Şizosakkaromices pombe'de Multicopy Suppressorların Tanımlanması için Genetik Ekran

Baskılayıcı ekranlar, ilgilenilen genin işlevlerine ve ayrıca in vivo olarak dahil olabilecekleri yollara ve biyolojik süreçlere ışık tutacak genetik etkileşimleri tanımlar. Bu teknik, diğer yaklaşımlar kullanılarak gösterilmemiş olabilecek iki gen ürünü arasındaki genetik ilişkiyi tanımlayabilir. Mayadaki bu tür eleklerin sonuçları yüksek ökaryotik organizmalara genişletilebilir, çünkü en temel biyolojik yollar ve süreçler evrim boyunca korunur.

Şemanın başarısı, maya hücrelerine dönüşümünün yüksek kalitesine, yüksek kalitesine ve yüksek verimliliğine bağlıdır. Böylece, plazmid ile transformasyon protokolü önce Şizosakkaromlar pombe ell1 delesyon suşu YE orta plaka üzerinde 32 santigrat derecede büyür. Plakadan ell1 mutant suşu ile dolu bir döngü alın, beş mililitre takviyeli YE ortamı aşılayın ve daha sonra gece boyunca 32 santigrat derecede sallanırken şişeyi inkübe edin.

Kuluçkadan sonra, 600 nanometrede 0.3 optik yoğunluğa ulaşmak için istenen takviyeleri içeren 100 mililitre taze YE ortamında gece büyüme kültürünü seyreltin. 600 nanometredeki optik yoğunluk orta kütük fazına ulaşana kadar 200 ila 550 RPM'de sallanırken ortamı 32 santigrat derecede inkübe edin. 100 mililitre kültürü iki adet 50 mililitrelik santrifüj tüpüne böldükten sonra, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4.000 kez G'de pelet edin.

Süpernatant atıldıktan sonra, hücre peletini bir mililitre steril suda yeniden askıya alın. Süpernatantı bir kez daha santrifüj yapın ve atın ve ardından hücre peletini bir mililitre lityum asetat TE içinde yeniden askıya alın. Hücreyi santrifüjleme ile pelet edin ve her hücre peletini 250 mikrolitre lityum asetat TE'de yeniden askıya alın. Daha sonra, sonraki dönüşüm adımları için yetkin hücrelerin 125 mikrolitresini dört farklı steril mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Somon testislerinden veya ringa balığı spermlerinden taşıyıcı DNA'yı bir dakika kaynatın ve tüpü hemen buzun üzerine yerleştirin.

Her dönüşüm için, yetkin hücrelerin 125 mikrolitresini içeren mikrosantrifüj tüpüne 10 mikrolitre tek sarmallı taşıyıcı DNA ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın. Daha sonra, yetkin hücreler ve taşıyıcı DNA karışımı içeren tüpe 50 mikrogram Schizosaccharomyces pombe cDNA kütüphanesi ekleyin. Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra, 260 mikrolitre polietilen glikol-lityum asetat çözeltisi ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.

Transformasyon karışımını içeren tüpü sallamadan iki saat boyunca 32 santigrat derecede inkübe edin. Tüpe 43 mikrolitre önceden ısıtılmış dimetil sülfoksit ekleyin ve yavaşça karıştırın. Şimdi, tüpü beş dakika boyunca 42 santigrat derecede ısı şokuna maruz bırakın.

Hücreleri pelet edin ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı atın ve ardından artık polietilen glikol lityum asetat TE çözeltisini pipetle çıkarın. Hücreleri 100 mikrolitre steril suda yeniden askıya alın ve gerekli takviyeleri ve mililitre başına 0.2 mikrogram 4-NQO'yu içeren bir EMM2 plakasına yerleştirin. Daha sonra, plakaları beş ila altı gün boyunca 32 santigrat derecede inkübe ederek kolonilerin plakalarda görünmesine izin verin.

Daha fazla tarama için, elde edilen kolonileri aynı orta plaka üzerinde, mililitre 4-NQO başına 0.2 mikrogram varlığında çizin. Bir kütüphane dönüşüm deneyi için, transformasyon için 500 mikrolitre yetkin hücre kullanın ve EMM2 plakasındaki dönüşüm karışımının 1'e 10'uncusu, transformasyondan sonra elde edilen kütüphane klonlarının toplam sayısını hesaplamak ve baskılayıcı klonları taramak için 4-NQO'dan yoksun gerekli takviyelerle plaka kullanın. Steril 96 delikli mikrotitre plakasının her bir kuyucuğuna 100 ila 200 mikrolitre steril su ekleyin.

Steril bir kürdan veya 20 ila 200 mikrolitrelik bir mikropipet ucu kullanarak, 4-NQO içeren plakada cDNA kütüphanesi dönüşümünden sonra elde edilen her koloniden az miktarda inokülum seçin. Farklı kolonilerin her birinden inokulumu steril su içeren plakanın her bir kuyucuğuna ekleyin ve iyice karıştırın. Her bir kuyucuktan hücre süspansiyonunun üç mikrolitresini EMM2 agar plakalarına tespit edin ve plakalara uygun konsantrasyonlarda 4-NQO ekleyin.

Hücreleri üç ila dört gün boyunca 32 santigrat derecede büyüttükten sonra, 4-NQO'nun farklı konsantrasyonlarında büyüme gösteren kolonileri varsayılan baskılayıcılar olarak tanımlayın. Baskılayıcıları daha da doğrulamak için, seçilen baskılayıcıları ve uygun kontrol suşlarını, mililitre başına 225 mikrogram adenin ve urasil içeren EMM2 ortamında, gece boyunca sallanarak 32 santigrat derecede büyütün. Kuluçkanın bitiminden sonra, hücreleri taze EMM2 ortamında 0.3 optik yoğunluğa kadar seyreltin ve orta kütük fazına kadar 32 santigrat derecede sallarken büyütün.

EMM2 plakalarındaki kültürlerin uygun seri seyreltmelerini, 0.4 mikromolar 4-NQO veya% 0.01 MMS içeren gerekli takviyelerle tespit edin. Kontrol için, gerekli takviyelerle bir EMM2 plakasındaki suşları tespit edin, ancak DNA'ya zarar veren herhangi bir ajandan yoksundur. Büyümeyi izlemek için plakaları üç ila beş gün boyunca 32 santigrat derecede inkübe edin.

Tam uzunluktaki ilgi geni veya boş vektör ile dönüştürülen mutant suşları, kütüphane dönüştürücüleri ile birlikte sırasıyla pozitif ve negatif kontroller olarak tespit edin. Mililitre adenin ve urasil başına 225 mikrogram içeren EMM2 ortamında tek bir maya kolonisini aşılayın ve hücreleri 200 ila 250 RPM'de sallayarak gece boyunca 32 santigrat derecede büyütün. Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında iki dakika boyunca 4.000 kez G'de santrifüj yaparak 10 mililitre optik yoğunluk 0.5 kültürünü hasat edin.

Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 0.2 mililitre lizis tamponunda yeniden askıya alın. Mikrosantrifüj tüpüne 0.2 mililitre fenol kloroform izoamil alkol ve 0.3 gram asitle yıkanmış cam boncuk ekleyin. Tüpü iki dakika boyunca vorteksleyerek karıştırın, ardından bir dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Tüpü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüj yapın. Üst sulu tabakayı taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 200 mikrolitre fenol kloroform izoamil alkol ekleyin. 10 dakika boyunca 10.000 kez G'de tekrar santrifüj yaptıktan sonra, üst sulu tabakayı taze bir tüpe aktarın.

Daha sonra, tüpe iki hacim% 100 etanol ve 1 x 10. hacim sodyum asetat ekleyin ve bir saat boyunca eksi 70 santigrat derecede inkübe edin. DNA'yı dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleme ile çökeltin ve süpernatanı çıkarın. DNA peletini% 70 etanol ile yıkayın ve oda sıcaklığında hava ile kurutun.

DNA'yı 20 mikrolitre steril suda yeniden askıya alın ve yetkin Escherichia coli hücrelerini dönüştürmek için üç ila beş mikrolitre plazmid DNA'sı kullanın. Standart protokolü kullanarak, izole edilmiş maya plazmidlerini Escherichia coli TOP10 suşuna dönüştürün ve hücreleri gerekli antibiyotiklerle LB plakalarına yayın. Plazmidi standart alkali lizis protokolünü kullanarak Escherichia coli transformanlarından izole ettikten sonra, kısıtlama sindirimi ile insert DNA fragmanının salınımını kontrol etmek için uygun kısıtlama enzimi kombinasyonlarını izleyin.

Daha sonra, ell1 delesyon suşunun genotoksik strese duyarlı fenotipini kurtarma yeteneklerini kontrol etmek için ell1 delesyon suşunda kısıtlama sindiriminden sonra kesici uç salınımını gösteren plazmidleri yeniden dönüştürün. Ell1-silinmiş Schizosaccharomyces pombe suşu, vahşi tip suşa kıyasla 4-NQO'ya karşı duyarlılık gösterdi. 4-NQO'dan yoksun plakada çok sayıda koloni elde edilir.

Bununla birlikte, 4-NQO plakasında, ell1 null mutantının 4-NQO duyarlılığının cezalandırıcı baskılayıcıları olarak hareket ettikleri için daha az dönüştürücü elde edilmiştir. 620 dönüştürücüden 74'ü 0.4-mikromolar 4-NQO'da büyüme gösterdi. 74 kişiden sadece 16'sının 0.8-mikromolar 4-NQO varlığında büyüme gösterdiği gözlendi.

Ell1 delesyon suşu boş bir vektörle dönüştü ve 16 dönüştürücünün tümü plakada 4-NQO'dan yoksun bir büyüme gösterdi. Sadece boş vektörü içeren ell1 delesyon mutantı 0.8-mikromolar 4-NQO'da büyüme göstermedi ve altı dönüştürücü 0.8-mikromolar 4-NQO'da büyüme gösterdi, bu da içlerinde bulunan kütüphane klonlarının ell1 null mutantının genotoksik stres fenotipini baskılayabileceğini düşündürdü. Baskılayıcı plazmid 84 ve 104'ün kısıtlama sindirimi, sırasıyla bir kilobaz ve 800 baz çiftinden oluşan bir ek salgıladı.

Baskılayıcı plazmid klonlarının ell1 null mutantına yeniden sokulması, 4-NQO ile ilişkili büyüme duyarlılığının baskılanmasıyla sonuçlandı. Bununla birlikte, MMS varlığında, ell1 delesyon mutantı içeren baskılayıcı plazmidler, boş vektöre sahip olanlardan daha fazla büyüme göstermiştir. Bu genetik taramalar potansiyel direnç mekanizmalarını tanımlayabilir ve yeni antibakteriyel, antifungal, antiparaziter veya antikanser bileşiklerinin protein hedeflerini tanımlayabilir.

Ayrıca farmasötik ilaçların etki mekanizmasını da tanımlayabilirler.