Name: Lentiviral Aracılı shRNAların Düşük Maliyetli Katyonik Polimer Polietilenimin (PEI) Kullanılarak hESClere ve NPClere Verilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Öğrenin, düşük maliyetli polietilenim (PEI) kullanarak lentiviral partiküller üretin ve bu yöntemle hESC'lerden türetilmiş nöral progenitör hücrelere (NPC'ler) shRNA teslimatını gerçekleştirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Birleşik Arap Emirlikleri Üniversitesi'nden (BAEÜ), hibe # 31R170 (Zayed Sağlık Bilimleri Merkezi) ve # 12R010'dan (UAEU-AUA hibesi) araştırma hibeleri ile desteklenmiştir. Prof. Randall Morse'a (Wadsworth Center, Albany, NY) makaleyi stil ve dilbilgisi açısından düzenlememize yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.
Tüm veriler talep üzerine temin edilebilir.

1. HEK293T hücrelerinin PEI veya Lipofectamine 3000 reaktifi kullanılarak transfeksiyonu
<ol><li>DMEM'deki kültür HEK293T hücreleri +% 10 FBS + 1x penisilin / streptomisin, transfeksiyon için tohumlamadan önce% 90 akıcıya kadar% 5 CO2 ve% 21O2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de. Yüksek titreli virüs üretimi için nispeten düşük bir geçiş hücresi sayısı kullanın (ideal olarak P30'dan daha az).</li>
	<li>100 mm'lik bir doku kültürü plakasında 10 mL'lik tam büyüme ortamında tohum 4 x 106 hücre ve % 5 CO 2 ve%21 O 2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe gece boyunca büyür.
</li>
	<li>Her transfeksiyon için, plazmid DNA'sını (1 mg/mL stoklar) 1,5 mL santrifüj tüplerinde 1 mL serum içermeyen DMEM ortamında aşağıdaki giriş ve ambalaj plazmid oranını kullanarak seyreltin: Giriş vektörü = 10 μg psPAX2.0 = 7.5 μg pMD2.G = 5 μg</li>
	<li>10 s vorteks ve toplamak için oda sıcaklığında 30 s için tüpü 10.000 x g'da döndürün.</li>
	<li>Tüpe 70 μL (1 mg / mL stok çözeltisi) PEI ekleyin ve toplamak için yukarıda açıklandığı gibi vorteks ve spin yapın. Kullanılan PEI hacmi, toplam DNA (μg):P EI (μg)'nin 1: 3 oranına dayanmaktadır.</li>
	<li>Lipofektamin bazlı transfeksiyon için, yukarıdaki vektörleri, kitte verilen 45 μL reaktif P içeren 500 μL serumsuz DMEM ortamında seyreltin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.</li>
	<li>Kitte verilen 70 μL reaktif L'yi 500 μL serumsuz DMEM ortamı kullanarak seyreltin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Her iki tüpün içeriğini birleştirin ve karmaşık formasyona izin vermek için tüpleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri içeren plakaya damla damla 1 mL DNA / PEI veya 1 mL DNA / lipofectamin kompleksleri ekleyin ve% 5 CO 2 ve%21 O 2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de 6 saat boyunca inkübe edin.
</li>
	<li>6 saat sonra, taze tam büyüme ortamına (10 mL) geçin ve hücreleri% 5 CO 2 ve%21 O 2 atmosferi ile nemlendirilmiş inkübatöre geri döndürün.
</li>
</ol>2. LVS toplama ve ultrasantrifüjleme
<ol><li>Transfeksiyondan 2 gün sonra, virüs içeren ortamı toplayın ve hücreleri tekrar 10 mL taze tam büyüme ortamı ile kaplayın.</li>
	<li>Transfeksiyondan 3 gün sonra, virüs içeren medyayı toplayın ve 2 günlük zaman noktasında toplanan virüs içeren medya ile birleştirin.</li>
	<li>Viral süpernatantı 2.000 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca hücresel kalıntıları pelet etmek için santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatantı 0,45 μm gözenek boyutunda düşük protein bağlayıcı filtre (PES veya SFCA) kullanarak filtreleyin ve ultrasantrifüjlemeye hazır olana kadar 4 °C'de saklayın. Lentiviral parçacıklar içeren filtrelenmiş süpernatant, viral titrelerde önemli bir kayıp olmadan 5 gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir.</li>
	<li>Bardakları tutan ultrasantrifüj tüplerini 10 dakika boyunca% 70 etanol ile yıkayarak sterilize edin, hava kurutun, kapatın ve 4 ° C'de tutun.</li>
	<li>Steril bir ultrasantrifüj tüpüne lentiviral parçacıklar içeren 36 mL filtrelenmiş ortam ekleyin.</li>
	<li>5 mL'lik steril bir stripeti 4 mL steril% 20 sakkaroz çözeltisi (PBS'de hazırlanmış) ile doldurun ve LVS içeren ultrasantrifüj tüpünün (UC) dibine doğru dağıtın. Sakkaroz çözeltisinin medya ile karıştırılmaması ve tüpün dibinde bir gradyan yapması önemlidir.</li>
	<li>Serumsuz DMEM ortamını kullanarak tüm ultrasantrifüj tüplerini dengeleyin, soğuk ultrasantrifüj tüp tutma kaplarına yerleştirin ve kapakları kapatın.</li>
	<li>Tüpleri 4 °C'de 2 saat boyunca 125.000 x g'de döndürün.</li>
	<li>Spinden sonra, peleti rahatsız etmeden tüpün içeriğini çamaşır suyu içeren bir kapta ters çevirerek süpernatantı dikkatlice atın. Görünürse peleti işaretleyin.</li>
	<li>Ultra santrifüj tüpünü 50 mL'lik steril bir tüpe yerleştirin ve peletin tam üstüne 200 μL steril DPBS ekleyin. Gece boyunca bozulmadan 4 ° C'de tutun.</li>
	<li>Ertesi gün, 40x yukarı ve aşağı pipetle çekerek yavaşça karıştırın.</li>
	<li>Herhangi bir enkazı peletlemek için bir masa üstü santrifüjünde kısaca 13.000 x g'de döndürün.</li>
	<li>Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve virüs preparatını 20 μL alikot olarak alikot edin. −80 °C'de saklayın.</li>
	<li>Viral titre ölçümleri için preparatın 5 μL'sini bir kenara koyun.</li>
</ol>3. pLKO.1 tabanlı vektörler için LVS titre ölçümü
<ol><li>Üreticinin tavsiyelerini izleyerek bir qPCR kullanarak lentiviral parçacıkların titresini belirleyin.</li>
	<li>Standart bir eğri için, her adımda 5 μL DNA'yı 45 μL nükleaz içermeyenH2O'ya seyrelterek Standart Kontrol DNA'sının (kit içinde sağlanan) beş adet 10 katlı seri seyreltmesini hazırlayın. Standart bir eğri oluşturmak için 1:100 ila 1:100.000 arasındaki seyreltmeleri kullanın.</li>
	<li>Buz üzerindeki reaksiyonları aşağıdaki şekilde kopyalar halinde ayarlayın: 2x qPCR ana karışımı 10 μL Astar karışımı 2 μL Örnek veya standart DNA 2 μL Nükleaz içermeyen H2O 6 μL</li>
	<li>Kitin kılavuzunda belirtilen bisiklet koşullarını kullanarak toplam 35 döngü için qPCR gerçekleştirin.</li>
	<li>Y eksenindeki döngü eşiği (Ct) değerleri ile X eksenindeki virüs titresi değerlerini çizin.</li>
	<li>Bir eğilim çizgisi denklemi kullanarak bilinmeyen virüs numune titresini belirlemek için dört standart kontrol DNA seyreltmesi (1:100 ila 1:100.000) kullanarak logaritmik bir regresyon oluşturun.</li>
</ol>4. pll3.7 tabanlı vektörler için LVS titre ölçümü
<ol><li>Tohum 1 x 105 HEK293T hücreleri, enfeksiyonlardan 24 saat önce 1 mL tam büyüme ortamında bir P12 kuyucuk plakasının her bir kuyucuğunda.</li>
	<li>Ortamı 8 μg / mL polibren ile destekleyin ve her steril 1,5 mL tüpe 1 mL ekleyin.</li>
	<li>1 mL polibren içeren ortamın her birinde 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0.5 μL ve 0.1 μL konsantre lentiviral partiküller kullanarak viral parçacıkları seyreltin.</li>
	<li>HEK293T hücrelerinden gelen ortamı, 8 μg / mL polibren ile birlikte belirtilen miktarda lentiviral partikül içeren ortamla değiştirin ve% 5 CO 2 ve% 21O2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de24 saat boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, taze medyaya geçin ve kültürü% 5 CO 2 ve% 21O 2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de 72 saat boyunca devam edin.</li>
	<li>72 saat sonra, hücreleri PBS ile yıkayın, üreticinin protokolüne göre 37 ° C'de tripsinize edin ve 1 mL PBS'de yeniden askıya alın.</li>
	<li>Üreticinin önerilerini izleyerek bir hücre sıralayıcı kullanarak FACS hücre sıralama gerçekleştirin. Enfekte olmayan HEK293T hücrelerini kullanarak kapıyı% 0 GFP pozitif hücrelere ayarlayın ve her viral seyreltme için pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek üzere her örnek için 50.000 olay sayın.</li>
	<li>Lentiviral parçacıkların titresini hesaplamak için sadece% 2-20 aralığında% GFP pozitif hücreler veren lentiviral parçacıkların hacimlerini kullanın.</li>
</ol>5. hESC'lerin enfeksiyonu ve stabil seçim
<ol><li>Hücreleri, 6 delikli hücre kültürü çok kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğunda büyüyen 2 mL PBS ile yıkayın.</li>
	<li>1 mL 1x hücre ayrışma reaktifi kullanarak hücreleri hücre kültürü plakasından 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübasyonla ayırın.</li>
	<li>DMEM / F12 ortamındaki hücreleri toplayın ve hücre peletini toplamak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj yapın.</li>
	<li>Aspirat, hücreleri 1 mL'de yeniden askıya alın ve bir hemositometre kullanarak sayın.</li>
	<li>10 ng / mL bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF), penisilin / streptomisin (P / S) ve 10 μM ROCK İnhibitörü (RI) ile desteklenmiş mTeSR1 içeren 2 x 105 hücre / mL tam büyüme ortamı içeren bir hücre süspansiyonu yapın.</li>
	<li>Tohum 1 x 105 hücreler üzerinde 50x seyreltilmiş komple bazal membran matris kaplı P24-kuyucuk plakaları üzerinde 500 μL komple büyüme ortamı ve kültüründe hücreleri 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde %5 CO 2 ve %21 O 2 atmosferine sahip bir inkübatörde kültürleyin.
</li>
	<li>Ertesi gün, hESC'leri 8 μg / mL polibren ile 10 enfeksiyon çokluğunda (MOI) enfekte edin ve 8 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>8 saat sonra, virüs içeren ortamı taze büyüme ortamı (-RI) ile değiştirin ve hücreler% 90 birleşene kadar kültüre devam edin.</li>
	<li>Püromisin seçimine (0.8 μg / mL) hücreler% 90 akıcılığa ulaştığında başlayın, bu genellikle enfeksiyondan 48-72 saat sonradır.</li>
	<li>Seçim tamamlandıktan sonra (genellikle 4-6 gün), kararlı hücreleri bölün (1: 4) ve kriyoprezervasyon ve daha fazla analiz için hücreleri genişletin.</li>
</ol>6. H9 türevi nöral progenitör hücrelerin (NPC'ler) transdüksiyonu
NOT: NPC'ler, daha önce açıklandığı gibi bir dual-Smad inhibisyon protokolü kullanılarak H9 hücrelerinden türetilmiştir19.
<ol><li>Kısaca, H9 hücrelerini, tek hücreler üretmek için 37 ° C'de hücre ayrışma reaktifi ile 5 dakika boyunca tedavi edin ve 10 ng / mL bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF), penisilin / streptomisin (P / S) ve 10 μM ROCK İnhibitörü (RI) ile desteklenmiş mTeSR1 içeren tam büyüme ortamında resüspend. 1:50 üzerinde tohum seyreltilmiş Matrigel kaplı 6 kuyucuklu hücre kültürü tabakları 60.000 hücre /cm2 yoğunluğunda (gün 0).</li>
	<li>LDN193189 (200 nM) ve SB431542 (10 μM) (gün1) içeren %100 KSR ortamına geçerek hücreler %95-%100 akıcılığa ulaştığında farklılaşmayı başlatın.</li>
	<li>2. günde, LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) ve XAV939 (5 μM) ile desteklenen %100 KSR ile ortamı tekrar değiştirin.</li>
	<li>Farklılaşmanın 4. gününde, LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) ve XAV939 (5 μM) ile KSR ortamı (%75) ve N2 ortamı (%25) karışımına geçin.</li>
	<li>6. günden 12. güne kadar, N2 ortamını her gün %25 artırarak ve her 2 günde bir medyayı değiştirerek LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) ve XAV939 (5 μM) ile desteklenmiş ortamları kademeli olarak %100 N2'ye geçirin.</li>
	<li>Kültür günü N2: B27 ortamındaki NPC'ler 20 ng / mL bFGF ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Tohum 2 x 105 hücrenin her bir kuyucuğunda 1:50 seyreltilmiş komple bazal membran matris kaplı P6 plakası içinde 2 mL NPC kültür ortamı ve hücrelerin bağlanmasını sağlamak için inkübe edilir.</li>
	<li>Ertesi gün, hücreleri 8 μg / mL polibren varlığında bir MOI 6'da lentiviral parçacıklarla enfekte edin.</li>
	<li>8 saat sonra, virüs içeren ortamı taze NPC büyüme ortamıyla değiştirin.</li>
	<li>Ertesi gün, enfeksiyonları tekrarlayın ve medyayı 8 saatte değiştirin.</li>
	<li>Daha fazla analiz için hasat etmeden önce hücreleri 72 saat kültürde tutun.</li>
</ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+Somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).</li>
<li>Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).</li>
<li>Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+and+nonviral+gene+delivery+and+its+role+in+pluripotent+stem+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today.+Technologies%22%5BJournal%5D)">Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105(2008).</li>
<li>Li, S. D., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+is+superior+to+viral+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Nonviral is superior to viral gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).</li>
<li>Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+gene+delivery+systems%3A+From+simple+transfection+agents+to+artificial+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today.+Technologies%22%5BJournal%5D)">Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).</li>
<li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li>
<li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+human+embryonic+stem+cells%3A+Small+and+macromolecule+loading+and+DNA+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection.</a> Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).</li>
<li>Sukhorukov, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+high-intensity+field+pulses%3A+Strategies+for+improving+robustness+and+performance+of+electrotransfection+and+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion.</a> The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).</li>
<li>Floch, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+phosphonolipids+as+non+viral+vectors+for+DNA+transfection+in+hematopoietic+cell+lines+and+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Molecules+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).</li>
<li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).</li>
<li>Siemen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).</li>
<li>Zhang, X., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+delivery+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene delivery in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).</li>
<li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li>
<li>Gropp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+genetic+modification+of+human+embryonic+stem+cells+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).</li>
<li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991(2021).</li>
<li>Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 3, 16017(2016).</li>
<li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-based+nonviral+gene+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li>
<li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation+during+in-vitro+human+embryonic+cortical+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415(2017).</li>
<li>Weissinger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+in+purified+human+hematopoietic+peripheral-blood+stem+cells+by+means+of+electroporation+without+prestimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+and+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).</li>
<li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+transgene+expression+to+antigen-presenting+cells+derived+from+lentivirus-transduced+engrafting+human+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Blood. 99 (2), 399-408 (2002).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).</li>
<li>Sweeney, N. P., Vink, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+lentiviral+vector+genome+size+and+producer+cell+genomic+to+gag-pol+mRNA+ratios+on+packaging+efficiency+and+titre%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Kök hücreleri çalışma veya klinik amaçlar için genetik olarak değiştirme yeteneği, hem teknoloji hem de hESC'lerin biyolojisinin temel anlayışı ile sınırlıdır. Lipofeksiyon ve elektroporasyon gibi fare ESC'lerinde önemli potansiyel gösteren teknikler, geleneksel yöntemlerle gen iletimi için oldukça zor olan hESC'ler için oldukça verimli değildir20. Bu kavram sadece mevcut tekniklerin optimizasyonuna değil, aynı zamanda hESC'lerde transfeksiyon verimliliğinin arttırılması için yeni yöntemlerin geli...

Blastosist iç hücre kütlesinden türetilen insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) pluripotenttir ve in vitro koşullar altında dış etkenlere bağlı olarak farklı hücre tiplerine ayrılabilir 1,2. hESC'lerin potansiyelini tam olarak kullanmak için, bu hücreler için hızlı ve güvenilir gen dağıtım yöntemlerine sahip olmak zorunludur. Geleneksel olarak, kullanılan teknikler genel olarak iki tipte sınıflandırılabilir: viral olmayan ve viral gen dağıtım sistemleri 3,4. Daha sık kullanılan nonviral gen taşıyıcı sistemler lipofeksiyon, elektroporasyon ve nükleofeksiyondur. Nonviral dağıtım sistemleri, daha az yerleştirme mutasyonu ve immünojenisitedeki genel azalma nedeniyle avantajlıdır 5,6. Bununla birlikte, bu yöntemler düşük transfeksiyon etkinliği ve kısa süreli geçici gen ekspresyonu ile sonuçlanır, bu da uzun süreli farklılaşma çalışmaları için önemli bir sınırlamadır7. Elektroporasyon, lipofeksiyona kıyasla daha iyi transfeksiyon verimliliği sağlar; ancak %50'den fazla hücre ölümüile sonuçlanır 8,9,10. Nükleofeksiyon kullanılarak, lipofeksiyon ve elektroporasyon birleştirilerek hücre sağkalımı ve transfeksiyon verimliliği artırılabilir, ancak yaklaşım hücreye özgü tamponlara ve özel ekipmanlara ihtiyaç duyar ve bu nedenle ölçeklendirilmiş uygulamalar için oldukça maliyetli hale gelir11,12.
Buna karşılık, viral vektörler, transdüksiyonu takiben transfeksiyon verimliliklerinin yanı sıra genel olarak düşük sitotoksisiteyi de göstermiştir. Ek olarak, verilen genler istikrarlı bir şekilde ifade edilir ve bu nedenle bu yöntemi uzun süreli çalışmalar için ideal kılar13. hESC'lere gen iletimi için en sık kullanılan viral vektörler arasında, yüksek titreli viral parçacıklar14,15 kullanarak% 80'den fazla transdüksiyon verimliliği sağlayabilen lentiviral vektörler (LVS) bulunmaktadır. Lipofeksiyon ve CaPO4 çökeltmesi, HEK293T hücrelerini veya türevlerini gen transfer vektörleri ile geçici olarak transfekte etmek için en yaygın kullanılan yöntemler arasındadır ve lentiviral parçacıklar üretmek için plazmidleri paketlemektedir16. Lipofeksiyon iyi transfeksiyon etkinliği ve düşük sitotoksisite ile sonuçlanmasına rağmen, teknik maliyeti nedeniyle engellenir ve yüksek titreli lentiviral parçacıklar elde etmek için ölçeklendirilmesi çok maliyetli olacaktır. CaPO4 çökelmesi, lipofeksiyon kullanılarak elde edilenlere nispeten benzer transfeksiyon verimlilikleri ile sonuçlanır. Uygun maliyetli olmasına rağmen, CaPO4 çökeltisi, transfeksiyonları takiben önemli hücre ölümü ile sonuçlanır, bu da standardizasyonu ve partiden partiye varyasyonlardan kaçınmayı zorlaştırır17. Bu senaryoda, yüksek transfeksiyon verimliliği, düşük sitotoksisite ve maliyet etkinliği sağlayan bir yöntem geliştirmek, hESC'lerde kullanılacak yüksek titreli lentiviral parçacıkların üretimi için çok önemlidir.
Polietilenimin (PEI), HEK293T hücrelerini fazla sitotoksisite olmadan yüksek verimlilikte transfekte edebilen ve lipofeksiyon bazlı yöntemlere kıyasla ihmal edilebilir bir maliyeti olan katyonik bir polimerdir18. Bu durumda, PEI, çeşitli teknikler kullanılarak kültür süpernatantlarından lentiviral parçacıkların konsantrasyonu yoluyla yüksek titreli LVS üretiminin ölçeklendirilmiş uygulamaları için kullanılabilir. Sunulan makalede, HEK293T hücrelerini ve lentiviral vektör konsantrasyonunu transfekte etmek için PEI'nin bir sakkaroz yastığı aracılığıyla ultrasantrifüjleme kullanılarak kullanımı açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, düzenli olarak 5 x 107 IU / mL'nin çok üzerinde, düşük partiden partiye varyasyonlara sahip titreler elde ediyoruz. Yöntem, hESC'lere ve hESC'lerden türetilmiş hücrelere gen iletimi için ölçeklendirilmiş uygulamalar için basit, basit ve uygun maliyetlidir.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>38.5 mL, Steril + Sertifikalı Ücretsiz Üstü Açık İnce Duvar Ultra Şeffaf Tüpler</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14292</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>bFGF Rekombinant insan</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini FRAC V</td><td>Invitrogen 15260037</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Bodrum Membran Matrisi, LDEV içermeyen</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Siklopamin</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>72074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ortamı</td><td>İnvitrojen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Besin karışımı F12&nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, w/o: Ca ve Mg</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovie serum</td><td>İnvitrojen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Tavşan mAb Antikoru</td><td>CST</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>Nazik Hücre Ayrışması Reaktifi</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA) 100X Çözelti</td><td>GE sağlık</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamin, 100X&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2924190090</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH Poliklonal antikor</td><td>Proteintech</td><td>15707-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH shRNA</td><td>Makrogen</td><td></td><td>Sıra: CGCATTTCATGTGAGAAAT</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1 tam ortam</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam 1X CTS</td><td>Invitrogen</td><td>A1371201</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 2 Takviyesi 100x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-11050</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 27 Takviyesi 50x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-07200</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin streptomisin SOL</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pLKO.1 TRC vektör</td><td>Addgene</td><td>10878</td><td></td></tr><tr><td>pLL3.7 vektör&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>11795</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Polibren enfeksiyon reaktifi</td><td>Sigma</td><td>TR1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenim, dallı</td><td>Sigma</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2.0</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Purmorfamin</td><td>Tocris</td><td>4551/10</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>A1113802</tr><tr><td>ROCK inhibitörü Y-27632 dihidroklorür&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614/10</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin %.05 EDTA&nbsp;</td><td>Canlandırıcı</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>Tocris</td><td>3748/10</td><td></td></tr></tbody></table>

lentiviral aracılı shrna'ların düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (pei) kullanılarak hesc'lere ve npc'lere verilmesi

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI)

Mevcut protokol, kısa saç tokası RNA'larının (shRNA'lar) hem insan embriyonik kök hücrelerine (hESC'ler) hem de hESC'lerden türetilen nöral progenitör hücrelere (NPC'ler) yüksek verimlilikte verilmesi için lentiviral parçacıkların kullanımını açıklamaktadır. Lentiviral parçacıklar, düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanılarak ambalaj plazmidleri (pAX ve pMD2.G) ile birlikte giriş vektörleri (shRNA'lar taşıyan) kullanılarak HEK293T hücrelerinin birlikte transfekte edilmesiyle üretildi. Viral parçacıklar ultrasantrifüjleme kullanılarak konsantre edildi, bu da ortalama titrelerin 5 x 107'nin üzerinde olmasına neden oldu. Hem hESC'ler hem de NPC'ler, püromisin seçimi ve hESC'lerde kararlı ekspresyonun yanı sıra NPC'lerde geçici GFP ekspresyonu ile gösterildiği gibi, bu lentiviral partiküller kullanılarak yüksek verimlilikte enfekte olabilir. Ayrıca, batı leke analizi, shRNA'lar tarafından hedeflenen genlerin ekspresyonunda önemli bir azalma olduğunu göstermiştir. Ek olarak, hücreler, CNS'nin farklı soylarına daha sonraki farklılaşmalarıyla kanıtlandığı gibi, pluripotensilerini ve farklılaşma potansiyellerini korudular. Mevcut protokol, shRNA'ların verilmesi ile ilgilidir; Bununla birlikte, aynı yaklaşım aşırı ekspresyon çalışmaları için cDNA'ların ektopik ekspresyonu için de kullanılabilir.

Gen transferini takiben, hESC'lerin yüksek canlılığı kaçınılmaz olarak gereklidir. hESC'lerin elektroporasyonunu takiben hücre ölümünü azaltmak için protokollerin çabalarına ve optimizasyonuna rağmen, bu hücrelerin elektroporasyonundan sonra% 50'den fazla hücre ölümü ve düşük transfeksiyon verimliliği20 ile birlikte gözlenmektedir. Lentiviral aracılı gen transferi sadece gen transferinin yüksek verimliliği ile sonuçlanmakla kalmaz, aynı zamanda transdüksiyonu takiben yüksek düzeyde hücre canlılığı...

Düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanarak, H9 insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) shRNA'ların kararlı ekspresyonu için lentiviral parçacıklar ürettik ve geçici olarak dönüştürülmüş H9 türevi nöral progenitör hücreler (NPC'ler) yüksek verimlilikte.

Lentiviral Aracılı shRNA'ların Düşük Maliyetli Katyonik Polimer Polietilenimin (PEI) Kullanılarak hESC'lere ve NPC'lere Verilmesi

The current protocol describes the use of lentiviral particles for the delivery of short hairpin RNAs (shRNAs) to both human embryonic stem cells (hESCs) ...

HEK293T hücrelerinin transfeksiyonu% 90 oranında yapılmalıdır. Ayrıca, lentiviral vektör filtrasyonu için 0.45 mikron düşük protein bağlayıcı filtrenin kullanılması ve ultrasantrifüjleme için bir sakkaroz yastığının kullanılması esastır. HEK293T hücrelerini, 37 santigrat derecede %10 FBS ve 1X penisilin streptomisin içeren DMEM ortamında, transfeksiyon için tohumlamadan önce hücreler %90 akıcıya ulaşana kadar nemlendirilmiş bir inkübatörde %5 karbondioksit ve %21 oksijen atmosferi ile kültürleyerek başlayın.100 milimetrelik bir doku kültürü plakasında 10 mililitre tam büyüme ortamında altı hücreye dört kez 10 kez tohumlayın ve% 5 karbondioksit ve% 21 oksijen atmosferine sahip nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe gece boyunca büyür. Her transfeksiyon için, metin makalesinde açıklandığı gibi giriş ve ambalaj plazmidlerinin oranını takip ederek, 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerinde bir mililitre serumsuz DMEM ortamında mililitre plazmid DNA stokları başına bir miligram seyreltin. Tüpü 10 saniye boyunca vorteks yapın ve toplamak için oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 10.000 kez G'de döndürün.Daha sonra, tüpe mililitre başına bir miligramlık 70 mikrolitre polimer polietilenam

lentiviral-mediated-delivery-shrnas-to-hescs-npcs-using-low-cost

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bir mikroelektrot dizisi (MEA) kullanarak bir yapışkan memeli hücre kültüründe siRNA karıştırılmış dizi site-spesifik transfeksiyon için madde ayrıntılar protokolü.

Mikroelektrod Diziler Kullanarak siRNA Bağlanan Hücre Yüksek verim, Siteye özgü Transfeksiyon (MEA)

Kaynak: Tagliafierro, L., et al. Epigenom Düzenleme Araçlarının İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Hastalık Modellerine Verimli Bir Şekilde Sunulması için Lentiviral Vektör Platformu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, Parkinson hastalığında önemli bir protein olan alfa-sinükleinin hedeflenen epigenetik modifikasyonu için nöral progenitör hücrelerin (NPC'ler) lentiviral transdüksiyonunu göstermektedir. Protokol, metiltransferaz aracılı DNA metilasyonunu mümkün kılarak, gen regülasyonunu ve...

Alfa-sinüklein ekspresyonunun epigenetik regülasyonu için nöral progenitör hücrelerin lentiviral transdüksiyonu

Bu videoda, ölümsüzleştirilmiş hematopoietik kök ve progenitör hücrelerde (iHSPC'ler) stabil knockdown hücre hatları elde etmek için shRNA lentiviral vektörlerinin transdüksiyonunu gerçekleştirmek için bir yöntem gösteriyoruz.

İn Vitro iHSPC'lerde Kısa Saç Tokası RNA Aracılı Gen Yıkımı: Spesifik Gen Ekspresyonunun Yıkılması için iHSPC'lere Lentivirus Tabanlı Bir shRNA Ekspresyon Sistemi Teslimatı

Nanoparçacık izleme analizi (NTA) ve polimerik gen teslimat nanopartiküller değerlendirmek için high-throughput Akım sitometri için bir protokol tanımlanmıştır. NTA nanoparçacık parçacık büyüklüğü dağılımı ve plazmid başına parçacık dağılımını karakterize etmek için kullanılmaktadır. Yüksek throughput flow sitometri gen teslimat biyomalzemelerin bir kütüphane için nicel transfeksiyon etkinliği değerlendirilmesini sağlar.

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Teslimat küçük müdahale RNA (siRNA) terapötik uygulanması için ana sorundur. Bu protokol, arginin ve polietilenimin aşılanmış gözenekli silikon mikro oluşan, çok fonksiyonlu ve biyo-uyumlu bir siRNA taşıyıcı platformun kullanılmasını içerir.

SiRNA Therapeutics teslimi için Gözenekli Silikon Mikropartiküller

Bu protokolün amacı, siRNA'nın BBB'yi geçmesini sağlamak için bir CNS dağıtım sistemi olarak nöro-hedefleme peptitli katyonik/anyonik lipozomları kullanmaktır.  siRNA gibi tedaviler için bir dağıtım sisteminin optimizasyonu, prion ve diğer nörodejeneratif hastalıklar için daha fazla tedavi seçeneğine izin verecektir.

Katyonik ve Anyonik lipozomlar kullanılarak merkezi sinir sistemine Terapötik siRNA teslimi

Bu yazıda bir PEI / MNP vektörü ve mıknatıslanarak endotel hücrelerine miR verimli, viral olmayan iletimi açıklanır. Bu nedenle, genetik modifikasyon ek olarak, bu yaklaşım, manyetik hücre rehberlik ve MR taranabilirlik sağlar. teknik terapötik hücre ürünleri özelliklerini geliştirmek için de kullanılabilir.

Hazırlık ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mıknatıslanmış karakterizasyonu Endotel Hücreleri miR-modifiye

Burada biz bir protokol üzerinde kuru-film yöntemini temel alır ve güvenli için kullanılan katyonik nanoliposomes, nesil için tarif ve in vitro verimli bir şekilde teslim mesajcı RNA transkripsiyonu.

Vitro verimli bir şekilde teslim için katyonik Nanoliposomes nesil mesajcı RNA transkripsiyonu

Biz polyethyleneimine (PEI) kullanarak bir yöntemi açıklamak-kaplı superparamagnetic demir oksit nano tanecikleri siRNA ile transfecting makrofajlar için. Bu nano tanecikleri siRNA makrofajlar vitro ve in vivo ve sessizlik hedef gen ekspresyonu için verimli bir şekilde teslim edebilirsiniz.

Polyethyleneimine kaplı demir oksit nano tanecikleri küçük müdahale RNA makrofajlar için teslim için bir araç olarak Vitro ve In Vivo

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Kısa saç iğnesi RNA (shrna) taşıyan Lentivirus tarafından dönüştürücü olan dağınık insan Islet hücrelerinden gen modifiye insan pseudoislets oluşturmak için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol kolay kullanılabilir enzim ve kültür gemileri kullanır, kolayca yapılabilir ve fonksiyonel ve morfolojik çalışmalar için uygun genetiği değiştirilmiş insan pseudoislets üretir.

Düşük ataşman plakalarına hazırlanmış ınsan Pseudoislet 'te lentiviral aracılı gen susturulması

Öğrenin, düşük maliyetli polietilenim (PEI) kullanarak lentiviral partiküller üretin ve bu yöntemle hESC'lerden türetilmiş nöral progenitör hücrelere (NPC'ler) shRNA teslimatını gerçekleştirin.

Lentiviral Aracılı shRNA'ların Düşük Maliyetli Katyonik Polimer Polietilenimin (PEI) Kullanılarak hESC'lere ve NPC'lere Verilmesi

Daha fazla video keşfet