Dinamik Hücre Kültürü için Çıkış Fraksiyonasyonu ile Entegre Çok Akışlı Perfüzyon Biyoreaktörü

Bu yöntem, sekresyon oranlarının zamanla nasıl değiştiğini ve hücrelerin zamanla değişen katı sinyallere nasıl tepki verdiğini anlamaya yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajları, düşük maliyetinin, çok az eğitim gerektirmesi ve bolluk sistemi kurulumunun yeni deneyler için uyarlanabilmesidir. Bir şırıngayı bir arka plan çözeltisiyle doldurarak başlayın ve ilk şırınga pompasına yükleyin.

Başka bir şırıngayı izleyici çözeltisiyle doldurun ve ikinci şırınga pompasına yükleyin. Her iki şırıngayı da luer konektörlerini kullanarak dört yönlü bir stopcock'un üç bağlantı noktasından ikisine bağlayın. Stopcock'u arka plan çözeltisine kapatın ve izleyici solüsyonunu açık porttan damlayana kadar stopcock'a pompalayın.

Pompayı durdurun ve şırıngayı daha fazla ayarlamayın. Şırınga pompalarının hareket çubuğunun şırınga pistonlarına doğru itildiğinden emin olun, böylece pompa başlatıldığında akış hemen başlar. Durdurucuyu izleyici çözeltisine kapatın ve tüm artık izleyici çözeltisi açık bağlantı noktasından temizlenene kadar arka plan solüsyonunu stopcock'a pompalayın.

Pompayı durdurun ve şırıngayı daha fazla ayarlamayın. RTD analizi için istenen akış sistemi bileşenini ayarlayın. Ucu bir pipet ucu dağıtıcısına yerleştirin ve arka plan solüsyonunu tamamen dolana kadar bileşenden pompalayın.

İzleyici çözeltisi için pompayı istenen akış hızına ayarlayın. Stopcock'u arka plan çözümüne kapatın ve izleyici çözümünün akışını başlatın. Aynı zamanda, kesir toplayıcıyı başlatın.

İzleyicinin impuls girişine yaklaşmak için izleyici çözeltisinin akışına kısa bir süre devam edin. RTD'ler için saatte bir mililitre akış hızında 10 dakikalık bir nabız süresi önerilir. İzleyici çözeltisi darbe periyodunun sonunda izleyici çözeltisi pompasını durdurun.

Durdurmayı hızlı bir şekilde izleyici çözeltisine kapatın ve arka plan çözeltisinin akışını aynı akış hızında başlatın. Arka plan çözeltisinin, izleyicinin tümü sistemden ve toplanan fraksiyonlara geçene kadar fraksiyonları akmasına ve toplamasına izin verin. Steril koşullar altında, iğneli tıpaları, iğneler yukarı çekilmiş olarak kuyu plakası kültürlerine yerleştirin.

Durdurucu yerleştirildikten sonra, çıkış iğnesinin yüksekliği kararlı sıvı seviyesini belirlediğinden, iğneleri perfüzyon için istenen yüksekliğe indirin. İğneleri erkek luer kapaklarıyla kapatın ve tüm kuyu plakasını kullanıma kadar 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatörde tutun. Perfüzyon için kullanılacak iki ortamı hazırlayın, ilk önce dağıtılacak ortamı bir ve diğer ortam iki olarak etiketleyin.

Perfüze edilecek her kültür için, bir şırıngayı orta bir taneyle doldurun ve dispansyonunun tüm süresi boyunca artı başlangıçta perfüzyon sistemini doldurmak için yeterli hacimle doldurun. Sökülmesinin tüm süresi boyunca dayanması için ikinci bir şırıngayı orta iki ile doldurun. Her iki şırıngayı da dört yönlü bir stopcock'un üç portundan ikisine bağlayın.

Şırıngaları stopcocklara bağlamak için bir boru uzunluğu gerekebilir. Stopcock'u orta bir için kapatarak ve açık porttan damlamaya başlayana kadar orta ikiyi stopcock'a dağıtarak stopcock'ları hazırlayın. Ardından, orta iki için stopcock'u kapatın ve kalan tüm orta iki açık porttan temizlenene kadar orta olanı stopcock'a dağıtın.

Dişi - dikenli luer konektörü kullanarak yukarı akış borusunu açık stopcock portuna takın. Tüpün diğer ucuna bir erkek - diken luer konektörü yerleştirin. Yukarı akış tüpü orta ile doldurulana kadar şırıngadan bir ortam dağıtın ve daha önce gösterildiği gibi aşağı akış borusunun hazırlanmasına devam edin.

Aşağı akış borusunun bir ucuna bir erkek - diken luer konektörü yerleştirin ve dişi bir luer kapağı ile kapatın. Hazırlanan tüm boruları, şırıngaları ve kuyu plakasını perfüzyon için kullanılacak inkübatöre dikkatlice getirin. Şırınga pompasını ve fraksiyon toplayıcıyı inkübatörün yakınında istenen yerlere yerleştirin.

Şırınga pompasını inkübatörün üstüne veya yanına yerleştirin ve fraksiyon toplayıcıyı inkübatörün yanına portun yanına yerleştirin. Şırıngaları pompaya yükleyin. Tüm yukarı ve aşağı akış tüplerinin kapaklı uçlarını bir araya getirin ve bunları inkübatörün dışından liman üzerinden içeriye doğru itin.

Çıkış yönündeki tüplerin açık uçlarını, fraksiyon toplayıcının çok kafalı dağıtıcısının dağıtım pipet uçlarına yerleştirin. İnkübatörün içinde, akan ortamın ısı ve karbondioksit alabileceği boru uzunluğunu en üst düzeye çıkarmak için inkübatöre yukarı akış tüplerinin mümkün olduğunca gevşekliğini çekin. Takılan her kuyu için, iğneleri ve bu kuyu için yukarı ve aşağı akış tüplerini hızlı bir şekilde açın, ardından bunları luer konektörleriyle birbirine takın.

Tüm parçalar bağlandıktan sonra, tüm akışların düzgün bir şekilde aktığından emin olmak için şırınga pompasını nispeten yüksek bir hızda kısaca çalıştırın. Bu noktada, deneye ortamla dolu aşağı akış tüpleri ile başlamak istenirse, hepsi dolana kadar pompayı çalıştırmaya devam edin, aksi takdirde pompayı durdurun. Şırınga pompası akış hızını orta ve fraksiyon toplama sıklığı için ayarlayın ve deneye başlamak için her iki makineyi aynı anda başlatın.

Orta kaynağın değiştirilmesi gerektiğinde, şırınga pompasını orta kaynak için hızlı bir şekilde durdurun. Stopcock'u orta seviyeye kapatın ve şırınga pompasını orta iki için çalıştırın. Daha sonra isterseniz, kaynağı benzer şekilde orta seviyeye geri döndürün.

İstenilen deneme süresi boyunca kesirleri toplayın. İki RTD deneyinden elde edilen fraksiyonlardaki izleyici konsantrasyonları ölçüldü ve iki RTD'yi üretmek için veri MATLAB komut dosyasından RTD'ye girdi. Tek tüpler ve seri halinde birden fazla boru parçası, tek bir eksenel dağılım modeli ile iyi uyum sağladı ve aynı doğrultuda perfüze edilmiş bir 48 kuyu plakası eklenmesi, hem bir metre tüp RTD'nin hem de tüm sistemin RTD'sinin eksenel dağılım fonksiyonlarına uymasına izin veren ihmal edilebilir sapmaya neden oldu.

Bir metre tüp RTD verilerine takılan eksenel dağılım modeli kullanılarak zayıf bir model uyumu örneği gösterildi ve verilerle birlikte çizildi. İlk parametre tahminleri, tau'nun hacimsel akış hızına bölünen perfüzyon sistemi hacmine yaklaşık olarak eşit olduğu iyi bir model uyumu üretmek için değiştirildi. 90 dakikalık bir TNF-alfa darbesi, sisteme giriş sinyali olarak tanımlandı ve kuyu plakası girişindeki TNF-alfa sinyalini belirlemek için bir metrelik boru RTD ile birleştirildi.

Giriş sinyali, toplanan fraksiyonlarda sistemin çıkışındaki TNF-alfa sinyalini belirlemek için tüm sistemin RTD'si ile de birleştirildi. HEK 293 hücreleri, NF-kappaB yanıt elemanını içeren bir promotör tarafından tahrik edilen GLuc'u salgılamak üzere tasarlanmıştır. Deney, TNF-alfa maruziyetini takiben NF-kappaB tarafından yönlendirilen GLuc ekspresyonunda önemli bir ekspresyon artışı ve yavaş bir azalma olduğunu ortaya koydu.

Sistemin varyasyonları, sinyallerin girilmesini gerektirmeyen ve hücreleri farmasötik-hu bağlayıcı çözünen profillere maruz bırakan deneyler için daha basit bir kurulum da dahil olmak üzere beraberindeki makalede açıklanmaktadır.