebilir. Önceden programlama veya görüntü işleme deneyimi olmayan kullanıcılar, bu yazılım paketini ve ilgili belgeleri kullanarak DDM gerçekleştirebileceklerdir.

Diferansiyel dinamik mikroskopi (DDM), dinamik ışık saçılması ve mikroskopi özelliklerini birleştirir. Burada, vimentin ağlarındaki parçacıkların subdifüzyon ve kafesli dinamiklerini ve aktif miyozin güdümlü aktin-mikrotübül kompozitlerinin balistik hareketini ölçerek yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarını karakterize etmek için DDM'yi kullanma süreci sunulmaktadır.

Diferansiyel Dinamik Mikroskopi Kullanarak Sitoiskelet Dinamiğinin Ölçülmesi

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal ...

Protokolümüz, bir dizi optik mikroskopi tekniği kullanarak birçok sistemdeki dinamikleri ölçebilir. Bu yöntemin, özellikle, yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarının dinamiklerini karakterize etmeye nasıl yardımcı olabileceğini vurguluyoruz. Diferansiyel Dinamik Mikroskopi yazılım paketimizi kullanmanın temel avantajı, iyi belgelenmiş olması, birden fazla örnek analiz dosyasına sahip olması ve farklı dinamik türlerini incelemek için kolayca uyarlanabilmesidir.Yazılım paketimiz sadece yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarında değil, aynı zamanda diğer yumuşak ve biyolojik olarak ilgili malzemelerde de dinamikleri ölçmek için kullanılabilir. Probun zaman ve uzunluk ölçeklerine bağlı olarak, Micro-Manager gibi mikroskop kontrol yazılımı kullanılarak 1.000'den fazla karelik görüntü dizileri elde edilir. PyDDM kod deposunda sağlanan örnekler klasörünün altında, example_parameter_file.yml adlı parametre dosyasının bir kopyasını oluşturun.Bu EML dosyasını Notepad + gibi bir metin düzenleyicisiyle veya JupyterLab'daki metin düzenleyicisiyle açın. Kopyalanan EML dosyasında, analiz edilecek görüntü dizisine karşılık gelen veri dizinini ve dosya adını sağlayın. Meta veriler bölümünün altında, piksel boyutunu ve kare hızını belirtin.Analiz parametresi bölümünün altında, DDM matrisinin hesaplanması için farklı gecikme sürelerinin sayısı ve en uzun gecikme süresi gibi parametreleri seçin. Montaj parametresi bölümünde DDM matrisinin veya ara saçılma işlevinin takılması hakkında, model ve model parametresinin adı, ilk tahmin, alt sınır ve üst sınır gibi ayrıntıları sağlayın. EML dosyasının dosya adını DDM çözümlemesine tam dosya yolu ile geçirerek çözümleme parametrelerindeki meta verileri sağlayarak DDM çözümleme sınıfının bir örneğini başlatın.Alternatif olarak, meta verileri ve parametreleri Python sözlük veri yapısı olarak geçirin. DDM matrisini hesaplamak için işlevi çalıştırın. Döndürülen verileri, Xarray paketinde veri kümesi olarak depolanan ilişkili değişkenler ve meta verilerle inceleyin.Ardından, PDF dosyası ve veri dizini olarak kaydedilen grafikleri ve şekilleri inceleyin. Bu grafiklerden biri, arka planın nasıl tahmin edildiğine ilişkin varsayılan yöntemi gösterir. Gerekirse, EML dosyasındaki parametre arka plan yöntemini kullanarak veya isteğe bağlı anahtar sözcük bağımsız değişkeni olarak DDM matrisini hesapla işlevine arka planın tahmin edildiği yöntemi değiştirin.Görüntü meta verilerini ve sığdırma parametrelerini içeren EML dosyasının dosya adını ileterek DDM fit sınıfının bir örneğini başlatın. İşlev baskı montaj modellerini yürüterek kullanılabilir modelleri listeleyin. EML parametre dosyasında veya yeniden yükleme uygun modeli ada göre kullanarak kullanılacak modeli belirtin.Seçilen modeldeki her parametre için, başlangıç tahminini ayarla ve parametre sınırlarını ayarla işlevlerini kullanarak EML dosyasında belirtilen değerlerden farklıysa başlangıç tahminlerini ve sınırlarını ayarlayın. İşlev uyumu ile uyumu gerçekleştirin. İşlev uyum raporuyla fit parametrelerinin q bağımlılığındaki uyumları incelemek için grafikler oluşturun.DDM matrisini veya ISF'yi sığdırma ile birlikte dört q değerinde gösteren iki x iki alt grafiklerle şekil de dahil olmak üzere çıktıyı kontrol edin. DDM matrisini veya ISF'yi etkileşimli bir şekilde en uygun şekilde çizmek için Jupyter Notebook ortamında DDM uyumlarına göz atma sınıfını kullanın. Dalga sayısı grafiğine karşı bozunma süresindeki bir noktaya tıklamak, verileri ve uyumu gösterecektir.Bir Xarray veri kümesine kaydedilen uyumun sonuçlarını kontrol edin ve bu veri yapısını diske kaydetmek için iki netCDF veya Python'un yerleşik turşu modülü işlevini kullanın. DDM analizi, bir vimentin ağındaki 0.6 mikron boncukların parlak alan görüntü serisi ve spektral olarak farklı floresan etiketlere sahip aktif bir aktin-mikrotübül kompozit ağından konfokal mikroskop görüntüleri üzerinde gerçekleştirildi. Ara saçılma fonksiyonları, farklı dalga sayılarında gecikme süresinin bir fonksiyonu ve 19 mikromolar ve 34 mikromolar vimentin konsantrasyonuna sahip bir ağ olarak çizildi.Fonksiyonun sıfırın çok üzerinde bir değerdeki uzun gecikme süresi platosu, ergodisiteyi gösterir. Farklı vimentin konsantrasyonlarına sahip iki ağ için q'nun bir fonksiyonu olarak çizilen bozunma süresi tau, alt difüzyon veya sınırlı harekete işaret eder. 34 ve 49 mikromolar vimentin ile ağ için q karesinin bir fonksiyonu olarak çizilen ergodisite olmayan c parametreleri, c'nin kütüğünün sınırlı hareket için beklendiği gibi q karesi ile orantılı olduğunu göstermiştir.Ortalama kareli yer değiştirmelere karşı gecikme süresi grafikleri, DDM'den belirlenen değerlerin, tek parçacık izleme yoluyla bulunanlarla iyi bir şekilde uyuştuğunu göstermiştir. Daha konsantre ağ için, değer daha uzun gecikme sürelerinde platolar. Aktif bir aktin-mikrotübül kompozit ağı için gecikme süresine karşı DDM matrisi, belirli bir q değeri için DDM matrisinin düşük gecikme zamanlarında bir platoya sahip olduğunu, daha sonra büyük gecikme zamanlarında daha da platolaştığını göstermiştir.DDM matrisine uyumdan gelen karakteristik bozunma süreleri tau, tau ve q arasındaki ilişkinin balistik hareketi gösterdiğini göstermektedir. Bu PyDDM yazılım paketini geliştirdikten sonra, aktif sitoiskelet ağlarının ve diğer sistemlerin anizotropik ve zamanla değişen dinamiklerini araştırmak için kullandık.

quantifying-cytoskeleton-dynamics-using-differential-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Maya tomurcuklanan nedeniyle güçlü genetik ve mikrotübül hücre iskeletinin basitliği için in vivo olarak mikrotübül dinamiklerinin çalışmak için avantajlı bir modeldir. Aşağıdaki protokol dönüşümü ve kültür maya hücreleri eş odaklı mikroskopi görüntü elde ve kantitatif maya hücrelerini canlı mikrotübül dinamiklerini analiz etmek açıklamaktadır.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Burada, bir protokol Förster rezonans eşzamanlı kullanımı için protein yük ve floresan kurtarma kuvvet duyarlı ölçüm etkinleştirme protein dynamics ölçmek için photobleaching sonra ölçmek için enerji transferi tabanlı gerilim sensörler mevcut canlı hücreler içinde protein dinamiği.

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Burada canlı hücre dönen disk konfokal mikroskopisi ve MATLAB tabanlı görüntü işleme kullanarak prometafazda senkronize hücrelerde mikrotübül dinamiği analizinin sağlam ve ayrıntılı bir yöntemini sıyoruz.

Monopolar Mitotik İğlerde Dönen Disk Mikroskobu ile Mikrotübül Dinamiğinin Ölçülmesi

Görüntüleme kaynaklı ortalama kare yer değiştirme (iMSD) analizi, makropinozomlara yapısal ve dinamik özellikler açısından içsel zaman evrimleşen doğalarını vurgulamak için uygulanır. Makropinozomlar daha sonra zaman değişmez ortalama yapısal / dinamik özelliklere sahip hücre altı yapılar için bir referans olarak insülin salgı granülleri (ISG'ler) ile karşılaştırılır.

Spatiotemporal Dalgalanma Spektroskopisi ile Kaçakçılık Yapan Hücre Altı Nanoyapıların Yapısal ve Dinamik Özelliklerinin İncelenmesi

Bu protokol, birincil hücre kültüründeki dinamik özelliklerini incelemek için EB3 protein transfeksiyonu ile mikrotübül artı-uç görselleştirmesine adanmıştır. Protokol, Huntington hastalığı hastalarından elde edilen insan primer deri fibroblastları üzerinde uygulandı.

İnsan Primer Cilt Fibroblastlarına Dayalı Huntington Hastalık Modelinde Mikrotübül Artı-Uç Dinamikleri Görselleştirmesi

Bu protokol, yayılan hücrelerin kenarındaki çıkıntıların dinamik parametrelerini (çıkıntılar, geri çekmeler, fırfırlar) ölçmeyi amaçlamaktadır.

Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Bu yazıda, birlikte dolaşık aktin filamentleri ve mikrotübüllerinin ayarlanabilir üç boyutlu kompozit ağlarının mühendisliği ve karakterizasyonu için protokoller sunulmaktadır. Kompozitler, miyozin II ve kinesin motorları tarafından tahrik edilen aktif yeniden yapılanma ve balistik harekete uğrar ve aktin, mikrotübüller, motor proteinler ve pasif çapraz bağlayıcıların göreceli konsantrasyonları tarafından ayarlanır.

Aktin-Mikrotübül Kompozitlerinin Ayarlanabilir Motor Tahrikli Dinamiği ve Mekaniği ile Yeniden Yapılandırılması ve Karakterize Edilmesi

Bu video, hücre kültürü için uygun, uyumlu, ekstrasellüler matriks (ECM) kaplanmamış maddeler imal etmek için kullanılan deneysel teknikler göstermek ve çekiş gücü mikroskopi için uygun ve hücre davranışı üzerindeki etkilerinin gözlenmesi ECM sertlik.

Hücresel Daralma miktarının Şikayet Matrisler hazırlanması

Öğrenin, Diferansiyel Dinamik Mikroskopi ile sitoiskelet ağlarının dinamiklerini nasıl ölçebilirsiniz. PyDDM yazılım paketi kullanılarak vimentin ve aktin-mikrotübül kompozitlerinin alt difüzyon ve balistik hareketleri analiz edilir.

Diferansiyel Dinamik Mikroskopi Kullanarak Sitoiskelet Dinamiğinin Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet