Hücre İçi Vezikül Rüptürünün İşlevini İncelemek İçin Fotodinamik Bir Yaklaşım
17 Mart 2023
AlPcS2a aracılı kromofor yardımlı lazer inaktivasyonu (CALI), canlı hücrelerde hücre içi veziküllerin (IV'ler) uzaysal zamansal hasarını incelemek için güçlü bir araçtır.
Vezikülün sitoplaziye endositozu hücre içi veziküllerin oluşumu ile sonuçlanır. Vezikülün geçirgenliği çeşitli sinyal yollarını aktive eder. Kromofor yardımlı lazer inaktivasyonu, hücre içi vezikül rüptürünün sonucunu incelemek için kullanılır.
Hücre içi veziküllere hücre altı hasarın mekansal ve zamansal kontrolü, ayakta durma durumunu ve ışık aydınlatmasını ayarlayarak sağlanabilir. Başlamak için, DMEM'de% 10 FBS ile desteklenen HeLa hücre kültürünü koruyun. Hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, hücreleri tripsizleştirin.
Daha sonra,% 10 FBS ile desteklenen DMEM'deki hücreleri yeniden askıya alın. 300 nanogram Gal3-GFP plazmidini 25 mikrolitre indirgenmiş serum ortamında seyreltin. Ardından 0.6 mikrolitre P3000 reaktifi ekleyin.
Ve yavaşça karıştırın, ardından çözeltiyi vorteksleyin. 0.45 mikrolitre Lipofectamine 3000 reaktifini 25 mikrolitre azaltılmış serum ortamında seyreltin ve yavaşça karıştırın. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.
Daha sonra seyreltilmiş DNA ve seyreltilmiş Lipofectamine 3000'i karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. DNA lipofektamin karışımını, 300.000 askıya alınmış HeLa hücresini ve% 10 FBS ile 200 mikrolitre DMEM'yi karıştırdıktan sonra, hücreleri 35 milimetrelik bir cam düğme kabının merkezi cam bölgesine tohumlayın. Hücre bağlanmasına izin vermek için, hücreleri en az dört saat boyunca% 5 karbondioksit ile sağlanan inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin.
Bir mikromolar AlPcS2a çözeltisi yapmak için% 10 FBS ile desteklenmiş DREM'de AlPcS2a'yı seyreltin. AlPcS2a içeren ortamı 37 santigrat derecelik bir su banyosunda önceden ısıtın ve kültür ortamını AlPcS2a içeren ortamla değiştirin. Hücreleri, gece boyunca% 5 karbondioksit ile beslenen inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, ortamı taze ortamla değiştirdikten sonra hücre dışı AlPcS2a'yı çıkarmak için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Endositik yol boyunca kalan boyanın lizozomlara birikmesine izin vermek için dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Lizozomlara zarar vererek tek hücreleri manipüle etmek için, kültür kabını konfokal mikroskop sahnesine yerleştirin.
Heyecan verici GFP ve AlPcS2a için sırasıyla 488 nanometre ve 561 nanometre lazerleri kullanın. Hasar görmek üzere seçilen AlPcS2a etiketli veziküller üzerinde beşe beş mikrometre karelik bir ilgi alanı çizin. Daha sonra darbe, ilgilenilen bölgeyi 0.21 miliwatt'lık 633 nanometre lazerle veya 70 tekrarla aydınlatır.
Lizozomal membran geçirgenliğinin bir göstergesi olarak Gal3 puncta oluşumunu izleyin. HeLa hücrelerinde AlPcS2a ile lizozomal boyama, ticari olarak temin edilebilen belirteçler kullanılarak gerçekleştirildi ve yeşil floresan boya ile pozitif boyandı. TagRFP-Galectin3 eksprese edilen HeLa hücrelerindeki lizozomlar AlPcS2a ile boyandı.
Yakın kızılötesi ışıkla aydınlatmaya odaklanmanın ardından, sonuçlar AlPcS2a bazlı kromofor yardımlı lazer inaktivasyonunun, ilgili bölgedeki lokal lizozomal rüptürü kontrol edebildiğini ve lizozomların geri kalanını bozulmadan bıraktığını göstermektedir. Bu adım önemlidir, çünkü inkübasyon süresi ayakta duran endozomları veya lizozomları belirleyecektir. Örneğin, insanlar membran geçirimsiz boyanın salınımı ile boyutunu belirleyebilirler.
Ayrıca endozomları ve lizozomları ayırt etmek için FITC dekstran gibi pH'a duyarlı boyalar da kullanılabilir. Bu teknik, hücre içi vezikül membran rüptürünün aşağı yönlü etkilerini başlatmak için yararlıdır. Ve çeşitli durumlarda aşağı akış etkileri vardır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
AlPcS 2a aracılı kromofor destekli lazer inaktivasyonu (CALI), canlı hücrelerdeki hücre içi veziküllerin spasyotemporal hasarının araştırılmasında kullanılır. Bu teknik, hücre altı hasar üzerinde hassas kontrol sağlayarak vezikül yırtılmasının sonuçlarına dair içgörüler sunar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Nörobilim
- Canlı Hücre Görüntüleme
Arka Plan
- Endositoz, hücre içi veziküllerin oluşumuna yol açar.
- Veziküllerin geçirgen hale getirilmesi, çeşitli sinyal yolaklarını aktive eder.
- CALI, vezikül yırtılmasının etkilerini incelemek için kullanılan bir yöntemdir.
- Mekansal ve zamansal kontrol, ışık aydınlatması aracılığıyla sağlanır.
Çalışmanın Amacı
- Hücre içi vezikül hasarının dinamiklerini araştırmak.
- Vezikül yırtılmasıyla aktive olan sinyal yolaklarını anlamak.
- Canlı hücre etkileşimlerini inceleme tekniklerini geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- HeLa hücrelerinin %10 FBS içeren DMEM'de kültürü.
- Deney öncesinde hücrelerin PBS ile yıkanması.
- Analiz için hücrelerin tripsinizasyonu.
- Lokalize hasarı indüklemek için CALI uygulaması.
Ana Sonuçlar
- Vezikül hasarı üzerinde etkili kontrol sağlandı.
- Rüptür sonrası aktive olan temel sinyal yolakları belirlendi.
- Canlı hücre çalışmalarında CALI kullanımı doğrulandı.
- Vezikül fonksiyon mekanizmalarına dair bilgiler sunuldu.
Sonuçlar
- CALI, hücre içi dinamiklerin incelenmesi için değerli bir araçtır.
- Bulgular, vezikül ilişkili sinyal iletiminin anlaşılmasını geliştirmektedir.
- Gelecekteki çalışmalar, daha derinlemesine içgörüler elde etmek için bu yöntemler üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Kromofor destekli lazer inaktivasyonu (CALI), hücre içi vezikül yırtılmasının hassas, uzay-zamansal indüksiyonuna olanak tanıyarak membran permeabilizasyon olaylarını incelemek için kontrollü bir sistem sağlar. Bu yaklaşım, canlı hücrelerde endozomal ve lizozomal bütünlüğün seçici manipülasyonuna ve izlenmesine izin vererek mekanistik risk azaltma ve hedef doğrulamayı destekler. Yöntem, vezikül yırtılmasını aşağı akış sinyalleşmesine ve moleküler seçilime bağlayarak erken keşif aşamasındaki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Vezikül membran bütünlüğünün ve bunun sinyal yolaklarındaki rolünün doğrudan sorgulanmasına olanak tanır.
- Vezikül rüptürü üzerine galektin-3 gibi glikan bağlayıcı proteinlerin katılımının fonksiyonel validasyonunu destekler.
- Hedeflenmiş organel permeabilizasyonunun etkilerini izole ederek mekanistik risk azaltımını kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Vezikül yırtılmasını ve moleküler katılımı izlemek için kantitatif, görüntüleme tabanlı analizlerin geliştirilmesine yönelik bir platform sağlar.
- Membran permeabilizasyonunun kontrollü ve lokalize indüksiyonu yoluyla analiz standardizasyonunu destekler.
- Bileşiklerin endozomal ve lizozomal stabilite üzerindeki etkilerinin tekrarlanabilir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Vezikül bütünlüğünün hücresel sinyallemeyi ve patolojiyi etkilediği hastalıkla ilgili modellerle uyumludur.
- Vezikül yırtılmasının alt etkilerine yönelik çalışmalar mümkün kılarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği destekler.
- Hücresel yanıtlara ilişkin mekanistik içgörüler sağlayarak, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarını kolaylaştırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu fotodinamik yaklaşım, vezikül yırtılma olaylarının hipotez odaklı manipülasyonuna ve okunmasına olanak tanıyarak, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Vezikül permeabilizasyonunun sinyal iletimi ve protein seçilimi üzerindeki rolüne ilişkin hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Analiz geliştirme ve bileşik değerlendirme için kantitatif, tekrarlanabilir görüntüleme çıktıları sunar.
- Analitik: Karşılaştırmalı analizler için galektin-3 puncta oluşumu ve boya salınımı gibi ölçülebilir bitiş noktaları sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Mekanistik bulguları, vezikül yırtılmasının etkili olduğu hastalıkla ilgili hücresel modellerle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli hücre tipleri ve koşullar altında membran dinamiklerini incelemek için yeniden kullanılabilir, modüler bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Vezikül kaynaklı sinyalizasyon çalışmalarında öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir sonuçlar için vezikül yırtılmasının indüksiyonunu ve ölçümünü standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Membran permeabilizasyonunun fonksiyonel sonuçlarını netleştirerek devam/dur kararlarına veri sağlar.
- Portföy Etkisi: Vezikül bütünlüğünden etkilenen hedef ve yolakların risk ayarlı önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Canlı hücre görüntüleme ve fotodinamik manipülasyon konularında uzmanlık gerektirir.
- Konfokal mikroskopi ve lazer aydınlatma altyapısına erişim gereklidir.
- Görüntüleme ve analiz protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Uygun kontrollerle çeşitli hücre hatlarına ve organel belirleyicilerine uyarlanabilir.
- Tekrarlanabilirlik için lazer parametrelerinin ve boya konsantrasyonlarının hassas kalibrasyonuna bağlıdır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Transfection and AlPcS2a Staining
3:00
Sample Imaging and Light Illumination
3:47
Results: AlPcS2a-Mediated Chromophore‐Assisted Laser Inactivation for Studying patiotemporal Damage of Intracellular Vesicles in Live Cells
4:25
Conclusion
