Diferansiyel Dinamik Mikroskopi Kullanarak Sitoiskelet Dinamiğinin Ölçülmesi
June 15th, 2022
Diferansiyel dinamik mikroskopi (DDM), dinamik ışık saçılması ve mikroskopi özelliklerini birleştirir. Burada, vimentin ağlarındaki parçacıkların subdifüzyon ve kafesli dinamiklerini ve aktif miyozin güdümlü aktin-mikrotübül kompozitlerinin balistik hareketini ölçerek yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarını karakterize etmek için DDM'yi kullanma süreci sunulmaktadır.
Protokolümüz, bir dizi optik mikroskopi tekniği kullanarak birçok sistemdeki dinamikleri ölçebilir. Bu yöntemin, özellikle, yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarının dinamiklerini karakterize etmeye nasıl yardımcı olabileceğini vurguluyoruz. Diferansiyel Dinamik Mikroskopi yazılım paketimizi kullanmanın temel avantajı, iyi belgelenmiş olması, birden fazla örnek analiz dosyasına sahip olması ve farklı dinamik türlerini incelemek için kolayca uyarlanabilmesidir.
Yazılım paketimiz sadece yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarında değil, aynı zamanda diğer yumuşak ve biyolojik olarak ilgili malzemelerde de dinamikleri ölçmek için kullanılabilir. Probun zaman ve uzunluk ölçeklerine bağlı olarak, Micro-Manager gibi mikroskop kontrol yazılımı kullanılarak 1.000'den fazla karelik görüntü dizileri elde edilir. PyDDM kod deposunda sağlanan örnekler klasörünün altında, example_parameter_file.yml adlı parametre dosyasının bir kopyasını oluşturun.
Bu EML dosyasını Notepad + gibi bir metin düzenleyicisiyle veya JupyterLab'daki metin düzenleyicisiyle açın. Kopyalanan EML dosyasında, analiz edilecek görüntü dizisine karşılık gelen veri dizinini ve dosya adını sağlayın. Meta veriler bölümünün altında, piksel boyutunu ve kare hızını belirtin.
Analiz parametresi bölümünün altında, DDM matrisinin hesaplanması için farklı gecikme sürelerinin sayısı ve en uzun gecikme süresi gibi parametreleri seçin. Montaj parametresi bölümünde DDM matrisinin veya ara saçılma işlevinin takılması hakkında, model ve model parametresinin adı, ilk tahmin, alt sınır ve üst sınır gibi ayrıntıları sağlayın. EML dosyasının dosya adını DDM çözümlemesine tam dosya yolu ile geçirerek çözümleme parametrelerindeki meta verileri sağlayarak DDM çözümleme sınıfının bir örneğini başlatın.
Alternatif olarak, meta verileri ve parametreleri Python sözlük veri yapısı olarak geçirin. DDM matrisini hesaplamak için işlevi çalıştırın. Döndürülen verileri, Xarray paketinde veri kümesi olarak depolanan ilişkili değişkenler ve meta verilerle inceleyin.
Ardından, PDF dosyası ve veri dizini olarak kaydedilen grafikleri ve şekilleri inceleyin. Bu grafiklerden biri, arka planın nasıl tahmin edildiğine ilişkin varsayılan yöntemi gösterir. Gerekirse, EML dosyasındaki parametre arka plan yöntemini kullanarak veya isteğe bağlı anahtar sözcük bağımsız değişkeni olarak DDM matrisini hesapla işlevine arka planın tahmin edildiği yöntemi değiştirin.
Görüntü meta verilerini ve sığdırma parametrelerini içeren EML dosyasının dosya adını ileterek DDM fit sınıfının bir örneğini başlatın. İşlev baskı montaj modellerini yürüterek kullanılabilir modelleri listeleyin. EML parametre dosyasında veya yeniden yükleme uygun modeli ada göre kullanarak kullanılacak modeli belirtin.
Seçilen modeldeki her parametre için, başlangıç tahminini ayarla ve parametre sınırlarını ayarla işlevlerini kullanarak EML dosyasında belirtilen değerlerden farklıysa başlangıç tahminlerini ve sınırlarını ayarlayın. İşlev uyumu ile uyumu gerçekleştirin. İşlev uyum raporuyla fit parametrelerinin q bağımlılığındaki uyumları incelemek için grafikler oluşturun.
DDM matrisini veya ISF'yi sığdırma ile birlikte dört q değerinde gösteren iki x iki alt grafiklerle şekil de dahil olmak üzere çıktıyı kontrol edin. DDM matrisini veya ISF'yi etkileşimli bir şekilde en uygun şekilde çizmek için Jupyter Notebook ortamında DDM uyumlarına göz atma sınıfını kullanın. Dalga sayısı grafiğine karşı bozunma süresindeki bir noktaya tıklamak, verileri ve uyumu gösterecektir.
Bir Xarray veri kümesine kaydedilen uyumun sonuçlarını kontrol edin ve bu veri yapısını diske kaydetmek için iki netCDF veya Python'un yerleşik turşu modülü işlevini kullanın. DDM analizi, bir vimentin ağındaki 0.6 mikron boncukların parlak alan görüntü serisi ve spektral olarak farklı floresan etiketlere sahip aktif bir aktin-mikrotübül kompozit ağından konfokal mikroskop görüntüleri üzerinde gerçekleştirildi. Ara saçılma fonksiyonları, farklı dalga sayılarında gecikme süresinin bir fonksiyonu ve 19 mikromolar ve 34 mikromolar vimentin konsantrasyonuna sahip bir ağ olarak çizildi.
Fonksiyonun sıfırın çok üzerinde bir değerdeki uzun gecikme süresi platosu, ergodisiteyi gösterir. Farklı vimentin konsantrasyonlarına sahip iki ağ için q'nun bir fonksiyonu olarak çizilen bozunma süresi tau, alt difüzyon veya sınırlı harekete işaret eder. 34 ve 49 mikromolar vimentin ile ağ için q karesinin bir fonksiyonu olarak çizilen ergodisite olmayan c parametreleri, c'nin kütüğünün sınırlı hareket için beklendiği gibi q karesi ile orantılı olduğunu göstermiştir.
Ortalama kareli yer değiştirmelere karşı gecikme süresi grafikleri, DDM'den belirlenen değerlerin, tek parçacık izleme yoluyla bulunanlarla iyi bir şekilde uyuştuğunu göstermiştir. Daha konsantre ağ için, değer daha uzun gecikme sürelerinde platolar. Aktif bir aktin-mikrotübül kompozit ağı için gecikme süresine karşı DDM matrisi, belirli bir q değeri için DDM matrisinin düşük gecikme zamanlarında bir platoya sahip olduğunu, daha sonra büyük gecikme zamanlarında daha da platolaştığını göstermiştir.
DDM matrisine uyumdan gelen karakteristik bozunma süreleri tau, tau ve q arasındaki ilişkinin balistik hareketi gösterdiğini göstermektedir. Bu PyDDM yazılım paketini geliştirdikten sonra, aktif sitoiskelet ağlarının ve diğer sistemlerin anizotropik ve zamanla değişen dinamiklerini araştırmak için kullandık.
Genel Bakış
Bu makale, yeniden yapılandırılmış sitoskelet ağlarının dinamiğini analiz etmek için Diferansiyel Dinamik Mikroskopi (DDM) kullanan bir protokolü sunmaktadır. Yöntem, vimentin ağlarındaki subdifüzif ve kafes hapsi dinamiklerini kantitatif olarak belirler ve aktif miyozin sürülen aktin-mikrotübül kompozitlerin balistik hareketini inceler.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyofizik
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Diferansiyel Dinamik Mikroskopi, dinamik ışık saçılması ve mikroskopi tekniklerini birleştirir.
- Yumuşak ve biyolojik olarak ilgili malzemelerin dinamiğini karakterize etmek için etkilidir.
- Yazılım paketi iyi belgelenmiştir ve çeşitli dinamik çalışmalar için uyarlanabilir.
- 1.000'den fazla karelik görüntü dizileri, mikroskop kontrol yazılımı kullanılarak analiz edilebilir.
Çalışmanın Amacı
- Yeniden yapılandırılmış sitoskelet ağlarının dinamiğini kantitatif olarak belirlemek.
- Çeşitli sistemlerde DDM kullanımı için ayrıntılı bir yöntem sunmak.
- Aktif sitoskelet ağlarının anizotropik ve zamanla değişen dinamiklerini araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- DDM analizi için PyDDM yazılım paketinin kullanılması.
- Görüntü meta verileri ve uyum parametreleri bir EML dosyasında belirtilir.
- Analiz, DDM matrisinin hesaplanmasını ve ara saçılma fonksiyonunun uyumunu içerir.
- Sonuçlar, PDF dosyaları olarak kaydedilen çizimler ve şekillerle görselleştirilir.
Ana Sonuçlar
- DDM analizi, çeşitli konsantrasyonlarda vimentin ağlarında nonergodisiyet ortaya koymuştur.
- Bozulma süre çizimleri, farklı vimentin konsantrasyonlarındaki ağlarda sub-difüzif hareketi göstermiştir.
- Aktif aktin-mikrotübül kompozitlerinde balistik hareket gözlemlenmiştir.
- DDM'den elde edilen sonuçlar, tek parçacık izleme verileriyle iyi uyum göstermektedir.
Sonuçlar
- DDM, sitoskelet dinamiklerini analiz etmek için güçlü bir araçtır.
- Yöntem, karmaşık biyolojik malzemelerin davranışları hakkında bilgiler sağlar.
- PyDDM yazılımı, dinamik süreçlerin kapsamlı analizini ve görselleştirmesini kolaylaştırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of cytoskeleton dynamics is critical for de-risking early-stage discovery and engineering of biomaterials with tunable mechanical properties. Differential Dynamic Microscopy (DDM) enables robust, reproducible measurement of network dynamics across diverse cytoskeletal systems, supporting predictive confidence in target validation and material design. This capability strengthens portfolio decisions by providing standardized, scalable dynamic readouts for both fundamental research and translational applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cytoskeletal network dynamics for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of biopolymer targets by measuring dynamic responses to composition changes.
- Facilitates predictive confidence in material behavior for downstream engineering or therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated dynamic readouts for high-content screening of cytoskeletal modulators.
- Standardizes assay outputs through reproducible, quantitative DDM analysis across imaging modalities.
- Enables scalable evaluation of compound effects on network mechanics and dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns dynamic measurements with disease-relevant cytoskeletal phenotypes when modeling pathophysiology.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling direct comparison of network dynamics across systems.
- Supports risk-adjusted advancement by quantifying dynamic biomarkers in engineered or native networks.
Pipeline & Workflow Integration
DDM-based quantification integrates from early discovery through assay development and preclinical research, providing a reusable analytical capability for cytoskeletal and soft material systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying dynamic responses to perturbations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound or genetic screening campaigns targeting cytoskeletal function.
- Analytics: Provides robust statistical measurements such as decay times, nonergodicity parameters, and mean squared displacement for comparative analysis.
- Translational Research: Enables alignment of in vitro dynamic phenotypes with disease models when supported by system relevance.
- Enterprise Reuse: Offers a documented, open-source software package adaptable across diverse imaging platforms and biological systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cytoskeletal target validation.
- Operational Value: Standardizes dynamic measurements and enhances reproducibility across teams and platforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing quantitative, scalable dynamic readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of biomaterial and cytoskeletal modulation programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy and basic familiarity with Python-based analysis workflows.
- Needs access to imaging infrastructure capable of acquiring high-frame-count time series.
- Demands cross-team standardization of metadata and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable to a range of cytoskeletal and soft material systems with appropriate labeling or tracer strategies.
- Dependent on image quality and acquisition parameters for optimal dynamic resolution.
