Name: Hücre İçi Vezikül Rüptürünün İşlevini İncelemek İçin Fotodinamik Bir Yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Keşfedin hücre içi vezikül hasarının dinamiklerini canlı hücrelerde CALI tekniği kullanarak. Bu yöntem, vezikül rüptürü sonrası aktive olan sinyal yollarını anlamak için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, araştırma desteği için IBMS, Academia Sinica Inflammation Core Facility'ye teşekkür etmek istiyor. Çekirdek tesis, Academia Sinica Çekirdek Tesisi ve Yenilikçi Enstrüman Projesi (AS-CFII-111-213) tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar, görüntü edinimine yardımcı oldukları için Biyomedikal Bilimler Enstitüsü (IBMS), Academia Sinica (AS) Ortak Ekipman Çekirdek Tesisi'ne teşekkür eder.

1. AlPcS2a stok hazırlama
<ol><li>10 mg AlPcS2a'yı 400 μL 0.1 M NaOH içinde çözün. Çözünürlüğü artırmak için, çözeltiyi 50 ° C'de ve vortekste ısıtın.</li>
	<li>Çözeltiyi 4 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile karıştırın. Ardından, çözünmeyen çökeltileri gidermek için çözeltiyi 0,22 μm'lik bir filtre ile filtreleyin.</li>
	<li>Çözeltinin konsantrasyonunu bir UV-Vis spektrofotometresi ile ölçün. AlPcS2a'nın 672 nm'deki yok olma katsayısı 4 x 104 cm-1 M-1'dir. 1 mM çözeltisi oluşturmak için AlPcS2a çözümünü PBS ile seyreltin. 1 mL aliquots yapın ve -20 ° C'de saklayın.</li>
</ol>2. Transfeksiyon
NOT: Gal3-GFP, lizozomal rüptürün canlı hücre görüntülemesi için bir gösterge olarak uygulanır.
<ol><li>DMEM'de HeLa hücre kültürünü% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile destekleyin. Hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, hücreleri deneyin, daha sonra% 10 FBS ile desteklenmiş DMEM'deki hücreleri yeniden askıya alın. NOT: Yöntem, HeLa ve A549 hücre satırları da dahil olmak üzere ekli hücre satırlarının çoğu için geçerlidir. Prensip olarak, süspansiyon hücrelerini test etmemesine rağmen, CALI testleri onlarla yapılabilir.</li>
	<li>300 ng Gal3-GFP plazmidini 25 μL indirgenmiş serum ortamında seyreltin ve ardından 0.6 μL P3000 reaktifi ekleyin. Yavaşça karıştırın. 0.45 μL Lipofectamine 3000 reaktifini 25 μL indirgenmiş serum ortamında seyreltin. Yavaşça karıştırın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Seyreltilmiş DNA ve seyreltilmiş Lipofectamine 3000'i karıştırın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>DNA-Lipofectamine karışımını, 3 x 105 askıya alınmış HeLa hücrelerini ve 200 μL DMEM +% 10 FBS'yi karıştırın ve ardından hücreleri 35 mm'lik bir cam düğme kabının merkezi cam bölgesine tohumlayın.</li>
</ol>3. AlPcS2a boyama
<ol><li>Hücre bağlanmasına izin vermek için, hücreleri en az 4 saat boyunca% 5 CO2 ile birlikte verilen inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>1 μM AlPcS2a çözeltisi oluşturmak için DMEM'deki AlPcS 2a'yı FBS ile birlikte seyreltin. AlPcS2a içeren ortamı 37 °C su banyosunda önceden ısıtın. Kültür ortamını AlPcS2a içeren ortamla değiştirin.</li>
	<li>Hücreleri 37 ° C'de inkübe edin, gece boyunca% 5 CO2 ile birlikte verilen inkübatörde (16-18 saat).</li>
	<li>Ertesi gün, hücre dışı AlPcS2a'yı çıkarmak için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Ortamı taze ortamla değiştirin ve daha sonra endositik yol boyunca kalan boyanın lizozomlara birikmesine izin vermek için 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. NOT: Endozomları boyamak için, DMEM'de 1 μM AlPcS2a'daki hücreleri 37 ° C'de 15 dakika boyunca% 10 FBS içeren inkübe edin. Daha sonra, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve görüntülemeden önce önceden ısıtılmış ortamda inkübe edin.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig01.jpg"> Şekil 1. AlPcS2a ile seçici IV hasarını temsil eden şematik bir figür. Şekil, seçici IV hasarının şematiklerini göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig02.jpg"> Şekil 2. AlPcS2a ile lizozomal boyama. HeLa hücrelerinde 1 μM AlPcS2a ile gece boyunca etiketlenen lizozomlar, 50 nM yeşil floresan boya ile pozitif boyanır. Ölçek çubuğu: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
4. Örnek görüntüleme ve ışık aydınlatması
NOT: Tek bir hücrenin hücre altı bölgesinde veya bir kültür kabındaki tüm AlPcS2a etiketli hücrelerde IV hasarı gerçekleştirilebilir. Tüm kültür kabının toplu olarak aydınlatılması, biyokimyasal çalışmalar da dahil olmak üzere bu hasarın nicel olarak incelenmesine izin verir.
<ol><li>Aşağıda açıklandığı gibi, tek bir hücre içindeki lizozomlara zarar vererek tek hücreleri manipüle edin.<ol><li>Kültür kabını konfokal mikroskop sahnesine yerleştirin. Heyecan verici GFP ve AlPcS2a için sırasıyla 488 nm ve 561 nm lazerleri kullanın.</li>
		<li>Hasar görmek üzere seçilen AlPcS2a etiketli veziküller üzerinde 5 x 5 μm2 ilgi alanını (ROI) daire içine alın.</li>
		<li>Pulse, 70 tekrar için 0,21 mW'lık 633 nm lazer ile yatırım getirisini aydınlatır. Lizozomal membran geçirgenliğinin bir göstergesi olarak Gal3 puncta oluşumunu izleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıda açıklandığı gibi bir kültür kabındaki etiketli tüm hücrelere zarar verin.<ol><li>Kültür tabağını bir platforma yerleştirin. Çanağı 660 nm kolimasyonlu LED ışığı ile aydınlatın (yakın kızılötesi ışık, AlPcS2a'nın uyarma spektrumunda ideal bir temeldir).</li>
		<li>Kültür kabını mikroskop üzerine yerleştirin ve adım 4.1.3'te belirtildiği gibi membran geçirgenliği göstergelerini izleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki göstergeleri kullanarak IV'lerin yaralanmasını değerlendirin.<ol><li>Endozom veya lizozom içeriği, IV rüptürü üzerine sitozole maruz kalan en yüksek glikozile edilir. Bunları, galektin-1, galektin-3, galektin-8 ve galektin-916,20 dahil olmak üzere sitozolik glikan bağlayıcı galektinler kullanarak hızla etiketleyin.</li>
		<li>Yaranın boyutu,21'de tarif edildiği gibi membran geçirimsiz boyanın salınması ile belirlenebilir.</li>
		<li>Endozomlar ve lizozomlar arasındaki fark, luminal pH değerleridir. Lizozomal rüptür, FITC-dekstran3 gibi pH'a duyarlı boya kullanılarak ölçülebilen luminal pH'ı bozar.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig03.jpg"> Şekil 3. AlPcS2a aracılı CALI, aydınlatma bölgesindeki lizozomlara TagRFP-galektin-3'ün (Gal3) yerel olarak işe alınmasını indükler. TagRFP-galektin-3 eksprese edilen HeLa hücrelerindeki lizozomlar, 1 μM AlPcS2a ile gece boyunca boyandı, ardından sarı kare içinde yakın kızılötesi ışıkla (633 nm) aydınlatmaya odaklandı. Sarı kare içindeki AlPcS2a sinyali, TagRFP-galektin-3 punkta oluşumu ile birlikte fotoağartılır. Ölçek çubuğu: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<ol><li>Cossart, P., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+viruses+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of viruses and bacteria.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (8), 016972(2014).</li>
<li>Daussy, C. F., Wodrich, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BRepair+me+if+you+can%26%2334%3B%3A+membrane+damage%2C+response%2C+and+control+from+the+viral+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">34;Repair me if you can&#34;: membrane damage, response, and control from the viral perspective.</a> Cells. 9 (9), 2042(2020).</li>
<li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111(2013).</li>
<li>Sharma, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+for+cancer+and+for+infections%3A+what+is+the+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Israel+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy for cancer and for infections: what is the difference.</a> Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 691-705 (2012).</li>
<li>Kübler, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Laser+Application%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy.</a> Medical Laser Application. 20 (1), 37-45 (2005).</li>
<li>De Rosa, F. S., Bentley, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+skin+cancers%3A+sensitizers%2C+clinical+studies+and+future+directives%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of skin cancers: sensitizers, clinical studies and future directives.</a> Pharmaceutical Research. 17 (12), 1447-1455 (2000).</li>
<li>Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+photosensitizers+for+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">New photosensitizers for photodynamic therapy.</a> Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).</li>
<li>Lavie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photodynamic+pathway+to+apoptosis+and+necrosis+induced+by+dimethyl+tetrahydroxyhelianthrone+and+hypericin+in+leukaemic+cells%3A+possible+relevance+to+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A photodynamic pathway to apoptosis and necrosis induced by dimethyl tetrahydroxyhelianthrone and hypericin in leukaemic cells: possible relevance to photodynamic therapy.</a> British Journal of Cancer. 79 (3-4), 423-432 (1999).</li>
<li>Jay, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+destruction+of+protein+function+by+chromophore-assisted+laser+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (15), 5454-5458 (1988).</li>
<li>Grate, D., Wilson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated%2C+site-specific+inactivation+of+RNA+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated, site-specific inactivation of RNA transcripts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (11), 6131-6136 (1999).</li>
<li>Lin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+inhibition+of+synaptic+release+with+chromophore-assisted+light+inactivation+%28CALI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI).</a> Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).</li>
<li>Hsieh, C. W., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+mitophagy+with+photosensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Triggering mitophagy with photosensitizers.</a> Methods in Molecular Biology. 1880, 611-619 (2019).</li>
<li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+initiation+of+Parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled initiation of Parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li>
<li>Molinari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuoles+induced+by+Helicobacter+pylori+toxin+contain+both+late+endosomal+and+lysosomal+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vacuoles induced by Helicobacter pylori toxin contain both late endosomal and lysosomal markers.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (40), 25339-25344 (1997).</li>
<li>Prince, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+a+lysosomal+pathway+regulating+neutrophil+apoptosis+by+a+major+bacterial+toxin%2C+pyocyanin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Subversion of a lysosomal pathway regulating neutrophil apoptosis by a major bacterial toxin, pyocyanin.</a> Journal of Immunology. 180 (5), 3502-3511 (2008).</li>
<li>Aits, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+lysosomal+membrane+permeabilization+by+lysosomal+galectin+puncta+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay.</a> Autophagy. 11 (8), 1408-1424 (2015).</li>
<li>Prasmickaite, L., Hogset, A., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+photosensitizers+for+use+in+photochemical+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different photosensitizers for use in photochemical gene transfection.</a> Photochemistry and Photobiology. 73 (4), 388-395 (2001).</li>
<li>Berg, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+internalization%3A+a+novel+technology+for+delivery+of+macromolecules+into+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Photochemical internalization: a novel technology for delivery of macromolecules into cytosol.</a> Cancer Research. 59 (6), 1180-1183 (1999).</li>
<li>Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photodegradation+of+porphyrins+in+cells+can+be+used+to+estimate+the+lifetime+of+singlet+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen.</a> Photochemistry and Photobiology. 53 (4), 549-553 (1991).</li>
<li>Thurston, T. L., Wandel, M. P., von Muhlinen, N., Foeglein, A., Randow, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin+8+targets+damaged+vesicles+for+autophagy+to+defend+cells+against+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Galectin 8 targets damaged vesicles for autophagy to defend cells against bacterial invasion.</a> Nature. 482 (7385), 414-418 (2012).</li>
<li>Repnik, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-leucyl-L-leucine+methyl+ester+does+not+release+cysteine+cathepsins+to+the+cytosol+but+inactivates+them+in+transiently+permeabilized+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">L-leucyl-L-leucine methyl ester does not release cysteine cathepsins to the cytosol but inactivates them in transiently permeabilized lysosomes.</a> Journal of Cell Science. 130 (18), 3124-3140 (2017).</li>
<li>Griffiths, G., Hoflack, B., Simons, K., Mellman, I., Kornfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mannose+6-phosphate+receptor+and+the+biogenesis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mannose 6-phosphate receptor and the biogenesis of lysosomes.</a> Cell. 52 (3), 329-341 (1988).</li>
<li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+Coordinates+a+cellular+system+for+lysosomal+repair+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 Coordinates a cellular system for lysosomal repair and removal.</a> Developmental Cell. 52 (1), 69-87 (2020).</li>
<li>Chu, Y. P., Hung, Y. H., Chang, H. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+to+monitor+lysophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Assays to monitor lysophagy.</a> Methods in Enzymology. 588, 231-244 (2017).</li>
<li>Nguyen, L., Madsen, S. J., Berg, K., Hirschberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+in+vitro+photochemical+internalization+protocol+for+3D+spheroid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">An improved in vitro photochemical internalization protocol for 3D spheroid cultures.</a> Lasers in Medical Science. 36 (8), 1567-1571 (2021).</li>
<li>Daugelaviciene, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-targeted+photodynamic+treatment+induces+primary+keratinocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology.+B%2C+Biology%22%5BJournal%5D)">Lysosome-targeted photodynamic treatment induces primary keratinocyte differentiation.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. 218, 112183(2021).</li>
<li>Hong, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+galectins+control+cellular+responses+commensurate+with+cell+surface+carbohydrate+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Intracellular galectins control cellular responses commensurate with cell surface carbohydrate composition.</a> Glycobiology. 30 (1), 49-57 (2019).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

AlPcS2a plazma zarına bağlanır, daha sonra endositoz tarafından içselleştirilir ve sonunda lizozomlarda birikir. AlPcS2a böylece inkübasyon süresini ayarlayarak hücre altı bölmelerde lokalize edilebilir. Bu metodolojinin bir sınırlaması, IV'lerin sadece bir alt popülasyonunun AlPcS2a tarafından endositoz yoluyla etiketlenebilmesidir, çünkü ER ve Golgi aparatı gibi IV'lerin başka birçok membran kaynağı vardır. Ek olarak, AlPcS2a'nın erken veya geç endozomlara seçici olarak etike...

Bir tür hücre içi vezikül (IV) olan endozomlar, endositoz tarafından oluşturulur ve daha sonra lizozomlara olgunlaşır. IV'lerin oluşumunda çeşitli hücre içi sinyal yolları rol oynar; Ek olarak, farklı içsel ve dışsal uyaranlar IV'lere zarar verebilir (örneğin, patojenler enfeksiyon sırasında sınırlı zardan kaçabilir ve sitoplazma1'e girebilir). Buna genellikle endositotik veziküllerinrüptürü eşlik eder 2. Bu nedenle, IV'leri hedefleme ve zarar verme teknikleri ilgili çalışmalarda kullanılabilir3.
Fotodinamik terapi (PDT), tümörleri veya patojenleri öldürerek hastalıklarla mücadele etmek için ışığa bağımlı bir terapidir4. PDT'de, hedeflenen hücreler, ışık aydınlatmasıile lokal olarak aktive edilebilen fotosensitizörler adı verilen toksik olmayan kromoforlarla etiketlenir 5,6. Fotosensitizörler ışıktan enerjiyi emer ve uyarılmış bir singlet durumuna dönüşür ve uzun ömürlü uyarılmış üçlü duruma yol açar. Üçlü durumun fotosensitizörleri elektron veya enerji transferine uğrayabilir ve oksijen varlığında reaktif oksijen türleri (ROS) oluşturabilir ve aydınlatma bölgesi7 içindeki etiketli hücreleri mekansal olarak yok edebilir. Sonuç, ışığın gücüne bağlı olarak değişir8. Fotosensitizörlerin konsantrasyonunu ve ışık aydınlatmasının yoğunluğunu kontrol ederek, hedeflenen biyomoleküller, kromofor yardımlı ışık inaktivasyonu (CALI)9 olarak adlandırılan hücre lizisi olmadan seçici olarak inaktive edilebilir. Çeşitli hücre altı hedefleri seçici olarak etiketleyebilen fotosensitizörlerin önemli ölçüde gelişmesiyle CALI, nükleotidler ve proteinler gibi küçük biyomoleküllerin yanı sıra mitokondri ve endo-lizozomlar 3,10,11,12,13 gibi organeller için biyomoleküllerin ışık aracılı inaktivasyonunu kontrol etmek için değerli bir araç haline gelmiştir.
CALI ile karşılaştırıldığında, lizozomal hasar için bakteriyel toksin 14,15 ve Leu-Leu-OMe16 tedavisi gibi membranları bozmak için kimyasal veya fiziksel yöntemler de kullanılır. Bununla birlikte, bu yöntemler hücreler içindeki IV'lerin toplu bozulmasını gösterir. CALI'de sağlam fotosensitizörler (yani, Al(III) ftalosiyanin klorür disülfonik asit (AlPcS2a)) kullanılır; Endositoz yoluyla lizozomları hedef alan AlPcS2a, kontrollü bir bölgede endozomları veya lizozomları parçalamak için kullanılır17. AlPcS2a, plazma zarındaki lipitlere bağlanan ve endositoz yoluyla içselleştirilen ve sonunda endositik yol18 aracılığıyla lizozom içinde biriken hücre zarı geçirimsiz ftalosiyanin bazlı bir kromofordur. Yakın kızılötesi spektral bir bölgedeki ışığı emer ve uyarılmış AlPcS2a 18 tarafından üretilen büyük bir ROS olan singlet oksijen üretir. Singlet oksijeninin hızla bozunması, hücrelerdeki küçük bir bölgede (yaklaşık 10-20 nm) difüzyon ve reaksiyon mesafesini sınırlar19. AlPcS2a inkübasyon ve ışık aydınlatmasının süresini ayarlayarak, IV'lerin hücre altı bir alandaki hasarının mekansal zamansal kontrolüne izin verilir. Bu nedenle CALI, IV hasarının sonuçlarını ve IV'lerin oluşumunu ve düzenlenmesini incelemek için güçlü bir araç haline gelir.
Bu çalışmada, AlPcS2a'yı fotosensitizör olarak kullanan spesifik bir CALI protokolü ele alınmıştır. Bu protokol, endozomlar ve lizozomlar da dahil olmak üzere çeşitli IV tiplerine uygulanabilir ve membran rüptürü sonrası takip yanıtlarını incelemek için kullanılabilir. Lizozom rüptüründen sonra ortaya çıkan florofor konjuge galektin-316,20 eksprese eden HeLa hücreleri bu protokolü göstermek için kullanılır.

<table><tbody><tr><td><güçlü >Reaktif< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Al (III) Ftalosiyanin Klorür Disülfonik asit (AlPcS2a)</td> <td>Frontier Scientific</td><td>P40632</td><td></td></tr><tr><td>Kültür kabı</td><td>ibidi</td><td>812128-200</td><td></td></tr><tr>%<td>10 FBS ve 100 U/mL penisilin G ve 100 mg/mL Streptomisin DMEM ile desteklenmiş</td><td>Kültür Ortamı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4736301</td><td></td></tr><tr><td>Gal3-GFP plazmid</td><td>addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Yeşil DND-26</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L7526</td><td>yeşil floresan boya</td></tr><tr><td>Çok duvarlı plaka</td><td>perkinelmer</td><td>PK-6005550</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q15895</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4</td></tr><tr><td><güçlü>Hücre hattı</güçlü> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa Hücre Hattı</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>Yöntemler, bağlı hücre hatlarının çoğu için geçerlidir. Koşullar ayrı ayrı belirlenmelidir.</td></tr><tr><td><güçlü > Ekipmanlar< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 ve mikro; m Filtre</td><td>Merck</td><td>SLGV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Kolimasyonlu LED Işık&nbsp; (660 deniz mili)</td><td>Thorlabs</td><td>M660L3-C1 ve DC2100</td><td>Yakın kızılötesi ışık, AlPcS2a'nın uyarma spektrumu için ideal bir temeldir.</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskopi</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 780</td><td>Uzun süreli görüntüleme için bir inkübasyon sistemi gereklidir.</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 / 2000c Spektrofotometreler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı LED ışık</td><td>Tholabs</td><td>M660L4-C1</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre İçi vezikül rüptürünün İşlevini İncelemek İçin fotodinamik bir yaklaşım

A Photodynamic Approach to Study Function of Intracellular Vesicle Rupture

Hücre içi veziküller (IV'ler), veziküllerin sitoplazmaya endositozu ile oluşur. IV oluşumu, IV membranlarının geçirgenliği ve endozom ve lizozomların oluşumu yoluyla çeşitli sinyal yolaklarının aktive edilmesinde rol oynar. IV'lerin oluşumunu ve IV regülasyonunu kontrol etmedeki materyalleri incelemek için kromofor yardımlı lazer inaktivasyonu (CALI) adı verilen bir yöntem uygulanır. CALI, membran geçirgenliği tarafından indüklenen sinyal yolunu incelemek için görüntüleme tabanlı bir fotodinamik metodolojidir. Yöntem, seçilen organelin mekansal zamansal manipülasyonunun bir hücrede geçirgenleştirilmesine izin verir. CALI yöntemi, endozomların ve lizozomların geçirgenliği yoluyla spesifik molekülleri gözlemlemek ve izlemek için uygulanmıştır. IV'lerin membran rüptürünün, galektin-3 gibi glikan bağlayıcı proteinleri seçici olarak işe aldığı bilinmektedir. Burada, protokol, IV rüptürünün AlPcS2a tarafından indüklenmesini ve bozulmuş lizozomları etiketlemek için bir belirteç olarak galektin-3'ün kullanılmasını açıklar; bu, IV membran rüptürünün aşağı akış etkilerini ve çeşitli durumlar altında aşağı akış etkilerini incelemede yararlıdır.

Endozom ve lizozom da dahil olmak üzere IV'ün AlPcS2a kaynaklı hasarını temsil eden şematik bir şekil gösterilmiştir (Şekil 1).
Ticari olarak temin edilebilen belirteçler, AlPcS2a boyama koşullarını belirlemek için kullanılabilir. Örneğin, AlPcS2a puncta ve yeşil floresan boya22 kolokalizasyon (Şekil 2).
Florofor etiketli galektin-3, IV hasarını izlem...

AlPcS2a aracılı kromofor yardımlı lazer inaktivasyonu (CALI), canlı hücrelerde hücre içi veziküllerin (IV'ler) uzaysal zamansal hasarını incelemek için güçlü bir araçtır.

Hücre İçi Vezikül Rüptürünün İşlevini İncelemek İçin Fotodinamik Bir Yaklaşım

Intracellular vesicles (IVs) are formed through endocytosis of vesicles into cytoplasm. IV formation is involved in activating various signal pathways ...

Vezikülün sitoplaziye endositozu hücre içi veziküllerin oluşumu ile sonuçlanır. Vezikülün geçirgenliği çeşitli sinyal yollarını aktive eder. Kromofor yardımlı lazer inaktivasyonu, hücre içi vezikül rüptürünün sonucunu incelemek için kullanılır.Hücre içi veziküllere hücre altı hasarın mekansal ve zamansal kontrolü, ayakta durma durumunu ve ışık aydınlatmasını ayarlayarak sağlanabilir. Başlamak için, DMEM'de% 10 FBS ile desteklenen HeLa hücre kültürünü koruyun. Hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, hücreleri tripsizleştirin.Daha sonra,% 10 FBS ile desteklenen DMEM'deki hücreleri yeniden askıya alın. 300 nanogram Gal3-GFP plazmidini 25 mikrolitre indirgenmiş serum ortamında seyreltin. Ardından 0.6 mikrolitre P3000 reaktifi ekleyin.Ve yavaşça karıştırın, ardından çözeltiyi vorteksleyin. 0.45 mikrolitre Lipofectamine 3000 reaktifini 25 mikrolitre azaltılmış serum ortamında seyreltin ve yavaşça karıştırın. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Daha sonra seyreltilmiş DNA ve seyreltilmiş Lipofectamine 3000'i karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. DNA lipofektamin karışımını, 300.000 askıya alınmış HeLa hücresini ve% 10 FBS ile 200 mikrolitre DMEM'yi karıştırdıktan sonra, hücreleri 35 milimetrelik bir cam düğme kabının merkezi cam bölgesine tohumlayın. Hücre bağlanmasına izin vermek için, hücreleri en az dört saat boyunca% 5 karbondioksit ile sağlanan inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin.Bir mikromolar AlPcS2a çözeltisi yapmak için% 10 FBS ile desteklenmiş DREM'de AlPcS2a'yı seyreltin. AlPcS2a içeren ortamı 37 santigrat derecelik bir su banyosunda önceden ısıtın ve kültür ortamını AlPcS2a içeren ortamla değiştirin. Hücreleri, gece boyunca% 5 karbondioksit ile beslenen inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin.Ertesi gün, ortamı taze ortamla değiştirdikten sonra hücre dışı AlPcS2a'yı çıkarmak için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Endositik yol boyunca kalan boyanın lizozomlara birikmesine izin vermek için dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Lizozomlara zarar vererek tek hücreleri manipüle etmek için, kültür kabını konfokal mikroskop sahnesine yerleştirin.Heyecan verici GFP ve AlPcS2a için sırasıyla 488 nanometre ve 561 nanometre lazerleri kullanın. Hasar görmek üzere seçilen AlPcS2a etiketli veziküller üzerinde beşe beş mikrometre karelik bir ilgi alanı çizin. Daha sonra darbe, ilgilenilen bölgeyi 0.21 miliwatt'lık 633 nanometre lazerle veya 70 tekrarla aydınlatır.Lizozomal membran geçirgenliğinin bir göstergesi olarak Gal3 puncta oluşumunu izleyin. HeLa hücrelerinde AlPcS2a ile lizozomal boyama, ticari olarak temin edilebilen belirteçler kullanılarak gerçekleştirildi ve yeşil floresan boya ile pozitif boyandı. TagRFP-Galectin3 eksprese edilen HeLa hücrelerindeki lizozomlar AlPcS2a ile boyandı.Yakın kızılötesi ışıkla aydınlatmaya odaklanmanın ardından, sonuçlar AlPcS2a bazlı kromofor yardımlı lazer inaktivasyonunun, ilgili bölgedeki lokal lizozomal rüptürü kontrol edebildiğini ve lizozomların geri kalanını bozulmadan bıraktığını göstermektedir. Bu adım önemlidir, çünkü inkübasyon süresi ayakta duran endozomları veya lizozomları belirleyecektir. Örneğin, insanlar membran geçirimsiz boyanın salınımı ile boyutunu belirleyebilirler.Ayrıca endozomları ve lizozomları ayırt etmek için FITC dekstran gibi pH'a duyarlı boyalar da kullanılabilir. Bu teknik, hücre içi vezikül membran rüptürünün aşağı yönlü etkilerini başlatmak için yararlıdır. Ve çeşitli durumlarda aşağı akış etkileri vardır.

a-photodynamic-approach-to-study-function-intracellular-vesicle

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz endomembran kopma izleme için bir yöntem açıklanmaktadır, hücre içi bakteri tarafından ortaya...

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Lipofilik boya FM1-43 maruz kalan hücrelerin canlı görüntüleme gözenek oluşturucu toksinler plazma membran kaldırılır hangi kinetiği tam belirlenmesini sağlar. Bu Ca 2 + gereksinimleri, sfingomiyelinaz ve plazma membranı onarım diğer faktörler değerlendirmek için kullanılabilecek bir hassas bir deneydir.

Ca Rolleri değerlendirilmesi için Görüntüleme Testi Canlı<sup&gt; 2 +</supGözenek oluşturucu Toksin yaraların tamiri&gt; ve sfingomiyelinaz

Iyileşme yaralı hücrelerinin hücre zarı gibi bir işlem yaralanma siteye özgü protein ve hücre içi bölmeler kaçakçılığı içerir. Bu protokol, bu süreçleri izlemek için deneyleri açıklar.

Görüntüleme Hücre Membran Hasarı ve Onarımı ilgilendim hücrealtı Süreçleri

Bu makale, bir sinaptobrevin2-pHluorin yapısı ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanarak nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vezikül dinamiklerini araştırmak için bir yöntem sağlar. Görüntü işleme ve veri analizi için geliştirilen strateji de raporlanmaktadır.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Hücre zarının iki fotonlu lazer ile yaralama membran yeniden mühürlemeden yeteneği değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir ve birden çok hücre türü için uygulanabilir. Burada, vitro canlı İki fotonlu lazer ablasyon takip dysferlinopathy hasta hücrelerde membran yeniden mühürleme, görüntüleme için bir protokol açıklayın.

İki fotonlu lazer mikroskop kullanarak hücre zarı tamir tahlil

Canlı hücre görüntüleme bilgi hazinesi tek hücreler veya tüm nüfus üzerinde ulaşılamaz olan sabit hücre tek başına Imaging tarafından sağlar. Burada, hücre kader kararlar tedavi Anti-Mitotik uyuşturucu Paklitaksel ile aşağıdaki değerlendirmek için canlı hücre görüntüleme iletişim kuralları açıklanır.

Uzun vadeli canlı hücre kader Paklitaksel karşılık olarak değerlendirmek için Imaging hücreli

Biz bir teknik veziküller, temassız embriyolardan için yerelleştirilmiş kalsiyum iyon degradeler kullanarak mevcut. Bir dev lipid vezikül, çevresinde bir kalsiyum iyon eriyik mikroenjeksiyon membran borulu çıkıntılar üretiminde kaynaklanan lipit membran yeni model için kullanılmaktadır.

Yanıt olarak lokalize kalsiyum iyon degradeler dev veziküller membran Remodeling

Biz yöntemleri konvansiyonel ve confocal live-cep mikroskobu görüntüleme, dahil olmak üzere necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu için scanning elektron mikroskobu ve lipid NMR tabanlı bağlama raporu.

Necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu

Floresan sızıntı tahlili, peptit/membran etkileşimlerinin araştırılmasını sağlayan basit bir yöntemdir, böylece çeşitli biyolojik süreçlere dahil olmaları ve özellikle hücre nüfuz eden peptitlerin doğrudan hücresel translokasyon işlemi sırasında fosfolipid bilayerleri rahatsız etme yeteneği.

Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Termoplazmonik delme yöntemi, hücrelerde ve dev unilameller veziküllerde plazma membran onarımı sırasında protein tepkilerini incelemek için konfokal mikroskopi, optik cımbız ve altın nanopartikülleri entegre eder. Teknik, hızlı ve lokalize membran delinmesini mümkün kılarak, anahtar proteinlerin ve bunların karmaşık plazma membran onarım mekanizmasındaki fonksiyonel rollerinin tanımlanmasına izin verir.

Canlı Hücrelerde ve Model Membranlarda Plazma Membran Onarımını Araştırmak İçin Termoplazmonik Bir Yaklaşım

Bu protokol, lizozomal membran bütünlüğü ve asitleşmedeki değişiklikleri tespit eden floresan problar kullanarak, nekroptoz sırasında lizozomal membran geçirgenliğini izlemek için bir canlı hücre görüntüleme yöntemini açıklar.

Nekroptoz Sırasında Lizozomal Membran Geçirgenliğinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Keşfedin hücre içi vezikül hasarının dinamiklerini canlı hücrelerde CALI tekniği kullanarak. Bu yöntem, vezikül rüptürü sonrası aktive olan sinyal yollarını anlamak için değerli bir araçtır.

Hücre İçi Vezikül Rüptürünün İşlevini İncelemek İçin Fotodinamik Bir Yaklaşım

Daha fazla video keşfet