Polarizasyon Mikroskobu ile Birleştirilmiş Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Karaciğer Sertliğinin Ölçülmesi
20 Temmuz 2022
Normal ve hastalıklı karaciğerde kollajen bakımından zengin alanların elastik modüllerini atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Polarizasyon mikroskobunun eşzamanlı kullanımı, karaciğer bölümlerinde kollajen bakımından zengin alanların lokalizasyonu için yüksek mekansal hassasiyet sağlar.
Protokolümüz, karaciğer bölümlerinde kollajen bakımından zengin ve kollajen eksikliği olan alanlar arasında bir ayrım sağlar. Böylece fibrogenez süreçlerini daha ayrıntılı olarak incelemek için kullanılabilir. Tekniğin temel avantajı, karaciğer bölümlerinde kollajen bakımından zengin alanları bulmak için polarize mikroskopinin kullanılmasında yatmaktadır.
Protokollerimiz karaciğer fibrozisinin gelişimi hakkında büyük bir fikir verebilir ve bazı optimizasyonlardan sonra akciğerler gibi diğer yumuşak dokular için de benimsenebilir. Başlamak için, donmuş karaciğer bölümlerini eksi 80 santigrat dereceden çıkarın ve iki dakika boyunca oda sıcaklığında çözün. Bölümleri PBS'de% 4 paraformaldehit ile buz soğukluğunda% 4 paraformaldehit ile dört santigrat derecede 10 dakika sabitleyin, ardından PBS ile beş kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra, karaciğer bölümünün etrafındaki fazla PBS'yi doku kullanarak silin ve karaciğer bölümünün etrafında yaklaşık iki x dört santimetrelik bir sınırı hidrofobik bir işaretleyici kalemle işaretleyin. Numuneyi PBS ile örtün, ardından numuneyi AFM aşamasına yükleyin ve AFM kafasıyla örtün. Atomik kuvvet mikroskobu veya AFM yazılımında, kurulum sekmesine gidin ve tüm dosyaları otomatik olarak kaydetmek için otomatik kaydetmede bir onay işareti işaretleyin.
Ardından, ayarlar sekmesine gidip ayarları kaydetmeye tıklayarak ölçüm dosyalarının kaydedileceği dosya adını ve dizini belirtin. Lazeri açıp yaklaşım tuşuna tıklayarak AFM konsoluyla doku yüzeyine yaklaşın. Yaklaşım tamamlandıktan sonra, konsol ucunu piezo aralığının üst ucuna geri çeken geri çekme tuşuna bir kez tıklayarak geri çekin.
Gerekirse, AFM kafasındaki düğmeleri kullanarak dedektörü yeniden hizalayın. Lazeri kapatın. İpucu şimdi hedefin odak noktasında.
Ardından, aksesuarlar sekmesine tıklayarak ve doğrudan bindirme optik kalibrasyonunu seçerek mikroskopun optik alanını AFM ölçüm haritalarıyla kaplayın. Sonraki pencerede, belirli bir alanı tarayan konsol görüntüsünün bir dizi görüntüsünü çekmek için ilerisini tıklatın. Sonraki pencereye gitmek için İleri'yi tekrar tıklatın.
İlk görüntüde, yazılımdaki uç konumunu göstermek için konsol ucunun ucunun ortasına manuel olarak tıklayın. Uç konumunu gösteren daire, doğruluğu artırmak için yarıçapı belirtilerek boyut olarak manipüle edilebilir. Tüm görüntülerdeki konsol ucu konumunu otomatik olarak algılamak için kalibre et'i tıklatın.
Görüntüleri inceleyerek uç algılamanın doğruluğunu onaylayın. İleri'yi tıklatın ve optik kaplamayı bitirmek için bitirin. Ardından, polarize görüntüyü kullanarak veri görüntüleyici sekmesinde görülebilen yeşil kutunun içine kolajen bakımından zengin bir alan yerleştirmek için sahne alanını hareket ettirin.
Kılavuz sekmesinin altındaki alanı tanımlayarak kolajen bakımından zengin alanı seçin ve ardından belirtilen yeşil kutunun içindeki sol fare düğmesine uzun basarak veri görüntüleyici sekmesinde bir dikdörtgen oluşturun. Seçilen alanı ölçüm alanı olarak ayarlamak için yeni tarama bölgesini onayla'ya tıklayın. Geri bildirim döngüsünün parametrelerini ayarlayın.
I kazanç değerini 50 hertz'de ve P kazancını 0,001'de ayarlayın. Ardından ayar noktasını bir nano Newton'a ayarlayın. İncelenen malzemelerin mekanik özelliklerine ve konsol sertliğine göre göreceli ayar noktası değerini seçin.
Kuvvet eğrilerini düzgün bir şekilde sığdırmak için adil bir taban çizgisi belirtin. Ardından, numunenin yüzey topografyasına göre Z eksenindeki konsol hareketinin uzunluğunu seçin. Z hareketini sabit süreye ayarlayın.
Uzatma ve geri çekme gecikmeleriyle uzatma süresini bir saniyeye ayarlayın. Örnekleme hızını 5.000 hertz olarak ayarlayın. Ölçümler sırasında numune ile konsol ucu arasındaki mesafeyi otomatik olarak ayarlamak için Z kapalı döngüsünün önünde bir onay işareti işaretleyin.
Ardından, devreye alma düğmesinin seçimini kaldırarak motorlu kademe kontrolünü devre dışı bırakın. Lazeri açın ve numuneye konsolla yaklaşın. Kuvvet mesafesi eğrilerini toplamak için taramayı başlat'a tıklayın.
Açık kaynaklı yazılım AtomicJ'yi kullanarak elde edilen verileri analiz edin. İşlem kuvveti eğrileri ve haritaları simgesine tıklayarak kuvvet eğrilerini programa yükleyin. Ardından işlem asistanında, ekle düğmesine tıklayarak analiz edilecek haritaları ekleyin.
Haritalar yüklendikten sonra İleri'ye tıklayın. Bir sonraki pencerede işleme ayarlarını belirtin. Bir dizi montaj eğrisi parametresi kullanarak numune ile konsol arasındaki temas noktasını otomatik olarak tahmin etmek için, temas noktasının otomatik tahminini kullanın.
Klasik odaklanmış ızgara yöntemi ile konsol ve numune arasındaki temas noktasını belirleyin. Veri analizinin optimizasyonu sırasında ampirik olarak belirlenmesi gereken ölçülen kuvvet eğrilerinin kalitesine bağlı olarak temas noktasının en iyi şekilde belirlenmesini sağlamak için modelden bağımsız yöntem olarak tahmin yöntemini seçin. Model uyumu için klasik L two olarak klasik bir model kullanarak kuvvet girinti eğrisini uyun.
Modelin uyumunu geri çekilme eğrisine ayarlayın. Poisson oranını karaciğer gibi yumuşak dokular için önerilen 0.45 olarak ayarlayın. Eğrinin uyumunu üç temel derece ve bir temas içi derece kullanarak ayarlayın.
Eğrilerin modelden sapmalarının ölçeğine bağlı olarak polinom uyum derecesini değiştirin. Para çekme eğrilerine uymak için kullanılan modeli Sneddon modeli olarak seçin. Küresel ucun yarıçapını 2,9 mikrometreye kadar doldurun.
Okumayı etkinleştirerek yay sabitini ve invOLS'yi veri dosyalarından yükleyin, ardından bitir'e tıklayın. Veri analizinden sonra, kuvvet eğrilerini gözden geçirin. Konsol karaciğer bölümünün yüzeyine yanlış yaklaştığı kuvvet eğrilerini hariç tutun.
Bu eğriler yüksek gürültüye ve anormal şekillere sahiptir. Bundan sonra, veriler kopyalanabilir veya dışa aktarılabilir. Bu çalışmada, kontrol farelerinden elde edilen hafif sabit karaciğer kesitleri ve karbon tetraklorür enjeksiyonu ile indüklenen hafif ve ileri fibrozisli fareler AFM ile incelendi.
Karbon tetraklorür farelerinde genellikle kollajen liflerinin oluştuğu alanlara karşılık gelen merkezi damarlara yakın alanlar, kontrol karaciğerlerinde analiz edildi. Young modülünün dağılımı, kontrol karaciğerlerindeki farklı bölgelerde ve tek bir karaciğer bölümündeki kollajen bakımından zengin alanlarda tekrarlanabilirdi. Karbon tetraklorür ile muamele edilmiş farelerde, kollajen birikintilerinin perisantral alanlarına karşılık gelen sertlik haritaları, kontrol farelerindeki eşdeğer alanlara kıyasla Young modülünün önemli ölçüde daha yüksek değerlerini göstermiştir.
Dahası, daha uzun tedavi ile Young modüllerinin değerlerinde önemli bir artış oldu. Karaciğer kesitlerinin uzun süre depolanmasının kollajen liflerinin mekanik özellikleri üzerindeki etkisi de değerlendirildi. AFM ölçümleri, iki hafta içinde elde edilenlere kıyasla, üç ay boyunca depolanan bölümler için kollajen bakımından zengin alanlarda Young modüllerinin önemli ölçüde daha düşük değerlerini göstermiştir.
Karaciğer bölümünün fiksasyon zamanı, karaciğer bölümünün mekanik özelliklerini büyük ölçüde belirler. Protokolde belirtilen zamanlanmış aralıklara kesinlikle uyulmasını öneririz. Protokoldeki belirli optimizasyonlardan sonra, verilen yöntem, polarize mikroskopi ile tespit edilebilen önemli kollajen birikimi gösteren herhangi bir yumuşak doku için kullanılabilir.
Verilen teknik, araştırmacılara sağlıklı ve hastalık boyunca karaciğer mekanizmasını incelemek için birleşik ve uygun bir protokol sağlar.
Genel Bakış
Bu çalışma, normal ve fibrotik karaciğer dokularında bulunan kollajen açısından zengin alanların elastik modüllerini ölçmek için bir protokol sunmaktadır. Bu teknik, karaciğer fibrozunu anlamak için kritik öneme sahip olan kollajen açısından zengin bölgelerin tanımlanmasında yüksek mekansal kesinlik sağlamaktadır. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile polarizasyon mikroskobunun kombinasyonu kullanılmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Karaciğer fibrozu ve karakterizasyonu
- Dokuların elastik özellikleri
- Gelişmiş görüntüleme tekniklerinin uygulanması
Arka Plan
- Karaciğer dokularında kollajen açısından zengin alanları kollajen açısından fakir alanlardan ayırt etmek için geliştirilmiş yöntemlere duyulan ihtiyaç.
- Fibrojenezinin anlaşılması, karaciğer hastalığı araştırmaları için hayati öneme sahiptir.
- Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), yumuşak dokularda yüksek çözünürlüklü ölçümler sağlamaktadır.
Kullanılan Yöntemler
- Elastik modülleri ölçmek için atomik kuvvet mikroskobu (AFM)
- Karaciğer dokularında kollajen açısından zengin alanlar biyolojik sistem olarak
- Kollajenin lokalizasyonu için polarizasyon mikroskobu
Ana Sonuçlar
- Karaciğer kesitlerinde kollajen açısından zengin alanların başarılı bir şekilde tanımlanması
- Farklı karaciğer bölgeleri boyunca Young's modüllerinin nicelendirilmesi
- Fibroz ile ilişkili mekanik özellikler hakkında bilgi edinme
Sonuçlar
- Protokol, karaciğer fibrozunu incelemek için güvenilir bir yaklaşımı gösterir.
- Bu yöntem potansiyel olarak diğer yumuşak dokular için uyarlanabilir ve daha geniş biyolojik araştırmalara katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of liver stiffness at the cellular level is critical for de-risking early-stage fibrosis targets and understanding disease progression mechanisms. Atomic force microscopy (AFM) coupled with polarization microscopy enables precise mapping of collagen-rich fibrotic regions, supporting predictive confidence in target validation and translational research. This capability strengthens portfolio decisions by providing reproducible, spatially resolved mechanical data relevant to fibrogenesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of fibrogenesis by distinguishing collagen-rich from collagen-lacking regions.
- Supports biological de-risking through direct measurement of tissue mechanical properties linked to disease state.
- Provides reproducible quantitative data to inform target selection and triage in fibrosis research.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated tissue models for downstream compound screening.
- Delivers standardized, quantitative Young's modulus outputs for assay reproducibility.
- Enables high spatial precision in identifying regions of interest for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanical measurements with disease-relevant tissue changes for translational biomarker development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by mapping fibrosis progression.
- Provides predictive de-risking for therapeutic hypotheses targeting matrix remodeling.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, quantitative readouts, and cross-model standardization in fibrosis research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on matrix stiffening and its cellular effects in fibrogenesis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative stiffness measurements for assay development.
- Analytics: Generates spatially resolved Young's modulus data for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Links mechanical properties to disease progression for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for other soft tissues with collagen deposition, supporting broader R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in fibrosis target validation.
- Operational Value: Standardizes measurement of tissue mechanics with high reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in fibrosis programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of fibrosis and matrix-targeting assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and tissue preparation for reproducible results.
- Needs access to AFM instrumentation and polarization microscopy for spatial targeting.
- Demands strict adherence to fixation and storage protocols to ensure data integrity.
- Cross-team standardization is essential for reproducibility across studies and sites.
- Protocol adaptation may be needed for other soft tissues with distinct collagen architectures.
