Name: Polarizasyon Mikroskobu ile Birleştirilmiş Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Karaciğer Sertliğinin Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Keşfedin karaciğer fibrozisinde kollajen açısından zengin bölgelerin elastik modüllerini ölçme yöntemini. Polarizasyon mikroskobu ile birleştirilmiş atomik kuvvet mikroskobu kullanarak yüksek uzamsal çözünürlükte biyomekanik analiz yapın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çek Cumhuriyeti Hibe Ajansı (18-02699S), Çek Bilimler Akademisi Kurumsal Araştırma Projesi (RVO 68378050) ve MEYS CR projesi NICR EXCELES (LX22NPO05102) tarafından desteklenmiştir. CIISB, MEYS CR altyapı projesi LM2018127 ve Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu-Projesi "UP CIISB" tarafından finanse edilen Instruct-ERIC AB konsorsiyumunun Instruct-CZ Merkezi (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974), CF Nanobiyoteknoloji, CEITEC MU'daki ölçümleri finansal olarak destekledi. Ayrıca, MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) ve RVO: 68378050-KAV-NPUI tarafından desteklenen Işık Mikroskobu Çekirdek Tesisi, IMG CAS, Prag, Çek Cumhuriyeti'ne de burada sunulan mikroskopi görüntülemeye verdikleri destek için teşekkür ederiz.

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Sunulan protokol, normal ve fibrotik fare karaciğer dokusunun AFM ölçümü için adım adım tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Birleştirilmiş polarizasyon mikroskobu, yüksek uzamsal hassasiyet sağlar ve kollajen liflerinin çift kırılmaları nedeniyle görselleştirilmesini sağlar. Ayrıca, elde edilen kuvvet eğrilerinin analizinin ayrıntılı bir açıklaması sağlanmaktadır. AFM sertlik ölçümü hücresel düzeyde yapılabilir, bu da gelişen fibrotik hastalığa bağlı olarak karaciğer dokusunun mekanik özelliklerindeki lokal değişikliklerin izlenmesini sağlar. Karaciğer fibrozisi tüm organı etkileyen homojen bir süreç değildir. Aksine, kollajen bakımından zengin fibrotik septa alanları, düşük kollajen birikintisi olan veya hiç olmayan alanlarla serpiştirilir. Bu nedenle, sertlik değişiklikleri yerel mikro çevreye özgüdür ve yalnızca yaralanmadan zarar gören bölgelerle temas halinde olan hücreleri lokal olarak etkiler. Bu mikro sertlik heterojenliği, AFM Young'ın modül haritalarının ayrıntılarında da belirgindir; burada yüksek sertlik noktaları neredeyse normal sertlik alanlarını sınırlar. Bu varyasyon, kollajen skar dokusu alanının bile mekanik olarak homojen olmadığını ve AFM ölçümünün hücresel düzeyde karakterize edilmesini gerektirdiğini göstermektedir (Şekil 4).
Sunulan protokol, karaciğer koleksiyonundan bağımsız olarak AFM tarafından karaciğer sertliğinin ölçülmesine izin verir, çünkü OKT'ye gömülü tüm karaciğer lobları -80 ° C'de uzun bir süre saklanabilir. Bununla birlikte, doku kesitlendikten sonra, daha uzun süre saklanan doku kesitlerinin kademeli olarak yumuşadığını gözlemlediğimiz için numuneleri ~ 2 hafta içinde ölçmenizi öneririz (Şekil 5).
Polarizasyon mikroskobu ile donatılmış AFM, karaciğer lobül yapısı içindeki ilgi alanının tam olarak konumlandırılmasını sağlar. Bununla birlikte, sonuçları yorumlarken göz önünde bulundurulması gereken bazı sınırlamaları da vardır. Burada elde edilen sertlik değerleri oda sıcaklığında ölçülmüştür. Sıcaklığın yumuşak dokunun mekanik özellikleri üzerindeki etkilerinin küçük olacağını varsayıyoruz; ancak karaciğer dokularının mekanik özelliklerinin bildirilen in vivo değerleri ile bu çalışmadaki değerler arasındaki farklılıkların nedenlerinden biri de bu olabilir.
Ayrıca, bu protokol, karaciğer dokusunun AFM analizine 3 saate kadar izin verir ve bu da dokunun hafif fiksasyonunu gerektirir. Doku kesitlerinin hafif fiksasyonu ve donma-çözülme döngüsü, büyük olasılıkla Young modülünün mutlak değerlerini etkileyecektir. Bu nedenle, Young modülünün bildirilen değerleri in vivo değerlerden farklı olabilir. Young modülünün mutlak değerlerinin karaciğer bölümlerinden ölçülmesi için protokolü optimize etmek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır, bu da karaciğer dokusunun sabitlenmesi için farklı bir yöntemle elde edilebilir64.
Bununla birlikte, CCl4 ile tedavi edilen farelerin karaciğerlerinde kollajen bakımından zengin alanların sertliğinin 3 hafta boyunca 6 haftaya kıyasla arttığını gözlemledik. Bu tür değişiklikler, uzun süreli yaralanma sırasında fibroz ilerlemesine karşılık gelir (Şekil 4) ve sunulan protokol kullanılarak farklı tedaviler arasında göreceli farklılıkların araştırılabileceğini göstermektedir. Bu, hafif sabit karaciğer kesitlerinin, taze doku25'te olduğu gibi kollajen bakımından zengin ve kollajen eksikliği olan alanlar arasındaki sertlik değerlerinde benzer farklılıklar gösterdiğini gösteren Calò ve ark.'nın gözlemleriyle uyumludur.
Ölçümler sırasında karaciğer dokusunun mekanik bozulmasını en aza indirmek için 5.7 μm çapında küresel bir uç ile modifiye edilmiş SD-qp-BioT-TL-10 konsolunu (teorik yay sabiti ~ 0.09 N / m) kullandık. 5,7 μm'lik bir boncuk, bütünlüğünü korurken sertliğini araştırmak için numunenin yeterli girintisini sağladı. Daha küçük çaplı bir boncuk, birkaç optimizasyondan sonra, sertlik haritalarında daha yüksek çözünürlük elde etmek için kullanılabilir, ancak Young'ın modül değerlerinin daha fazla abartılmasına neden olabilir (daha fazla ayrıntı için bkz. Belirtilen konsol-boncuk topluluğunu kullanarak, numune sertliğini onlarca Pa biriminden ~ 100 kPa'ya kadar geniş bir aralıkta karakterize edebildik.
Sneddon'un modeli, Young'ın modülünü kuvvet eğrilerinden türetmek için kullanıldı, çünkü kolloidal problarla derin girintilerin analizine izin veriyor62. Sneddon'un modeli, Hertz'in modelinden farklı olarak, temas yarıçapının küre yarıçapından çok daha küçük olması gerektiği kısıtlamasından muzdarip değildir. Ayrıca, numune kalınlığının girinti derinliği 30,66'dan birkaç kat daha büyük olduğunu varsayar. Bu çalışmada, kollajen bakımından zengin bölgelerde girinti ~2 μm, boncuk boyutu 5.7 μm ve örnek kalınlığı 30 μm idi; bu nedenle Sneddon'un modeli uygundu. Diğer modeller63 uç ve substrat arasındaki yapışma kuvveti göz önüne alındığında farklı doku tipleri için kullanılabilir.
AtomicJ'deki analiz, Young modülü62,67'yi türetirken bir substratın katkısını en aza indirmek için numunelerin sonlu kalınlığı için düzeltmeler uygular. Elde edilen kuvvet eğrilerinin analizinde, daha önce yumuşak doku organları için önerilen 0.45'lik tek bir Poisson oranı kullandık24. Bu yaklaşımın Young modülünün hesaplanan değerleri üzerinde önemli bir etkisi yoktur, çünkü Poisson oranının 0.4'ten 0.5'e olan değerindeki değişim, Sneddon'un denklemine göre hesaplanan Young modül değerlerinde yalnızca 0.893x azalmaya neden olur. CCl4 tedavilerinin farklı süreleri arasındaki Young modülündeki çok katlı farklılıklar göz önüne alındığında, Poisson'un oranına yaklaşarak üretilen hatalar sadece marjinaldir.
Sertlik değerlerini hesaplamak için geri çekilme eğrilerini kullandık, çünkü girinti68'e plastik tepkiden ziyade dokunun konsol tarafından sağlanan yüke elastik tepkisiyle ilgileniyorduk. Yumuşak dokunun viskoelastik tepkisi nedeniyle, uygun geri çekilme eğrileri, akılda tutulması gereken Young modülünü abartabilir. Ayrıca, yaklaşım eğrileri ile veri analizinin, fibrotik ve kontrol alanları arasındaki sertlik değerlerinde benzer eğilimler ortaya koyduğunu, ancak mutlak değerlerin buna karşılık olarak daha düşük olduğunu gözlemledik (veriler gösterilmemiştir).
Protokolü optimize ederken, ölçümlerin tekrarlanabilirliği için kritik olan birkaç adım belirledik. İlk olarak, konsola takılırken boncuğun yaklaşık olarak yarı saydam ucun merkezinde olmasını sağlamak önemlidir. Bu, girinti sırasında olası mekanik dengesizliği önler. İkincisi, PFA ile karaciğer fiksasyonu sırasında, çözülme ve fiksasyon için zaman sınırlarını kesinlikle takip etmek gerekir. Bu adımın zamanlamasını değiştirmek, doku kesitlerinin mekanik özelliklerini ciddi şekilde etkileyebilir. Üçüncüsü, sıcaklık dalgalanmaları nedeniyle sertlik değerlerinde herhangi bir artefaktın oluşmasını önlemek için konsol sürekli izleme ve eşzamanlı sıcaklık değerlerinin girilmesi ile tekrar tekrar kalibre edilmelidir. Son olarak, tek bir karaciğer bölümü, hazırlıktan 3 saatten daha uzun bir süre boyunca ölçülmemelidir, çünkü üst üste binmiş PBS daha uzun süreler boyunca buharlaşabilir. Okuyucular, AFM ölçümü sırasında karşılaşılan sorunları çözmek için sorun giderme tablosuna (Tablo 3) başvurabilir, ayrıca Norman ve ark.46'da da uzun uzadıya tartışılmıştır.
Tablo 3: Sorun giderme kılavuzu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%203v2.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Sunulan protokol, karaciğer dokusunun tekrarlanabilir AFM problanmasına izin verir. Fibrotik karaciğer hastalığının gelişimi ve nihayetinde gerilemesi hakkında mikroskobik düzeyde bilgi verme potansiyeline sahiptir ve kronik karaciğer hastalığının ilerlemesi sırasında oluşan fibrotik skar bölgelerini hedef alan tedavilerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.

Karaciğer, organizmalarda homeostazı korumak için hayati bir organdır 1,2. Kronik karaciğer hastalıkları dünya çapında yılda ~ 2 milyon ölümden sorumludur3. En sık viral enfeksiyonlar, otoimmün bozukluklar, metabolik sendromlar veya alkol kötüye kullanımı ile ilişkili hastalıklar olarak ortaya çıkarlar ve ilerleyici karaciğer fibrozisi eşlik ederler. Karaciğer hasarı, yara iyileşmesi yanıtında hücre dışı matriks (ECM) biriktiren hücrelerin aktivasyonuna yol açan enflamatuar bir yanıt ortaya çıkarır. Bununla birlikte, kronik bir hakaret varlığında, aşırı ECM karaciğerde çözülmemiş skar dokusu oluşturur ve karaciğer fibrozu, siroz, karaciğer karsinomu ve nihayetinde karaciğer yetmezliğinin gelişmesine yol açar4.
Hepatosit hasarı hemen artmış karaciğer sertliğiile sonuçlanır 5,6. Bu, hepatosit fonksiyonunu doğrudan etkiler, hepatik yıldız hücrelerini (HSC'ler) ve portal fibroblastları aktive eder ve kollajen biriktiren miyofibroblastlara transdiferansiyasyonlarıyla sonuçlanır 7,8. Fibröz ECM'nin birikmesi, karaciğer sertliğini daha da arttırır ve karaciğer sertleşmesi ve matris üreten hücre aktivasyonunun kendiliğinden güçlenen bir geri besleme döngüsü oluşturur.
Bu nedenle karaciğer sertliği karaciğer hastalığı prognozunda önemli bir parametre haline gelmiştir. Biyomekanik doku özelliklerindeki değişiklik, fibrozisin histolojik analiz ile teşhis edilebilmesinden daha erken tespit edilebilir. Bu nedenle, karaciğer sertliği ölçümü için hem araştırma hem de klinik uygulamalarda çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Klinik ortamlarda, geçici elastografi (TE)9,10,11,12,13 ve manyetik rezonans elastografi (MRE)14,15,16,17,18, brüt karaciğer sertliğini inceleyerek karaciğer hasarının erken evrelerini non-invaziv olarak teşhis etmek için kullanılmıştır 19.
TE'de, hafif genlikli ve düşük frekanslı (50 Hz) ultrason dalgaları karaciğerden yayılır ve hızları ölçülür, bu da daha sonra doku elastik modülü13'ü hesaplamak için kullanılır. Bununla birlikte, bu teknik, ultrason dalgalarının karaciğeri çevreleyen dokulardan yanlış iletilmesi nedeniyle asit, obezite veya daha düşük interkostal boşlukları olan hastalar için yararlı değildir9.
MRE, manyetik rezonans görüntüleme yöntemine dayanır ve karaciğeri hedeflemek için 20-200 Hz mekanik kesme dalgaları kullanır. Daha sonra doku içindeki dalgaları izlemek ve doku sertliğini hesaplamak için spesifik bir manyetik rezonans görüntüleme dizisi kullanılır16. Hem TE hem de MRE teknikleri ile bildirilen sertlik değerleri, histolojik METAVIR skorları20 kullanılarak sıralanan insan karaciğer örneklerinin biyopsilerinden elde edilen karaciğer fibrozisinin derecesi ile iyi korelasyon göstermektedir (Tablo 1). TE ve MRE ayrıca araştırma amaçlı kemirgen modellerinde karaciğer sertliğinin ölçülmesi için uyarlanmıştır21,22,23. Bununla birlikte, her iki yöntem de sertlik değerlerini dokunun yayılan kesme dalgalarına verdiği tepkiden türettiği için, elde edilen değerler dokunun mutlak mekanik sertliğini yansıtmayabilir.
Kemirgen karaciğerlerinin doğrudan mekanik karakterizasyonu için Barnes ve ark., karaciğer dokusunun poliakrilamid jel24'e gömülmesini içeren bir model-jel-doku testi (MGT testi) geliştirmiştir. Bu jel, Young modülünün hesaplanabileceği darbeli bir üniform kuvvetle sıkıştırılır. MGT testi, hem normal hem de fibrotik karaciğerler için uyarlanmış bir girinti testi ile iyi bir korelasyon göstermektedir24 (Tablo 1).
Tablo 1: Toplu düzeyde karaciğer sertlik değerleri. TE ve MRE, farklı kaynaklardan gelen karaciğerler için girinti ve MGT testleri kullanılarak karaciğer elastik modüllerinin doğrudan ex vivo mekanik ölçümleriyle karşılaştırılmıştır. E ve G arasındaki ilişki E = 2G (1 + v) ile verilir, burada v , Poisson'un numunenin oranıdır; F0 ila F4, METAVIR skorlama sistemindeki fibroz skorunu temsil eder, F0 düşük fibroz veya hiç fibroz ve F4 sirotik karaciğerleri gösterir. Kısaltmalar: TE = geçici elastografi; MRE = manyetik rezonans elastografi; MGT = model-jel-doku; E = elastik (Young's) modülü; G = kesme modülü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%201v2.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Jenerik karaciğer sertliği ölçümlerinin en büyük dezavantajlarından biri, karaciğerdeki sertlik heterojenliğinin hücresel düzeyde çözünürlüğünü sağlamamalarıdır. Fibrozisin ilerlemesi sırasında, kollajen bakımından zengin alanlar, çevredeki parankim 25,26'ya kıyasla daha yüksek sertlik gösterir. Bu sertlik gradyanı lokal olarak yerleşik hücreleri etkiler ve HSC heterojenitesinin yönlendirilmesinde önemli bir rol oynar27. Bu nedenle, karaciğer hastalığı gelişimi sırasında lokal mekanik özelliklerdeki değişikliklerin, fibroz progresyonunu daha iyi anlamak için mikroskobik düzeyde karakterize edilmesi gerekir.
AFM, dokunun mekanik özelliklerinin yüksek çözünürlük ve yüksek kuvvet hassasiyeti ile ölçülmesini sağlar. AFM, bir numunenin yüzeyini birkaç pikonewton kadar düşük kuvvetlerle girintilemek için bir konsol ucunu kullanır ve kullanılan ucun geometrisine ve boyutuna bağlı olarak mikroskobik veya nanoskopik düzeyde bir deformasyona neden olur. Numunenin uygulanan gerinime kuvvet tepkisi daha sonra konsol28'deki sapma olarak ölçülür. Kuvvet-yer değiştirme eğrileri, numunenin yerel sertliğini değerlendirmek için uygun temas mekaniği modelleriyle donatılabilen konsol29'un yaklaşımından ve geri çekilmesinden toplanır.
Belirli bir alanın sertliğini ölçmenin yanı sıra, AFM, kollajen liflerinin yapısı30,31,32 gibi numunedeki belirli özellikler hakkında topografik bilgiler de sağlayabilir. Birçok çalışma, hem hasta hem de fare model örneklerinden cilt 32,33, akciğer 34,35, beyin 36, meme37,38,39, kıkırdak 40 veya kalp 41,42,43,44 gibi çeşitli sağlıklı ve hastalıklı dokuların sertliğini ölçmek için AFM'nin uygulanmasını tanımlamıştır. Ayrıca, AFM, hücrelerin sertliğini ve hücre dışı protein iskeleleri45,46,47'yi belirlemek için in vitro olarak da kullanılmıştır.
AFM kullanılarak biyolojik numunelerin mekanik özelliklerinin ölçülmesi, yumuşaklıkları ve kırılganlıkları nedeniyle önemsiz değildir. Bu nedenle, çeşitli çalışmalar, Young modüllerinin geniş çapta dalgalanan değerlerini veren farklı koşulları ve ortamları standartlaştırmıştır (Mckee ve ark.48 tarafından gözden geçirilmiştir). Diğer yumuşak dokulara benzer şekilde, karaciğer fibrozisinin farklı derecelerindeki karaciğer Young modül değerleri de geniş farklılıklar göstermektedir (Tablo 2). Young modül değerlerindeki farklılıklar AFM çalışma modu, konsol ucu, numune hazırlama yöntemi, numune kalınlığı, girinti derinliği ve kuvvetleri, ölçüm sırasında karaciğer dokusu ortamı ve analiz yöntemindeki farklılıklardan kaynaklanmaktadır (Tablo 2).
Tablo 2: Hücresel düzeyde karaciğer sertlik değerleri. AFM kullanılarak elde edilen karaciğer sertliği değerleri, karaciğerin hücresel düzeyde mekanik özelliklerini tanımlar. Kısaltmalar: AFM = atomik kuvvet mikroskobu; E = elastik (Young's) modülü; PFA = paraformaldehit; PBS = fosfat tamponlu salin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table%202v2.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Bu yazıda, Young'ın karaciğer dokusundaki kollajen bakımından zengin fibrotik alanların modüllerinin AFM ile tekrarlanabilir ölçümü için polarizasyon mikroskobu kullanılarak sağlanan kesin bir lokalizasyon ile bir protokol açıklanmaktadır. Bir fare modelinde sentrilobuler bir tarzda49 kollajen birikimini indüklemek için karbon tetraklorür (CCl4 ) uyguladık ve insan karaciğer fibrozu50'nin önemli yönlerini güvenilir bir şekilde taklit ettik. Polarize mikroskobik görüntüler, kollajen liflerinin birefringencesi nedeniyle karaciğerdeki kollajenin görselleştirilmesini sağlar51, bu da konsol ucunun hepatik lobül52 içindeki istenen ilgi alanı üzerinde doğru bir şekilde konumlandırılmasını sağlar.

<table><tbody><tr><td>AFM head</td><td>Bruker</td><td>JPK nanowizard 3</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Andor</td><td>Zyla 5.5 USB (sCMOS, su soğutmalı)</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Görüntüleme kaynağı&nbsp;</td><td>S/N:12310015</td><td></td></tr><tr><td>Konsol</td><td>SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensörler</td><td>S/N:73750F05</td><td></td></tr><tr><td>Kriyotom</td><td>Leica&nbsp;</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Epoksi reçine tutkalı (Uzun çalışma süresi)</td> <td>Bison epoksi üniversal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Melamin boncuklar; çap, 5.7 um</td><td>Mikropartiküller, GmbH</td><td>MF-R-5.7</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>&nbsp; IX81</td><td></td></tr><tr><td>Hidrofobik ve nbsp; slayt işaretleyici</td><td>SuperHT</td><td>PAP PEN</td><td></td></tr><tr><td>Yazılımı</td><td>JPK nanowizard&nbsp; v6.1.151</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>AtomicJ v2.3.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost slaytları</td><td>Termobilimsel</td><td>ref no. J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Sistemi</td><td>Ubuntu 14.04.5 LTS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Titreşim izolasyon kontrolü birim</td><td>Tablestable</td><td>AVI-200-S</td><td></td></tr></tbody></table>

polarizasyon mikroskobu ile birleştirilmiş atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak karaciğer sertliğinin Ölçülmesi

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Matriks sertleşmesi, karaciğer fibrozisinin ilerlemesinin temel itici güçlerinden biri olarak kabul edilmiştir. Hücre fonksiyonu, farklılaşma ve hareketlilik gibi hücre davranışının çeşitli yönleri üzerinde derin etkileri vardır. Bununla birlikte, bu süreçler tüm organ boyunca homojen olmadığından, dokuların hücresel düzeyde mekanik özelliklerindeki değişiklikleri anlamak giderek daha önemli hale gelmiştir.
Karaciğer loblarındaki kollajen bakımından zengin alanların sertleşmesini izleyebilmek için, bu makale karaciğer dokusu elastik modüllerini atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile yüksek uzamsal hassasiyetle ölçmek için bir protokol sunmaktadır. AFM, Young'ın (elastik olarak da adlandırılır) modülü olarak hesaplanan yerel mekanik özellikleri karakterize etme potansiyeline sahip hassas bir yöntemdir. AFM, polarizasyon mikroskobu ile birleştiğinde, dokulardaki kollajen liflerinin birefringansına dayanan fibroz gelişim alanlarını spesifik olarak bulmak için kullanılabilir. Sunulan protokolü kullanarak, fibrotik fare karaciğerlerinden ve kontrol farelerinin karaciğerlerindeki karşılık gelen alanlardan kollajen bakımından zengin alanların sertliğini karakterize ettik.
Fibroz gelişimi ile kollajen pozitif alanların sertliğinde belirgin bir artış gözlendi. Sunulan protokol, hafif sabit karaciğer dokusunun kullanımı nedeniyle, lokal doku mekanik özelliklerinde hastalık tarafından başlatılan değişikliklerin ve bunların komşu hücrelerin kaderi üzerindeki etkilerinin daha iyi anlaşılması için kullanılabilecek, yüksek oranda tekrarlanabilir bir AFM ölçüm yöntemine izin verir.

Kontrol farelerinden ve hafif veya ileri fibrozlu farelerden (sırasıyla 3 hafta veya 6 hafta boyunca CCl4 enjeksiyonu ile indüklenen, sırasıyla49) elde edilen hafif sabit, 30 μm kalınlığındaki karaciğer kesitleri, bu protokolde açıklandığı gibi AFM ile incelendi. Sertlik haritalarının ölçümü için santral damarlara yakın kollajen lifleri seçildi. CCl4 ile tedavi edilen hayvanlarda genellikle kollajen liflerinin oluştuğu alanlara karşılık gelen merkezi damarlara yakın alanlar, kontrol karaciğerlerinde analiz edildi (Şekil 4A). Young modülünün dağılımı, tek bir karaciğer kesiti içindeki farklı kontrol karaciğerleri ve kollajen bakımından zengin alanlar arasında tekrarlanabilirdi (Şekil 4B: sol keman grafiği).
CCl 4 ile muamele edilmiş hayvanlarda, kollajen birikintilerinin perisantral alanlarına karşılık gelen sertlik haritaları, kontrol farelerindeki eşdeğer alanlara kıyasla Young modülünün anlamlı derecede daha yüksek değerlerini göstermiştir (Şekil 4B: 1.9 kPa'ya karşı 2.6 kPa medyan Young'ın kontrol modülü değerleri vs 3 hafta CCl 4 ile muamele edilmiş fare; p = 0.07; 1.9 kPa vs 5.1 kPa medyan Young'ın kontrol modülü değerleri vs 6 hafta CCl4 -tedavi edilmiş fare; p = 0.02). Ayrıca, daha uzun CCl 4 tedavisi ile Young modülünün değerlerinde anlamlı bir artış vardı (Şekil 4B; 2.6 kPa'ya karşı 5.1 kPa medyan Young modül değerleri 3 hafta boyunca 6 hafta CCl4 ile tedavi edilen fare; p = 0.04). Bu, fibroz ilerlemesi ile kollajen birikintilerinin kademeli olarak sertleştiğini ve AFM ölçümlerinin fibrogenezi yansıttığını göstermektedir.
OCT-gömülü karaciğer kesitlerinin uzun süreli depolanmasının kollajen liflerinin mekanik özellikleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için, CCl4 ile muamele edilmiş farelerin bölümlerinde, kesildikten sonra slaytta 2 hafta veya 3 ay boyunca -80 ° C'de saklanan kollajen liflerinin sertliğini ölçtük (Şekil 5). AFM ölçümleri, 3 ay boyunca saklanan bölümler için kollajen bakımından zengin alanlarda Young modülünün değerlerinin, numune kesitinden sonraki 2 hafta içinde ölçülen bölümlerden elde edilenlere kıyasla anlamlı derecede daha düşük olduğunu göstermiştir (Şekil 5; 4.7 kPa'ya karşı 3.6 kPa medyan Young'ın modül değerleri 2 hafta boyunca 3 aylık depolamaya karşı; p &lt; 0.001). Bu nedenle, OCT-gömülü karaciğer loblarından bölümler hazırlandıktan kısa bir süre sonra karaciğer dokusunun mekanik özelliklerini ölçmek önemlidir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg"> Şekil 4: AFM ölçümleri, uzun süreli CCl4 tedavisi ile ilişkili kollajen bakımından zengin alanların ilerleyici sertleşmesini ortaya koymaktadır. (A) Kollajen bakımından zengin alanların mekanik özelliklerini ölçmek için kontrol farelerinden ve CCl4 ile 3 hafta veya 6 hafta boyunca tedavi edilen farelerden karaciğer bölümleri kullanılmıştır. Polarize mikroskopi görüntülerinde (solda) gösterilen karaciğer bölümlerinin kutulu alanları, AFM ölçümleri için seçilen kollajen bakımından zengin tarama alanlarıdır (veya kontrol karaciğerindeki karşılık gelen bölgeler) (30 μm x 100 μm, 10 piksel x 36 piksel). Bu kutulu alanlara karşılık gelen renk ölçeklerine sahip Young'ın modül haritaları, bu haritalardan Young'ın modül değerlerinin histogramları da dahil olmak üzere sağda gösterilmiştir; iç dağılım grafikleri her koşul için &gt;10 kPa değerlerini gösterir. Karaciğerin sertleşmesi, histogram dağılımında kademeli olarak sağa doğru bir kayma ve iç saçılma grafiğinde daha yüksek bir nokta frekansı olarak görselleştirilir. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) Keman grafikleri, her koşul için ölçülen üç alandan elastik modüllerin dağılımını gösterir (solda) ve her üç haritadan da özetlenmiş elastik modül değerleri (sağda). Keman grafikleri medyan (kırmızı çizgi), 25. yüzdelik dilim ve 75. yüzdelik dilimi (siyah çizgiler) gösterir; noktalar, 1-3 arasındaki alanlardaki tek tek haritaların ortalama değerlerini temsil eder. Sunulan p-değerleri, bir Öğrencinin araçlar üzerinde yapılan t-testi kullanılarak hesaplanmıştır. Kısaltmalar: AFM = atomik kuvvet mikroskobu; CCl4 = karbon tetraklorür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg"> Şekil 5: Karaciğer bölümlerinin uzun süre depolanması, kollajen bakımından zengin alanların sertliğinde bir azalmaya yol açar. Young modülünü ölçmek için 2 hafta veya 3 ay boyunca -80 ° C'de depolanan karaciğer bölümleri (2 hafta boyunca CCl4 ile tedavi edilen farelerden hazırlanmıştır) kullanılmıştır. AFM ölçümü için kullanılan kolajen bakımından zengin alanları gösteren kutular içeren polarize mikroskopi görüntüleri (solda) (30 μm x 100 μm, 10 piksel x 36 piksel). Karşılık gelen Young modülü renk ölçekleriyle eşlenir (sağda). Histogramlar, her örnekte 4-6 alandan toplanan Young modül değerlerini gösterir; iç dağılım grafikleri, her koşul için &gt;10 kPa değerlerini gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Kısaltmalar: AFM = atomik kuvvet mikroskobu; CCl4 = karbon tetraklorür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S1: Bir melamin reçinesi mikro boncuk ile konsol değiştirme yöntemi. (A) Çizilmiş şematik, küresel bir boncuğun konsol ucuna tutturulmasını gösterir. Adım adım açıklama için bkz: Bölüm 2, Bölüm 1, AFM konsol ucuna 5,7 μm boncuk takılması. (B) Konsol ucuna tutturulmuş küresel 5,7 μm boncuğun mikroskopi görüntüsü, üstten (solda) ve yanal görünümden (sağda) gösterilmiştir. Ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltmalar: AFM = atomik kuvvet mikroskobu; RT = oda sıcaklığı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil S2: AtomicJ'de veri analizi. (A) AtomicJ'de sertlik haritalarının açılması için izlenecek adımlar dizisi. İşlem kuvveti eğrilerine ve haritalarına (x) tek bir sol tıklama işlem yardımcısını açar. Dosyalar, ekle (y) düğmesine tıklayarak ve gerekli dosyaları seçerek işlem asistanına yüklenebilir. Bir sonraki adıma geçmek için sonraki (z) düğmesine tıklayın. (B) Eğri uydurma parametreleri, uygun temas mekaniği modeli ve ölçüm sırasında kullanılan AFM ayarları. Adım 1-11, protokol adım 3, Bölüm 5, Veri analizinde ayrıntılı olarak açıklanan ilgili alt noktalara başvurur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil S3: AtomicJ'de analiz edilen verilerin ana hatları. Analiz edilen verilerin önizlemesi sertlik haritalarını (sol üst pencere), kuvvet eğrilerini (sağ üst pencere) ve ham verileri (alt pencere) gösterir. Kısaltma: AFM = atomik kuvvet mikroskobu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Normal ve hastalıklı karaciğerde kollajen bakımından zengin alanların elastik modüllerini atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Polarizasyon mikroskobunun eşzamanlı kullanımı, karaciğer bölümlerinde kollajen bakımından zengin alanların lokalizasyonu için yüksek mekansal hassasiyet sağlar.

Polarizasyon Mikroskobu ile Birleştirilmiş Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Karaciğer Sertliğinin Ölçülmesi

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Protokolümüz, karaciğer bölümlerinde kollajen bakımından zengin ve kollajen eksikliği olan alanlar arasında bir ayrım sağlar. Böylece fibrogenez süreçlerini daha ayrıntılı olarak incelemek için kullanılabilir. Tekniğin temel avantajı, karaciğer bölümlerinde kollajen bakımından zengin alanları bulmak için polarize mikroskopinin kullanılmasında yatmaktadır.Protokollerimiz karaciğer fibrozisinin gelişimi hakkında büyük bir fikir verebilir ve bazı optimizasyonlardan sonra akciğerler gibi diğer yumuşak dokular için de benimsenebilir. Başlamak için, donmuş karaciğer bölümlerini eksi 80 santigrat dereceden çıkarın ve iki dakika boyunca oda sıcaklığında çözün. Bölümleri PBS'de% 4 paraformaldehit ile buz soğukluğunda% 4 paraformaldehit ile dört santigrat derecede 10 dakika sabitleyin, ardından PBS ile beş kez yıkayın.Son yıkamadan sonra, karaciğer bölümünün etrafındaki fazla PBS'yi doku kullanarak silin ve karaciğer bölümünün etrafında yaklaşık iki x dört santimetrelik bir sınırı hidrofobik bir işaretleyici kalemle işaretleyin. Numuneyi PBS ile örtün, ardından numuneyi AFM aşamasına yükleyin ve AFM kafasıyla örtün. Atomik kuvvet mikroskobu veya AFM yazılımında, kurulum sekmesine gidin ve tüm dosyaları otomatik olarak kaydetmek için otomatik kaydetmede bir onay işareti işaretleyin.Ardından, ayarlar sekmesine gidip ayarları kaydetmeye tıklayarak ölçüm dosyalarının kaydedileceği dosya adını ve dizini belirtin. Lazeri açıp yaklaşım tuşuna tıklayarak AFM konsoluyla doku yüzeyine yaklaşın. Yaklaşım tamamlandıktan sonra, konsol ucunu piezo aralığının üst ucuna geri çeken geri çekme tuşuna bir kez tıklayarak geri çekin.Gerekirse, AFM kafasındaki düğmeleri kullanarak dedektörü yeniden hizalayın. Lazeri kapatın. İpucu şimdi hedefin odak noktasında.Ardından, aksesuarlar sekmesine tıklayarak ve doğrudan bindirme optik kalibrasyonunu seçerek mikroskopun optik alanını AFM ölçüm haritalarıyla kaplayın. Sonraki pencerede, belirli bir alanı tarayan konsol görüntüsünün bir dizi görüntüsünü çekmek için ilerisini tıklatın. Sonraki pencereye gitmek için İleri'yi tekrar tıklatın.İlk görüntüde, yazılımdaki uç konumunu göstermek için konsol ucunun ucunun ortasına manuel olarak tıklayın. Uç konumunu gösteren daire, doğruluğu artırmak için yarıçapı belirtilerek boyut olarak manipüle edilebilir. Tüm görüntülerdeki konsol ucu konumunu otomatik olarak algılamak için kalibre et'i tıklatın.Görüntüleri inceleyerek uç algılamanın doğruluğunu onaylayın. İleri'yi tıklatın ve optik kaplamayı bitirmek için bitirin. Ardından, polarize görüntüyü kullanarak veri görüntüleyici sekmesinde görülebilen yeşil kutunun içine kolajen bakımından zengin bir alan yerleştirmek için sahne alanını hareket ettirin.Kılavuz sekmesinin altındaki alanı tanımlayarak kolajen bakımından zengin alanı seçin ve ardından belirtilen yeşil kutunun içindeki sol fare düğmesine uzun basarak veri görüntüleyici sekmesinde bir dikdörtgen oluşturun. Seçilen alanı ölçüm alanı olarak ayarlamak için yeni tarama bölgesini onayla'ya tıklayın. Geri bildirim döngüsünün parametrelerini ayarlayın.I kazanç değerini 50 hertz'de ve P kazancını 0,001'de ayarlayın. Ardından ayar noktasını bir nano Newton'a ayarlayın. İncelenen malzemelerin mekanik özelliklerine ve konsol sertliğine göre göreceli ayar noktası değerini seçin.Kuvvet eğrilerini düzgün bir şekilde sığdırmak için adil bir taban çizgisi belirtin. Ardından, numunenin yüzey topografyasına göre Z eksenindeki konsol hareketinin uzunluğunu seçin. Z hareketini sabit süreye ayarlayın.Uzatma ve geri çekme gecikmeleriyle uzatma süresini bir saniyeye ayarlayın. Örnekleme hızını 5.000 hertz olarak ayarlayın. Ölçümler sırasında numune ile konsol ucu arasındaki mesafeyi otomatik olarak ayarlamak için Z kapalı döngüsünün önünde bir onay işareti işaretleyin.Ardından, devreye alma düğmesinin seçimini kaldırarak motorlu kademe kontrolünü devre dışı bırakın. Lazeri açın ve numuneye konsolla yaklaşın. Kuvvet mesafesi eğrilerini toplamak için taramayı başlat'a tıklayın.Açık kaynaklı yazılım AtomicJ'yi kullanarak elde edilen verileri analiz edin. İşlem kuvveti eğrileri ve haritaları simgesine tıklayarak kuvvet eğrilerini programa yükleyin. Ardından işlem asistanında, ekle düğmesine tıklayarak analiz edilecek haritaları ekleyin.Haritalar yüklendikten sonra İleri'ye tıklayın. Bir sonraki pencerede işleme ayarlarını belirtin. Bir dizi montaj eğrisi parametresi kullanarak numune ile konsol arasındaki temas noktasını otomatik olarak tahmin etmek için, temas noktasının otomatik tahminini kullanın.Klasik odaklanmış ızgara yöntemi ile konsol ve numune arasındaki temas noktasını belirleyin. Veri analizinin optimizasyonu sırasında ampirik olarak belirlenmesi gereken ölçülen kuvvet eğrilerinin kalitesine bağlı olarak temas noktasının en iyi şekilde belirlenmesini sağlamak için modelden bağımsız yöntem olarak tahmin yöntemini seçin. Model uyumu için klasik L two olarak klasik bir model kullanarak kuvvet girinti eğrisini uyun.Modelin uyumunu geri çekilme eğrisine ayarlayın. Poisson oranını karaciğer gibi yumuşak dokular için önerilen 0.45 olarak ayarlayın. Eğrinin uyumunu üç temel derece ve bir temas içi derece kullanarak ayarlayın.Eğrilerin modelden sapmalarının ölçeğine bağlı olarak polinom uyum derecesini değiştirin. Para çekme eğrilerine uymak için kullanılan modeli Sneddon modeli olarak seçin. Küresel ucun yarıçapını 2,9 mikrometreye kadar doldurun.Okumayı etkinleştirerek yay sabitini ve invOLS'yi veri dosyalarından yükleyin, ardından bitir'e tıklayın. Veri analizinden sonra, kuvvet eğrilerini gözden geçirin. Konsol karaciğer bölümünün yüzeyine yanlış yaklaştığı kuvvet eğrilerini hariç tutun.Bu eğriler yüksek gürültüye ve anormal şekillere sahiptir. Bundan sonra, veriler kopyalanabilir veya dışa aktarılabilir. Bu çalışmada, kontrol farelerinden elde edilen hafif sabit karaciğer kesitleri ve karbon tetraklorür enjeksiyonu ile indüklenen hafif ve ileri fibrozisli fareler AFM ile incelendi.Karbon tetraklorür farelerinde genellikle kollajen liflerinin oluştuğu alanlara karşılık gelen merkezi damarlara yakın alanlar, kontrol karaciğerlerinde analiz edildi. Young modülünün dağılımı, kontrol karaciğerlerindeki farklı bölgelerde ve tek bir karaciğer bölümündeki kollajen bakımından zengin alanlarda tekrarlanabilirdi. Karbon tetraklorür ile muamele edilmiş farelerde, kollajen birikintilerinin perisantral alanlarına karşılık gelen sertlik haritaları, kontrol farelerindeki eşdeğer alanlara kıyasla Young modülünün önemli ölçüde daha yüksek değerlerini göstermiştir.Dahası, daha uzun tedavi ile Young modüllerinin değerlerinde önemli bir artış oldu. Karaciğer kesitlerinin uzun süre depolanmasının kollajen liflerinin mekanik özellikleri üzerindeki etkisi de değerlendirildi. AFM ölçümleri, iki hafta içinde elde edilenlere kıyasla, üç ay boyunca depolanan bölümler için kollajen bakımından zengin alanlarda Young modüllerinin önemli ölçüde daha düşük değerlerini göstermiştir.Karaciğer bölümünün fiksasyon zamanı, karaciğer bölümünün mekanik özelliklerini büyük ölçüde belirler. Protokolde belirtilen zamanlanmış aralıklara kesinlikle uyulmasını öneririz. Protokoldeki belirli optimizasyonlardan sonra, verilen yöntem, polarize mikroskopi ile tespit edilebilen önemli kollajen birikimi gösteren herhangi bir yumuşak doku için kullanılabilir.Verilen teknik, araştırmacılara sağlıklı ve hastalık boyunca karaciğer mekanizmasını incelemek için birleşik ve uygun bir protokol sağlar.

measurement-liver-stiffness-using-atomic-force-microscopy-coupled

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ekstraselüler matriksin sertliği kuvvetle yapışık hücrelerinin birden fazla davranışları etkiler. Matrix sertliği bir doku boyunca mekansal değişir ve çeşitli hastalık koşullarında değişiklik uğrar. Burada atomik kuvvet mikroskobu microindentation kullanarak fare akciğer dokusunun normal ve fibrotik sertliği mekansal farklılıklar karakterize etmek için yöntemler geliştirmek.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Akciğer Doku Mikro-Mekanik Karakterizasyonu

Bu kağıt bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak microindentation ile canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için bir protokol göstermektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Aortların fareden izolasyonu ve atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak elastik modüllerinin ölçümü için ayrıntılı protokoller sunuyoruz.

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Bu protokol, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının kemirgen modellerinde karaciğer dokusu değişikliklerini invaziv olmayan bir şekilde gözlemlemek ve ölçmek için geliştirilmiş bir ultrason tekniğinin kullanımını açıklar.

NAFLD/NASH'in Sıçan Modelinde Ultrason ve Kesme Dalgası ElastografiSi Görüntüleme Uygulaması

Bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) prob ucu tarafından bir numune yüzeyine uygulanan temas alanının ve kuvvetin ölçülmesi, nano ölçekli mekanik özellik belirlemeyi mümkün kılar. Elastik modülü veya diğer nanomekanik özellikleri ölçmek için yumuşak ve sert numunelerde havada veya sıvıda AFM konsol bazlı nanogirinti uygulamak için en iyi uygulamalar tartışılmaktadır.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Konsol Tabanlı Nanogirinti: Hava ve Sıvıda Nanoölçekte Mekanik Özellik Ölçümleri

Bu çalışmanın amacı, hepatik fibrozisin erken teşhisi için, hastanın karaciğerindeki her bir vokselin sertliğini içeren ve böylece hastanın karaciğerinin farklı fibroz evrelerindeki dağılım oranını hesaplamak için kullanılabilecek yeni bir üç boyutlu dijital model geliştirmekti.

Hepatik fibrozisin erken tanısı için manyetik rezonans elastografiye dayalı üç boyutlu dijital model

Yakın zamanda retina kapiller sertleşmesini diyabetle ilişkili retina disfonksiyonu için yeni bir paradigma olarak tanımladık. Bu protokol, fare retina kılcal damarlarının ve subendotel matrisinin retinal endotel kültürlerinden izolasyon adımlarını detaylandırır ve ardından atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak sertlik ölçüm tekniğinin bir açıklaması yapılır.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Sertlik Ölçümü için Fare Retina Kılcal Damarlarının ve Subendotelyal Matriksin İzolasyonu

Bu protokol, sağlam karaciğer dokusunda karaciğer stellat hücrelerinin morfolojisini görselleştirmek ve modellemek için kapsamlı bir görüntüleme hattı sunar. Bu yaklaşım, fare genetiği kullanılarak fibroblastların floresan etiketlenmesini, yerinde karaciğer perfüzyon tabanlı doku hazırlığını ve modifiye edilmiş iDISCO doku temizleme yöntemini birleştirerek optik şeffaflığı sağlar.

Karaciğer Fibrozisi Fare Modellerinde Hepatik Yıldız Hücre Morfolojisinin Haritalanması

Bu kağıt kültürü canlı hücreleri mekanik uyarılması için entegre bir atom operasyon okuyucu kuvvet optik görüntüleme mikroskop öğretmeyi hedefliyor. Bir adım-adım protokol sunulmuştur. Mekanik stimülasyonu canlı hücre yanıtı gösteren bir temsilci veri seti sunulmaktadır.

Tümleşik Optik ve Atomik Kuvvet Mikroskobu eğitimi Mekanik Uyarım Canlı Hücre Tepki

Işıksal çözülmesi iki foton mikroskobu görüntüleme sistemi kullanılarak, piksel düzeyinde Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) verimlilik haritaları, homo-oligomerik komplekslerini oluşturmak için hipotez membran reseptörleri hücre elde edilir. Verimlilik haritaları FRET, çalışma kapsamında oligomer kompleksi hakkında stokiyometrik bilgi tahmin etmek mümkün.

Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme

Keşfedin karaciğer fibrozisinde kollajen açısından zengin bölgelerin elastik modüllerini ölçme yöntemini. Polarizasyon mikroskobu ile birleştirilmiş atomik kuvvet mikroskobu kullanarak yüksek uzamsal çözünürlükte biyomekanik analiz yapın.

Polarizasyon Mikroskobu ile Birleştirilmiş Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Karaciğer Sertliğinin Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet