Name: Dinamik Hücre Kültürü için Çıkış Fraksiyonasyonu ile Entegre Çok Akışlı Perfüzyon Biyoreaktörü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Öğrenin, düşük maliyetli çok kanallı perfüzyon biyoreaktörü ile hücre kültüründe salgılanma ve emilim dinamiklerini nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, dinamik uyaran profilleri altında hücresel süreçleri incelemek için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Hibe No'lu destek ile yürütülmüştür. Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden R01EB012521, R01EB028782 ve T32 GM008339.

<ol><li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent%2C+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li>
<li>Talaei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+model+of+the+dynamics+of+cytokine+expression+and+human+immune+cell+activation+in+response+to+the+pathogen+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153(2021).</li>
<li>Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-dependent+glucose+consumption+dynamics+in+3D+primary+human+liver+cultures+measured+by+a+sensitive+and+specific+glucose+sensor+with+nanoliter+input+volume%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume.</a> FASEB Journal. 35 (3), 21305(2021).</li>
<li>Muzzey, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+time-lapse+fluorescence+microscopy+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).</li>
<li>Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+method+to+assess+the+endogenous+activity+and+the+light-response+of+the+retinal+clock+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals.</a> Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).</li>
<li>Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outlook+on+microfluidics%3A+the+promise+and+the+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An outlook on microfluidics: the promise and the challenge.</a> Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).</li>
<li>Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+measurement+of+circadian+clock+gene+expression+and+hormone+secretion+in+human+primary+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54673(2016).</li>
<li>Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-culture-based+secreted+bioluminescence+reporter+assay+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichannel+perfusion+culture+bioluminescence+reporter+system+for+long-term+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).</li>
<li>Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+circadian+oscillation+of+melatonin+release+in+pineal+cells+of+house+sparrow%2C+pigeon+and+Japanese+quail%2C+using+cell+perfusion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems.</a> Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).</li>
<li>Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+flow+cell+culture+system+for+precision+cell+stimulation+and+time-resolved+profiling+of+cell+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion.</a> Analytical Biochemistry. 625, 114213(2021).</li>
<li>Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaltzman%2C+WM+%22Drug+Delivery%3A+Engineering+Principles+for+Drug+Therapy%22">Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy</a>. , Oxford University Press. (2001).</li>
<li>Fogler, H. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFogler%2C+HS+%22Elements+of+Chemical+Reaction+Engineering.+4th+edn%22">Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn</a>. , Prentice Hall PTR. Boston. (2006).</li>
<li>Conesa, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConesa%2C+JA+%22Chemical+Reactor+Design%3A+Mathematical+Modeling+and+Applications%22">Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications</a>. , Wiley. (2019).</li>
<li>Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explicit+residence+time+distribution+of+a+generalised+cascade+of+continuous+stirred+tank+reactors+for+a+description+of+short+recirculation+time+%28bypassing%29%5BTitle%5D)+AND+%22Processes%22%5BJournal%5D)">Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing).</a> Processes. 7 (9), 615(2019).</li>
<li>Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+leukemic+T-cell+transcriptional+dynamics+in+vivo+with+a+blood-based+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay.</a> FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).</li>
<li>Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterising+bioreactor+mixing+with+residence+time+distribution+%28RTD%29+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests.</a> Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).</li>
<li>Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+dynamics+within+a+bioreactor+for+tissue+engineering+by+residence+time+distribution+analysis+combined+with+fluorescence+and+magnetic+resonance+imaging+to+investigate+forced+permeability+and+apparent+diffusion+coefficient+in+a+perfusion+cell+culture+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).</li>
<li>Gaida, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+and+gas+residence+time+distribution+in+a+two-stage+bioreactor+with+cell+recycle%5BTitle%5D)+AND+%22HAL+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle.</a> HAL Open Science. , (2008).</li>
<li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wave+characterization+for+mammalian+cell+culture%3A+residence+time+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution.</a> New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).</li>
<li>Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freixó, A., Sánchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+residence+time+distribution+technique+to+the+study+of+the+hydrodynamic+behaviour+of+a+full-scale+wastewater+treatment+plant+plug-flow+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Technology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Bu çalışma, TNF-α geçici bir darbesine yanıt olarak NF-κB güdümlü gen ekspresyonunun dinamiklerinin ölçüldüğü spesifik bir örnekle gösterilen çoklu ortam kaynaklarına sahip bir perfüzyon hücre kültürü sisteminin montajını ve çalışmasını açıklamaktadır. Perfüzyon sistemi bileşenlerinin RTD'leri ölçüldü ve modellendi ve hem hücrelerin TNF-α darbesine maruz kalmasını hem de toplanan atık su orta fraksiyonlarındaki TNF-α dağılımını tahmin etmek için sinyal evrişimi kullanıldı. Hücreler darbeye maruz bırakıldı ve fraksiyonlar...

Birçok önemli biyolojik süreç, hücre ve doku kültürlerinde dakikalar ila saatlerarasında 1,2,3 zaman ölçeğinde gerçekleşir. Bu fenomenlerin bazıları hızlandırılmış mikroskopi4, biyolüminesans1 veya diğer yöntemler kullanılarak otomatik bir şekilde gözlemlenebilir ve kaydedilebilirken, kimyasal analiz için kültür süpernatant örneklerinin toplanmasını içeren deneyler genellikle statik hücre kültürlerinde manuel olarak gerçekleştirilir. Manuel örnekleme, sık veya mesai saatleri dışında örnekleme zaman noktalarının rahatsızlığı nedeniyle belirli çalışmaların fizibilitesini sınırlar. Statik kültür yöntemlerinin diğer eksiklikleri, kimyasal uyaranlara kontrollü, geçici maruziyetleri içeren deneyleri içerir. Statik kültürlerde, uyaranlar manuel olarak eklenmeli ve çıkarılmalıdır ve uyaran profilleri zaman içindeki adım değişiklikleriyle sınırlıdır, orta değişiklikler de hücreleri kontrolsüz bir şekilde etkileyebilecek diğer ortam bileşenlerini ekler ve kaldırır5. Akışkan sistemler bu zorlukların üstesinden gelebilir, ancak mevcut cihazlar başka zorluklar da doğurur. Mikroakışkan cihazlar, özel ekipmanın ve üretim ve kullanım eğitiminin engelleyici maliyetleri ile birlikte gelir, numuneleri işlemek için mikroanalitik yöntemler gerektirir ve perfüzyon6'dan sonra hücrelerin cihazlardan kurtarılması zordur. Burada açıklanandeney türleri için birkaç makroakışkan sistem oluşturulmuştur 7,8,9,10 ve bunlar şirket içinde yapılan birden fazla özel parçadan yapılmıştır ve birden fazla pompa veya fraksiyon toplayıcı gerektirir. Ayrıca, yazarlar, biyoüretim için yararlı olan, ancak fizyolojiyi modellemek ve incelemek için tasarlanmamış, süspansiyon kültürü için karıştırılmış tank biyoreaktörleri dışında, ticari olarak temin edilebilen herhangi bir makroakışkan perfüzyon hücre kültürü sisteminin farkında değildir.
Yazarlar daha önce neredeyse tamamen ticari olarak temin edilebilen parçalardan oluşan düşük maliyetli bir perfüzyon biyoreaktör sisteminin tasarımı hakkında rapor vermişlerdi11. Sistemin baz versiyonu, bir kuyu plakasındaki birden fazla kültürün bir CO2 inkübatöründe tutulmasını ve bir şırınga pompasından gelen ortamla sürekli olarak perfüze edilmesini sağlarken, kültürlerden gelen atık su ortam akışları, özel bir modifikasyona sahip bir fraksiyon toplayıcı kullanılarak zaman içinde otomatik olarak numunelere bölünür. Böylece, bu sistem kültür ortamı süpernatantının otomatik örneklemesini ve zaman içinde kültürlere sürekli çözünen girdiyi mümkün kılar. Sistem makroakışkan ve modülerdir ve yeni deney tasarımlarının ihtiyaçlarını karşılamak için kolayca değiştirilebilir.
Burada sunulan yöntemin genel amacı, maddelerin zaman içinde hücreler tarafından salgılanma veya emilim oranlarının ölçüldüğü ve / veya hücrelerin hassas, geçici çözünen sinyallere maruz kaldığı deneylere olanak tanıyan bir perfüzyon hücre kültürü sistemi oluşturmak, karakterize etmek ve kullanmaktır. Bu video makalesinde, tek bir şırınga pompası ve modifiye fraksiyon toplayıcı kullanarak aynı anda altı adede kadar hücre kültürünü perfüze edebilen baz kurulumunun nasıl monte edileceği açıklanmaktadır. Baz sistemde, hücreleri kısa darbeler ve farmakokinetik benzeri profiller12 dahil olmak üzere geçici çözünen konsantrasyon sinyallerine maruz bırakan deneylere izin vermek için ek pompalar ve parçalardan yararlanan iki yararlı varyant da Şekil 1'de gösterilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig01.jpg"> Resim 1: Perfüzyon sistemi tasarımı üzerinde üç varyasyon . (Top) Temel perfüzyon sistemi. (Orta) Birden fazla orta kaynak için bir stopcock ile perfüzyon sistemi. (Altta) İyi karıştırılmış bir dağılım hacmini taklit etmek için karıştırılmış bir tanka sahip perfüzyon sistemi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Akış içindeki dağılım ve difüzyon nedeniyle, çözünen sinyaller akış sisteminden geçerken bozulur veya "bulaşır". Bu bozulma, ikamet süresi dağılımları (RTD'ler) kullanılarak ölçülebilir13. Bu makalede, perfüzyon sisteminin bileşenleri üzerinde izleyici deneylerinin nasıl gerçekleştirileceği açıklanmaktadır (Şekil 2) ve ölçülen verilerden RTD'ler oluşturmak için MATLAB komut dosyaları sağlanmaktadır. Bu analizin ayrıntılı bir açıklaması, yazarların önceki makalesi11'de bulunabilir. Ek MATLAB komut dosyaları, RTD'lere uygun işlevler sığdırır ve fiziksel parametreleri çıkarır ve kullanıcı tarafından çözünen sinyal girişinin perfüzyon sistemi14 aracılığıyla nasıl yayılacağını ve bozulacağını tahmin etmek için RTD'leri kullanarak sinyal evrişimi gerçekleştirir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig02.jpg"> Şekil 2: İkamet süresi dağılımları. Bu boru uzunluğu gibi akış sistemi bileşenlerinin RTD'leri, sisteme bir izleyici darbesi girerek ve toplanan fraksiyonlara çıktığı zamana kadar nasıl "bulaştığını" ölçerek ölçülür. Bu rakam Erickson ve ark.11'den değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>18 Gauge 1 1/2- inç Şırıngalar ve Dağıtım Makineleri ile Kullanım İçin Tek Kullanımlık Prob İğnesi</td><td>Grainger</td><td>5FVK2</td><td></td></tr><tr><td>293T Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>HEK 293T hücreleri Temsili Sonuçlar deneyinde kullanılmıştır.</td></tr><tr><td>96 Kuyulu Şeffaf Alt Plakalar, Corning</td><td>VWR</td><td>89091-010</td><td>RTD deneylerinde boya konsantrasyonlarını ölçmek için plakalar ve temsili sonuçlar deneyinde GLuc</td></tr>.<tr><td>BD&nbsp; Luer-Lok Uçlu Tek Kullanımlık Şırıngalar, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td></td></tr><tr><td>BioFrac Fraksiyon Toplayıcı&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7410002</td><td>Tek bir akış için kullanılabilen veya birden fazla akıştan toplamayı sağlamak için yöntemimiz kullanılarak değiştirilebilen Fraksiyon toplayıcı.</td></tr><tr><td>Şeffaf Yüksek Mukavemetli UV Dayanımlı Akrilik 12" x 12" x 1/8"</td><td>McMaster-Carr</td><td>4615T93</td><td>Bu tabaka, BioFrac fraksiyon toplayıcısına takılabilen çok kafalı dağıtıcıyı üretmek için ek malzemelerdeki DXF dosyasına göre bir lazer kesici kullanılarak kesilir.</td></tr><tr><td>Temsili sonuçlarda Gaussia lusiferaz biyolüminesans testinde kullanılan</td> <td>Coelenterazine doğal</td><td>NanoLight Teknolojisi</td><td>303</td> Substratı.</tr><tr><td>Corning Costar TC ile İşlenmiş Çoklu Kuyu Plakaları, boyut 48&nbsp; kuyular, polistiren plaka, düz tabanlı kuyular</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3548</td><td>Temsili sonuçlarda 293T hücrelerini büyütmek ve perfüze etmek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Costar Düz Tabanlı Hücre Kültürü Plakaları, boyut 12 kuyu</td><td>Fisher Scientific</td><td>720081</td><td>Perfüzyonda farmakokinetik profiller üretmek için tıkalı ve karıştırılmış bir tank olarak kullanılabilir. Perfüzyon için hücreler de içerebilir.</td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikozlu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>Epilog Zing 24 Lazer</td><td>Kesim Kenar Sistemleri</td><td>Epilog Zing 24</td><td>Akrilik levhadan çok kafalı dağıtıcı üretmek için kullanılan lazer kesici. Diğer lazer kesiciler kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Fisherbrand Tek Kullanımlık Steril Şırıngalar, Luer-Lock, 20 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-460</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tek Kullanımlık Steril Şırıngalar, Luer-Lock, 60 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-461</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Mikrosantrifüj Tüpleri: 1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>Fraksiyonları toplamak için mikrosantrifüj tüpleri.</td></tr><tr><td>Balıkçı markası&nbsp; Düz Uçlu Yuvarlak Alt Tek Kullanımlık Borosilikat Cam Tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-26</td><td>Fraksiyonları toplamak için cam tüpler.</td></tr><tr><td>Balıkçı markası&nbsp; SureOne Micropoint Pipet Uçları, Evrensel Uyum, Filtresiz</td><td>Fisher Scientific</td><td>2707410</td><td>Dağıtım ucu görevi görecek şekilde çok kafalı dağıtıcıya ve boruya en iyi uyan 300 ul pipet ucu</td></tr>.<tr><td>Gibco&nbsp; DPBS, toz, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>Fisher Scientific</td><td>21600010</td><td>Fosfat tamponlu tuzlu su.</td></tr><tr><td>Labline 4625 Titre Çalkalayıcı</td><td>Marshall Scientific</td><td>Labline 4625 Titre Çalkalayıcı</td><td>Karıştırılmış tankları karıştırmak için kullanılan orbital çalkalayıcı.</td></tr><tr><td>Masterflex Bağlantı Elemanı, Polikarbonat, Dört Musluk, Erkek Luer Kilidi, Steril Olmayan; 10/PK</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-30600-04</td><td>RTD deneyleri ve hücre kültürü deneyleri için çoklu giriş akışlarını birleştirmek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Masterflex Bağlantı Elemanı, Polikarbonat, Düz, Dişi Luer x Kapak; 25/PK</td><td>Masterflex</td><td>UX-45501-28</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Bağlantı Elemanı, Polipropilen, Düz, Dişi Luer - Hosebarb Adaptörleri, 1/16"</td> <td>Cole-Parmer</td><td>EW-45508-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Bağlantı Elemanı, Polipropilen, Düz, Erkek Luer Kilidinden Hortum Çubuğu Adaptörüne, 1/16" ID</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45518-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Bağlantı Elemanı, Polipropilen, Düz, Erkek Luer Kilidi - Fiş Adaptörü; 25/PK</td><td>Masterflex</td><td>EW-30800-30</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Hassas Pompa Hortumu, Platinle Kürlenmiş Silikon, L/S 14; 25 ft</td><td>Masterflex</td><td>EW-96410-14</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2019b</td><td>Sürüm R2019b. Daha yeni sürümler de kullanılabilir. Bazı eski sürümler çalışabilir.</td></tr><tr><td>NE-1600 Altı Kanallı Programlanabilir Şırınga Pompası</td><td>Yeni Dönem Pompa Sistemleri</td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Raf Seti F1</td><td>Bio-Rad</td><td>7410010</td><td>Fraksiyon toplayıcıda toplama tüplerini tutmak için raflar.</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan TNF-alfa (HEK293 eksprese edilmiş) Proteini, CF</td><td>Bio-Techne</td><td>10291-TA-020</td><td>Sitokin, temsili sonuçlarda 293T hücrelerini uyarmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Saint Gobain Katı Tıpalar, Versilic Silikon, Boyut: 00, Alt 10.5mm</td><td>Saint Gobain</td><td>DX263015-50</td><td>48 oyuklu plakalara uyar.</td></tr><tr><td>Saint Gobain Katı Tıpalar, Versilic Silikon, Boyut: 4 Alt 21mm</td><td>Saint Gobain</td><td>DX263027-10</td><td>12 oyuklu plakalara uyar.</td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit, 10.0 N Sulu Çözelti APHA; 1 L</td><td>Spektrum Kimyasalları</td><td>S-395-1LT</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>Dassault Sistemleri</td><td>Çok kafalı dağıtıcı DXF dosyasını oluşturmak için kullanılan</td> <td>SolidWorks</td> CAD yazılımı.</tr><tr><td>Varioskan LUX çok modlu mikroplaka okuyucu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VL0000D0</td><td>Plaka okuyucu.</td></tr><tr><td>Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue</td><td>Michaels</td><td>10404779</td><td>RTD deneylerinde izleyici olarak kullanılan Brilliant Blue FCF (Parlak mavi) içeren mavi gıda boyası. Absorbans spektrumu 628 nm'de zirve yapar.</td></tr></tbody></table>

dinamik hücre kültürü için Çıkış fraksiyonasyonu ile entegre Çok akışlı perfüzyon biyoreaktörü

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Bazı hücre ve doku fonksiyonları, geleneksel kültür sistemleri tarafından zayıf bir şekilde çözülen dakikalar ila saatler arasındaki dinamik zaman ölçeği içinde çalışır. Bu çalışma, kültür ortamının sürekli olarak bir hücre kültürü modülüne perfüze edilmesini ve bu ölçekteki dinamikleri ölçmek için bir aşağı akış modülünde fraksiyone edilmesini sağlayan düşük maliyetli bir perfüzyon biyoreaktör sistemi geliştirmiştir. Sistem neredeyse tamamen ticari olarak temin edilebilen parçalardan inşa edilmiştir ve aynı anda geleneksel çok kuyulu hücre kültürü plakalarında bağımsız deneyler yapmak için paralelleştirilebilir. Bu video makalesinde, yalnızca tek bir çok kanallı şırınga pompası ve paralel olarak altı kültüre kadar perfüze etmek için modifiye edilmiş bir fraksiyon kolektörü gerektiren taban kurulumunun nasıl monte edileceği gösterilmektedir. Modüler tasarımdaki yararlı varyantlar, çözünen darbeler veya farmakokinetik benzeri profiller gibi kontrollü stimülasyon dinamiklerine izin veren de sunulmaktadır. Daha da önemlisi, çözünen sinyaller sistemden geçerken, çözünmüş dağılım nedeniyle bozulurlar. Ayrıca, perfüzyon kurulumunun bileşenlerinin ikamet süresi dağılımlarını (RTD'ler) MATLAB kullanarak bir izleyici ile ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. RTD'ler, çözünen sinyallerin çok bölmeli sistemdeki akış tarafından nasıl bozulduğunu hesaplamak için kullanışlıdır. Bu sistem son derece sağlam ve tekrarlanabilir, bu nedenle temel araştırmacılar özel üretim tesislerine ihtiyaç duymadan kolayca benimseyebilirler.

Protokolün 5. bölümünden çoklu ortam kaynaklarına sahip perfüzyon sistemi, tümör nekroz faktörü alfasının (TNF-α) 1.5 saatlik nabzına yanıt olarak, insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücrelerinde aktive edilmiş B hücrelerinin (NF-κB) transkripsiyon faktörünün nükleer faktör kappa-hafif zincir-arttırıcısı tarafından yönlendirilen bir muhabir genin ekspresyon dinamiklerini ölçmek için kullanıldı. HEK293 hücreleri, dönüştürülmüş hücreleri izole etmek için floresan ile aktive edilmiş hücreler sıralama (FACS) yoluyla</e...

Bu yazıda, hücresel proseslerde çözünenlerin sekresyon dinamiklerini ve absorpsiyon oranlarını ölçmek için düşük maliyetli, çok kanallı bir perfüzyon hücre kültürü sistemi kurmak ve çalıştırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Sistem ayrıca hücreleri dinamik uyaran profillerine maruz bırakabilir.

Dinamik Hücre Kültürü için Çıkış Fraksiyonasyonu ile Entegre Çok Akışlı Perfüzyon Biyoreaktörü

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

Bu yöntem, sekresyon oranlarının zamanla nasıl değiştiğini ve hücrelerin zamanla değişen katı sinyallere nasıl tepki verdiğini anlamaya yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajları, düşük maliyetinin, çok az eğitim gerektirmesi ve bolluk sistemi kurulumunun yeni deneyler için uyarlanabilmesidir. Bir şırıngayı bir arka plan çözeltisiyle doldurarak başlayın ve ilk şırınga pompasına yükleyin.Başka bir şırıngayı izleyici çözeltisiyle doldurun ve ikinci şırınga pompasına yükleyin. Her iki şırıngayı da luer konektörlerini kullanarak dört yönlü bir stopcock'un üç bağlantı noktasından ikisine bağlayın. Stopcock'u arka plan çözeltisine kapatın ve izleyici solüsyonunu açık porttan damlayana kadar stopcock'a pompalayın.Pompayı durdurun ve şırıngayı daha fazla ayarlamayın. Şırınga pompalarının hareket çubuğunun şırınga pistonlarına doğru itildiğinden emin olun, böylece pompa başlatıldığında akış hemen başlar. Durdurucuyu izleyici çözeltisine kapatın ve tüm artık izleyici çözeltisi açık bağlantı noktasından temizlenene kadar arka plan solüsyonunu stopcock'a pompalayın.Pompayı durdurun ve şırıngayı daha fazla ayarlamayın. RTD analizi için istenen akış sistemi bileşenini ayarlayın. Ucu bir pipet ucu dağıtıcısına yerleştirin ve arka plan solüsyonunu tamamen dolana kadar bileşenden pompalayın.İzleyici çözeltisi için pompayı istenen akış hızına ayarlayın. Stopcock'u arka plan çözümüne kapatın ve izleyici çözümünün akışını başlatın. Aynı zamanda, kesir toplayıcıyı başlatın.İzleyicinin impuls girişine yaklaşmak için izleyici çözeltisinin akışına kısa bir süre devam edin. RTD'ler için saatte bir mililitre akış hızında 10 dakikalık bir nabız süresi önerilir. İzleyici çözeltisi darbe periyodunun sonunda izleyici çözeltisi pompasını durdurun.Durdurmayı hızlı bir şekilde izleyici çözeltisine kapatın ve arka plan çözeltisinin akışını aynı akış hızında başlatın. Arka plan çözeltisinin, izleyicinin tümü sistemden ve toplanan fraksiyonlara geçene kadar fraksiyonları akmasına ve toplamasına izin verin. Steril koşullar altında, iğneli tıpaları, iğneler yukarı çekilmiş olarak kuyu plakası kültürlerine yerleştirin.Durdurucu yerleştirildikten sonra, çıkış iğnesinin yüksekliği kararlı sıvı seviyesini belirlediğinden, iğneleri perfüzyon için istenen yüksekliğe indirin. İğneleri erkek luer kapaklarıyla kapatın ve tüm kuyu plakasını kullanıma kadar 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatörde tutun. Perfüzyon için kullanılacak iki ortamı hazırlayın, ilk önce dağıtılacak ortamı bir ve diğer ortam iki olarak etiketleyin.Perfüze edilecek her kültür için, bir şırıngayı orta bir taneyle doldurun ve dispansyonunun tüm süresi boyunca artı başlangıçta perfüzyon sistemini doldurmak için yeterli hacimle doldurun. Sökülmesinin tüm süresi boyunca dayanması için ikinci bir şırıngayı orta iki ile doldurun. Her iki şırıngayı da dört yönlü bir stopcock'un üç portundan ikisine bağlayın.Şırıngaları stopcocklara bağlamak için bir boru uzunluğu gerekebilir. Stopcock'u orta bir için kapatarak ve açık porttan damlamaya başlayana kadar orta ikiyi stopcock'a dağıtarak stopcock'ları hazırlayın. Ardından, orta iki için stopcock'u kapatın ve kalan tüm orta iki açık porttan temizlenene kadar orta olanı stopcock'a dağıtın.Dişi - dikenli luer konektörü kullanarak yukarı akış borusunu açık stopcock portuna takın. Tüpün diğer ucuna bir erkek - diken luer konektörü yerleştirin. Yukarı akış tüpü orta ile doldurulana kadar şırıngadan bir ortam dağıtın ve daha önce gösterildiği gibi aşağı akış borusunun hazırlanmasına devam edin.Aşağı akış borusunun bir ucuna bir erkek - diken luer konektörü yerleştirin ve dişi bir luer kapağı ile kapatın. Hazırlanan tüm boruları, şırıngaları ve kuyu plakasını perfüzyon için kullanılacak inkübatöre dikkatlice getirin. Şırınga pompasını ve fraksiyon toplayıcıyı inkübatörün yakınında istenen yerlere yerleştirin.Şırınga pompasını inkübatörün üstüne veya yanına yerleştirin ve fraksiyon toplayıcıyı inkübatörün yanına portun yanına yerleştirin. Şırıngaları pompaya yükleyin. Tüm yukarı ve aşağı akış tüplerinin kapaklı uçlarını bir araya getirin ve bunları inkübatörün dışından liman üzerinden içeriye doğru itin.Çıkış yönündeki tüplerin açık uçlarını, fraksiyon toplayıcının çok kafalı dağıtıcısının dağıtım pipet uçlarına yerleştirin. İnkübatörün içinde, akan ortamın ısı ve karbondioksit alabileceği boru uzunluğunu en üst düzeye çıkarmak için inkübatöre yukarı akış tüplerinin mümkün olduğunca gevşekliğini çekin. Takılan her kuyu için, iğneleri ve bu kuyu için yukarı ve aşağı akış tüplerini hızlı bir şekilde açın, ardından bunları luer konektörleriyle birbirine takın.Tüm parçalar bağlandıktan sonra, tüm akışların düzgün bir şekilde aktığından emin olmak için şırınga pompasını nispeten yüksek bir hızda kısaca çalıştırın. Bu noktada, deneye ortamla dolu aşağı akış tüpleri ile başlamak istenirse, hepsi dolana kadar pompayı çalıştırmaya devam edin, aksi takdirde pompayı durdurun. Şırınga pompası akış hızını orta ve fraksiyon toplama sıklığı için ayarlayın ve deneye başlamak için her iki makineyi aynı anda başlatın.Orta kaynağın değiştirilmesi gerektiğinde, şırınga pompasını orta kaynak için hızlı bir şekilde durdurun. Stopcock'u orta seviyeye kapatın ve şırınga pompasını orta iki için çalıştırın. Daha sonra isterseniz, kaynağı benzer şekilde orta seviyeye geri döndürün.İstenilen deneme süresi boyunca kesirleri toplayın. İki RTD deneyinden elde edilen fraksiyonlardaki izleyici konsantrasyonları ölçüldü ve iki RTD'yi üretmek için veri MATLAB komut dosyasından RTD'ye girdi. Tek tüpler ve seri halinde birden fazla boru parçası, tek bir eksenel dağılım modeli ile iyi uyum sağladı ve aynı doğrultuda perfüze edilmiş bir 48 kuyu plakası eklenmesi, hem bir metre tüp RTD'nin hem de tüm sistemin RTD'sinin eksenel dağılım fonksiyonlarına uymasına izin veren ihmal edilebilir sapmaya neden oldu.Bir metre tüp RTD verilerine takılan eksenel dağılım modeli kullanılarak zayıf bir model uyumu örneği gösterildi ve verilerle birlikte çizildi. İlk parametre tahminleri, tau'nun hacimsel akış hızına bölünen perfüzyon sistemi hacmine yaklaşık olarak eşit olduğu iyi bir model uyumu üretmek için değiştirildi. 90 dakikalık bir TNF-alfa darbesi, sisteme giriş sinyali olarak tanımlandı ve kuyu plakası girişindeki TNF-alfa sinyalini belirlemek için bir metrelik boru RTD ile birleştirildi.Giriş sinyali, toplanan fraksiyonlarda sistemin çıkışındaki TNF-alfa sinyalini belirlemek için tüm sistemin RTD'si ile de birleştirildi. HEK 293 hücreleri, NF-kappaB yanıt elemanını içeren bir promotör tarafından tahrik edilen GLuc'u salgılamak üzere tasarlanmıştır. Deney, TNF-alfa maruziyetini takiben NF-kappaB tarafından yönlendirilen GLuc ekspresyonunda önemli bir ekspresyon artışı ve yavaş bir azalma olduğunu ortaya koydu.Sistemin varyasyonları, sinyallerin girilmesini gerektirmeyen ve hücreleri farmasötik-hu bağlayıcı çözünen profillere maruz bırakan deneyler için daha basit bir kurulum da dahil olmak üzere beraberindeki makalede açıklanmaktadır.

multi-stream-perfusion-bioreactor-integrated-with-outlet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz, mikro-biyoreaktörler hücrelerin üç boyutlu ekimi için çip tabanlı platform açıklar. Bir çip 10 milyon kadar ev. steril, kapalı bir dolaşım döngü içinde sıvı akışı, oksijen basıncı vb ilişkin kesin olarak tanımlanmış koşullar altında yetiştirilen hücreler.

Perfüze Mikro-biyoreaktörler Chip tabanlı üç boyutlu Hücre Kültürü

Steril bir sürekli akış devresi, laminer akış kayma gerilmesi tabi yapışık hücrelere için bir yöntem tarif. Hücrelerin yapışma, morfoloji, şeffaf oda ile devre metaboliti analizi ve gelecek deneyler ya da kültür için kayma maruz kaldıktan sonra hasat hücreleri için alınan numuneler incelenmiştir olabilir.

Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre

Biz mikro ölçekli hücre stimülasyonu deneyler için otomatik bir hücre kültürü ve sorgulama platformu geliştirdik. Platform yetiştirilmesi ve hücrelerin küçük nüfus uyarıcı ve moleküler analizler için lizatları kurtarma, basit, çok yönlü ve hassas kontrol sağlar. Platform de değerli hücreleri ve / veya reaktif kullanmak çalışmalar için uygundur.

Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Burada, birincil hücreleri, doku modellerini ve punch biyopsilerini 28 güne kadar mikroakışkan çok organlı bir çipte kokültür yapmak için bir protokol sunuyoruz. İnsan dermal mikrovasküler endotel hücreleri, karaciğer agregatları ve deri biyopsileri ortak bir besiyeri dolaşımında başarılı bir şekilde birleştirildi.

Çok organ Chip - Uzun vadeli Çok doku kokültürü için mikroakışkan Platformu

Detaylı bir protokol 48 paralel hücre kültürlerinde bir microbioreactor sisteminde çeşitli koşullar altında eşzamanlı işlem için sunulmaktadır. Hücre kültür süreci, hasat ve sonraki antikor titresi analiz anlatılmıştır.

Yüksek üretilen iş kullanımı otomatik Microbioreactor sistemi modeli Igg1 CHO hücrelerdeki imalatı için

PdMS tabanlı, çok katmanlı, mikroakışkan bir cihazın in vitro transkripsiyon ve çeviri (IVTT) reaksiyonlarının uzun süreler boyunca gerçekleştirilmesine olanak sağlayan üretim süreci anlatılmaktadır. Ayrıca, bu reaksiyonları uzun süre ler boyunca otomatikleştirmek ve korumak için gereken donanım ve yazılıma kapsamlı bir genel bakış sağlanır.

Uzun Süreli Hücresiz Gen Ekspresyonunun İletimi için Çok Katmanlı Mikroakışkan Platform

Bu protokol, hasta kaynaklı ksenogreftlerin (PDX) genişletilmiş in vitro kültürünü mümkün kılacak yöntemleri göstermektedir. Bir adım, 3D hidrojellerde çok hücreli küme kültürlerinin genel canlılığını, canlı olmayan tek hücrelerin doğrudan çıkarılması yoluyla artırır. İkincibir adım, pdx kültürü için en iyi uygulamaları perfüzyonlu mikroakışkan bir platformda gösterir.

Perfüzyonlu Mikroakışkan Platformda Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Ex vivo 3D Hidrojel Kültürleri için Geliştirilmiş Canlılık

Protokol, özelleştirilmiş bir perfüzyon biyoreaktöründe flep vaskülatürü boyunca sodyum dodesil sülfat deterjanının perfüzyonu ile vaskülarize domuz fleplerinin cerrahi tedarikini ve ardından desellülarizasyonunu açıklamaktadır.

Özelleştirilmiş Perfüzyon Biyoreaktöründe Domuz Vaskülarize Fleplerinin Tedariği ve Perfüzyon-Desellülarizasyonu

Bu protokol, perfüzyonda kan damarlarının ex vivo kültürü için yeni geliştirilen, 3D baskılı bir biyoreaktörün kurulumunu ve çalıştırılmasını sunar. Sistem, diğer kullanıcılar tarafından kolayca benimsenebilecek, pratik, uygun fiyatlı ve temel biyoloji ve farmakolojik çalışmalar gibi farklı deneysel uygulamalara uyarlanabilir şekilde tasarlanmıştır.

Ex Vivo (Canlı Canlı) 3D Baskılı Biyoreaktörde Büyük Kan Damarlarının Perfüzyon Kültürü

Hücre dışı veziküller biyomedikal uygulamalar için büyük umut vaat etmektedir, ancak mevcut izolasyon yöntemleri zaman alıcıdır ve klinik kullanım için pratik değildir. Bu çalışmada, hücre dışı veziküllerin büyük hacimli biyoakışkanlardan minimum adımlarla sürekli bir şekilde doğrudan izolasyonunu sağlayan bir mikroakışkan cihaz sunuyoruz.

Çatallı A4F Mikroakışkan Cihaz ile Büyük Hacimli Örneklerden Hücre Dışı Veziküllerin Tek Adımlı İzolasyonu

Öğrenin, düşük maliyetli çok kanallı perfüzyon biyoreaktörü ile hücre kültüründe salgılanma ve emilim dinamiklerini nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, dinamik uyaran profilleri altında hücresel süreçleri incelemek için değerli bir araçtır.

Dinamik Hücre Kültürü için Çıkış Fraksiyonasyonu ile Entegre Çok Akışlı Perfüzyon Biyoreaktörü

Daha fazla video keşfet