Name: Primer Kültürde Diferansiye Fare Adipositleri: İnsülin Direncinin Bir Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Öğrenin fare primer adipositlerinde insülin direncini incelemeyi; subkutan yağ dokusundan preadiposit izolasyonu, diferansiyasyon ve Western blot ile sinyal yolu analizi yapın. Bu yöntem metabolik hastalık modelleri için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla ve María Antonieta Carbajo'ya teknik yardımları için ve Jessica Gonzalez Norris'e makaleyi eleştirel bir şekilde düzenledikleri için teşekkür ederiz. Bu protokol Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (Y.M.) tarafından desteklenmiştir.

Tüm kemirgen deneyleri, UNAM Nörobiyoloji Enstitüsü Biyoetik Komitesi, protokol numarası 075 tarafından onaylanmıştır.
1. Fare adiposit öncü hücrelerinin izolasyonu
<ol><li>8-10 haftalık erkek C57BL / 6 fareleri ötenazi yapın (örneğin, CO2 inhalasyonu ve müteakip servikal çıkık ile) (izolasyon başına dört hayvan). Fareleri %70 etanol ile ovalayarak dezenfekte edin ve kurbandan hemen sonra yağ dokusunu elde edin. NOT: Kemirgenlerin ötenazisinden sonra, yağ dokusunu derhal izole edin ve steril laminer akış başlığı içindeki tüm adımları gerçekleştirin. Fareler, yiyecek ve suya serbest erişim ile 12 saat açık / karanlık döngüleri altında tutulur.</li>
	<li>Kasık altı yağ dokusunu her fareden diseke edin. Kas, cilt veya başka herhangi bir dokunun çıkarılmasından kaçınarak sadece yağ dokusunu çıkarın ve buz üzerinde 15 mL tip 1 kollajenaz çözeltisi (1.5 mg / mL) içeren 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın. Tip 1 kollajenazı Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) yüksek glikoz-%1 sığır serum albümininde (BSA) çözün ve 0,2 μm şırınga filtrelerinden geçirin.</li>
	<li>Yağ dokusunu steril cerrahi makasla küçük parçalara ayırın ve numuneleri 30 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcıda (150 rpm) 37 ° C'de tip 1 kollajenaz çözeltisi ile inkübe ederek sindirin (daha büyük bir sallama yüzeyi için yağ ve kollajenaz içeren tüpü yatay konuma getirin). Çalıştığından emin olmak (doku bozulması görülebilir) ve aşırı sindirimi önlemek için sindirimi her 10 dakikada bir kontrol edin (Ek Şekil S1'e bakınız).</li>
	<li>Kollajenaz ile sindirilmeyen dokuyu ortadan kaldırmak için 200 μm'lik bir ağ şırıngası (daha önce otoklavlanmış) kullanarak filtreleyin. Çözeltiye mümkün olduğunca çok hücre boşaltmak için filtreyi tüpün kenarından geçirin. Sindirimi durdurmak için 15 mL soğuk DMEM-1% BSA ekleyin ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj yapın.</li>
	<li>Olgun adipositleri ve sıvı tabakanın çoğunu içeren üst tabakayı aspire edin; Peletlere dokunmaktan veya rahatsız etmekten kaçının. 20 mL soğuk fosfat tamponlu salin (PBS)-% 2 fetal sığır serumu (FBS) ekleyin ve peletleri yeniden askıya alın. 400 × g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın, kalan adipositleri ve yağları ortadan kaldırmak için önce üst tabakayı aspire edin. Peletleri 1 mL amonyum klorür potasyum (ACK) lizing tamponunda (kırmızı kan hücrelerini lize etmek için) tekrar askıya alın ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. 10 mL PBS-%2 FBS ekleyin, karıştırın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj yapın.</li>
	<li>Süpernatantı aspire edin ve ilgili antikorlar tarafından Fc reseptörü aracılı bağlanmayı azaltmak için peleti 200 μL anti-Fc çözeltisinde (PBS-% 2 FBS [1:150] içinde seyreltilmiş saflaştırılmış sıçan anti-fare CD16 / CD32) içinde yeniden askıya alın. 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Hücre süspansiyonunu, manyetik hücre ayırıcısının önceden soğutulmuş raflarına uyan 5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj.</li>
	<li>Süpernatanı ortadan kaldırın, CD31 (PECAM-1) monoklonal antikor (390)-biyotin (1:100) ve CD45 monoklonal antikor (30-F11)-biyotin (1:100) karışımından 200 μL ekleyin, iyice karıştırın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin (anti-Fc çözeltisinde antikor seyreltmeleri hazırlayın; bakınız Tablo 1). 400 μL PBS-2% FBS ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj yapın. NOT: CD31 ve CD45 sırasıyla endotel hücrelerinin ve hematopoetik hücrelerin belirteçleridir.</li>
	<li>Süpernatantı aspire edin ve buz üzerinde 15 dakika boyunca 100 μL anti-biyotin mikroboncuk (1:5) içinde inkübe edin (anti-Fc çözeltisinde antikor seyreltmeleri hazırlayın, bakınız Tablo 1). 400 μL PBS-2% FBS ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj yapın.</li>
	<li>Süpernatantı atın ve pelet 350 μL PBS-2% FBS'de yeniden askıya alın. Hücre agregalarını veya büyük parçacıkları tek hücreli süspansiyonlardan bir ön ayırma filtresi (70 μm) ile çıkarın. İlk olarak, filtreyi 100 μL PBS-2% FBS ile etkinleştirin, hücre süspansiyonunu filtreden geçirin (temiz bir tüpte toplayın) ve son olarak filtreyi 100 μL PBS-2% FBS ile yıkayın.</li>
	<li>Manyetik hücre ayırıcı ile negatif ayırma stratejisini kullanarak hücrelerin manyetik ayrımını gerçekleştirin.<ol><li>Etiketlenmemiş ve etiketlenmiş hücreleri geri kazanmak için numuneyi soğutma rafının A konumuna (rafın önceden soğutulduğundan emin olun) ve B ve C konumuna iki boş tüp yerleştirin.</li>
		<li>Ekipmanı açmadan önce yıkama tamponunu ve çalışma tamponunu ilgili şişelere yükleyin. DEPLETE protokolü ile hücrelerin manyetik ayrımını gerçekleştirmek için ekipmanı programlayın. NOT: Bu protokol, iyileşme en yüksek öncelikse, normal antijen ekspresyonuna sahip hücrelerin (bu durumda, anti-CD31 ve anti-CD45 ile etiketlenmiş hücreler) çıkarılması için standart modda tükenme içindir.</li>
		<li>Ayırma bölümünde, ayrılacak örnek sayısını seçin ve DEPLETE protokolünü seçin. Çalıştır'a basın ve ayırmayı başlatın. Programın sonunda, etiketlenmemiş hücreleri geri kazanın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Süpernatantı çıkarın ve peleti 500 μL büyüme ortamında yeniden askıya alın (Tablo 1).</li>
	<li>APC'leri daha önce %2,5 bazal membran matrisi ile kaplanmış 12 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna tohumlayın (yaklaşık 50.000-75.000 hücre elde edilir). Her bir kuyucuğun tüm yüzeyini kaplamak için 400 μL% 2,5 bazal membran matrisi ekleyin. Fazla çözeltiyi çıkardıktan ve sadece küçük bir tabaka bıraktıktan hemen sonra, plakanın laminer akış davlumbazının içinde en az 1 saat kurumasını (kapaksız) bırakın. 37 °C'de %5 CO2 atmosferinde inkübe edin. Hücreler% 80 birleşime ulaşana kadar ortamı her 48 saatte bir değiştirin.</li>
	<li>% 80 birleşimde, ortamı tamamen çıkarın ve 350 μL PBS-2% FBS ile yıkayın. Hücreleri 350 μL% 0.05 tripsin-EDTA ile 37 ° C'de 2 dakika boyunca toplayın. 2 mL büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri yeni bir 50 mL konik tüpte toplayın, ardından 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj yapın.</li>
	<li>APC'leri daha önce %2,5 bazal membran matrisi ile kaplanmış 12 delikli plakalara (kuyu başına 10.000-20.000 hücre) geçirin. 37 °C'de %5 CO2 ile inkübe edin. Hücreler% 80 birleşime ulaşana kadar ortamı her 48 saatte bir değiştirin. NOT: APC'ler bir kez geçirilebilir. Daha sonra, çoğalma ve farklılaşma yeteneklerini kaybederler. Ek Şekil S2'deki APC'lerin yalıtım işlemine ilişkin iş akışına bakın.</li>
</ol>2. Adiposit farklılaşması ve insülin direncinin indüklenmesi
NOT: Hücreleri% 5 CO2'de 37 ° C'de tutun ve steril bir başlık içinde TNF-α ve insülin ile ortam değişikliği ve tedavileri içeren adımları uygulayın.
<ol><li>% 80 birleşimde, farklılaşma sürecine başlayın; Herhangi bir büyüme ortamını aspire edin ve her bir kuyucukta 3.3 nM kemik morfogenetik protein (BMP4) içeren 500 μL farklılaşma ortamı (Tablo 1) ile değiştirin.</li>
	<li>48 saat sonra, ortamı diferansiyasyon ortamı (kuyucuk başına 500 μL) ve farklılaştırma kokteyli (Tablo 1) ile değiştirin.</li>
	<li>Ortamı 72 saat sonra çıkarın ve 500 μL taze farklılaşma ortamına 100 nM insülin ekleyin. NOT: Hücreler, içinde küçük lipit damlacıkları bulunan yuvarlak bir görünüm göstermeye başlar.</li>
	<li>Herhangi bir farklılaşma ortamını aspire edin ve 48 saat sonra 500 μL basit orta-% 2 FBS (Tablo 1) ile değiştirin. 4 ng/mL TNF-α ile insülin direncini indükler. TNF-α tedavisi olmayan kontrol kuyularını dahil edin.</li>
	<li>24 saatlik inkübasyondan sonra, basit orta-% 0 FBS'ye 4 ng / mL TNF-α ekleyin (Tablo 1). TNF-α tedavisi olmadan kontrol kuyularını koruyun.</li>
	<li>İnsülin sinyal yolunu 24 saat sonra 100 nM insülin ekleyerek aktive edin ve% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Ortamı çıkarın ve 500 μL PBS ile yıkayın. İnsülin tedavisi olmadan kontrol kuyularını dahil edin.</li>
</ol>3. İnsülin sinyal yolunun western blot ile değerlendirilmesi
<ol><li>Protein ekstraksiyonu ve miktarının belirlenmesi<ol><li>Her bir hücre kuyucuğunu 500 μL PBS ile yıkayın ve numune izolasyonundan hemen önce eklenen% 1 proteaz inhibitörü kokteyli içeren 50 μL RIPA tamponunda (Tablo 1) hücreleri lize etmek için buz üzerinde tutun. Kuyunun tüm yüzeyini bir uçla kazıyın ve lizatı 0.6 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın (buzda tutun).</li>
		<li>Dönen bir çalkalayıcıda 4 ° C'de 1 saat inkübe edin, vorteks ile karıştırın ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca 8.000 × g'da santrifüj yapın ve süpernatantı geri kazanın (buzda tutun).</li>
		<li>Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin (ölçmek için numuneyi seyreltmeyin).</li>
		<li>40-60 μg'ye karşılık gelen gerekli hacmi alın ve 550 rpm'de çalkalarken 15 dakika boyunca 97 ° C'de inkübe ederek 6x Laemmli tamponu (Tablo 1) ile denatüre edin. Kullanana kadar dondurun.</li>
	</ol></li>
	<li>SDS-poliakrilamid jel elektroforezi<ol><li>SDS-poliakrilamid jel elektroforezini (SDS-PAGE) 1,5 mm kalınlığında% 7,5 poliakrilamid jel ile gerçekleştirin. Jeli tankın içine yerleştirin ve çalışan tamponla doldurun (Tablo 1).</li>
		<li>Jelin ilk kuyucuğuna 3 μL önceden boyanmış protein standardı ekleyin ve her bir numuneyi sonraki kuyucuklara yükleyin.</li>
		<li>Numunenin poliakrilamid konsantratör jel matrisine girdiğinden emin olmak için jeli yaklaşık 15 dakika boyunca 80 V'ta çalıştırın. Bundan sonra, voltajı 2,5 saat boyunca 90 V'a veya jelin alt kenarında 37 kDa moleküler ağırlık işaretleyicisi görülene kadar artırın.</li>
		<li>Proteinleri jelden yarı kuru bir odada bir nitroselüloz membranına 25 V'ta 35 dakika boyunca aktarın. önceden, jeli, zarı ve filtreleri birkaç dakika boyunca transfer tamponuna (Tablo 1) batırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Batı lekesi<ol><li>Transferden sonra, membranı% 0.1 Tween 20 (TBS-T% 0.1) (Tablo 1) içeren Tris tamponlu salin (TBS) ile 30 rpm'de çalkalayarak 3 dakika boyunca yıkayın.</li>
		<li>Membranı bloke edici çözelti ile bloke edin (Tablo 1) 4 °C'de 1 saat boyunca sabit rotasyonda.</li>
		<li>Sabit rotasyonda 4 °C'de farklı birincil antikorlarla (bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş) gece boyunca inkübe etmek için membranı moleküler ağırlık belirtecine göre üç parçaya bölün: Fosfo-IRS1 (Tyr608) antikoru (1:1.000), 180 kDa'da beklenen bant; Fosfo-İnsülin reseptörü β (Tyr1150/1151) antikoru (1:1.000), 95 kDa'da beklenen bant; Fosfo-Akt (Ser473) antikoru (1:1.000), 60 kDa'da beklenen bant.</li>
		<li>Membranları her biri 5 dakika boyunca 5x TBS-T% 0.1 ile yıkayın.</li>
		<li>Membranları, karşılık gelen peroksidaz kuplajlı ikincil antikor (bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş) ile oda sıcaklığında sabit rotasyonda 2 saat boyunca inkübe edin: peroksidaz affiniSaf eşek anti-tavşan IgG (H + L) (1:5.000).</li>
		<li>Membranları her biri 5 dakika boyunca 5x TBS-T% 0.1 ile yıkayın.</li>
		<li>Kemilüminesans algılama sistemini kullanarak proteinleri tespit edin. Substratı üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.</li>
		<li>Lekeyi plastik bir torbaya yerleştirin ve membranı tamamen örtmek için 200 μL kemilüminesan substrat ekleyin. Fazla substratı boşaltın ve hava kabarcıklarını çıkarın.</li>
		<li>Kemilüminesans ile uyumlu yüksek performanslı bir görüntüleme sisteminde her bir lekeyi 30-60 s boyunca maruz bırakın.</li>
		<li>Antikor-antijen etkileşimlerini kırmak için membranları (batı leke bölümünün 10-13. adımları) sıyırın ve böylece nitroselüloz membranların yeniden lekelenmesine izin verin. Membranları geri kazanın ve 50 rpm'de TBS-T% 1 TBS-T ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.</li>
		<li>50 rpm'de 10 mL 0,2 M NaOH ile 7 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Her biri 50 rpm'de musluk suyuyla 5 dakika boyunca 3x yıkayın.</li>
		<li>50 rpm'de %1 TBS-T ile 10 dakika yıkayın.</li>
		<li>1:1.000 seyreltme kullanarak membranı bir yükleme kontrolü olarak anti-beta tübülin (55 kDa) ile inkübe etmek için batı leke bölümünün 2-9 arasındaki adımlarını tekrarlayın.</li>
		<li>ImageJ yazılımını (https://imagej.nih.gov/) kullanarak her protein için25 densitometrik analiz gerçekleştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Elmus, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signaling+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Insulin signaling and insulin resistance.</a> Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).</li>
<li>Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+stimulates+tyrosine+phosphorylation+of+the+insulin+receptor+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system.</a> Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).</li>
<li>Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+stimulates+the+phosphorylation+of+the+95%2C000-dalton+subunit+of+its+own+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor.</a> Science. 215 (4529), 185-187 (1982).</li>
<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+nodes+in+signalling+pathways%3A+insights+into+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).</li>
<li>Freeman, A. M., Pennings, N. Insulin Resistance. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/</a> (2021).</li>
<li>Petersen, M. C., Shulm, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+insulin+action+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of insulin action and insulin resistance.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).</li>
<li>Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+underlying+defect+in+insulin+action+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).</li>
<li>Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUnamuno%2C+X+%22Encyclopedia+of+Endocrine+Diseases.+Second+edition%22">Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition</a>. , Academic Press. 370-384 (2019).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pink+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pink adipocytes.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).</li>
<li>Kahn, B. B., Flier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Obesity and insulin resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).</li>
<li>Klemm, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-induced+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Insulin-induced adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).</li>
<li>Wilcox, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist.+Reviews%22%5BJournal%5D)">Insulin and insulin resistance.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).</li>
<li>Yohannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+insulin+resistance%2C+and+type+2+diabetes%3A+associations+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Metabolic+Syndrome+and+Obesity%3A+Targets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).</li>
<li>James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+etiology+and+molecular+landscape+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The etiology and molecular landscape of insulin resistance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).</li>
<li>Wondmkun, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+insulin+resistance%2C+and+type+2+diabetes%3A+associations+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Metabolic+Syndrime+and+Obesity%3A+Targets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).</li>
<li>Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+causes+the+insulin+resistance+underlying+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Endocrinology%2C+Diabetes%2C+and+Obesity%22%5BJournal%5D)">What causes the insulin resistance underlying obesity.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).</li>
<li>Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+obesity+cause+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Why does obesity cause diabetes.</a> Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).</li>
<li>Lo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+in+vitro+insulin-resistance+models+and+their+physiological+relevance+to+in+vivo+diet-induced+adipose+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance.</a> Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).</li>
<li>Asterholm, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+inflammation+is+essential+for+healthy+adipose+tissue+expansion+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling.</a> Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).</li>
<li>Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+inhibits+signaling+from+the+insulin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).</li>
<li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-%CE%B1+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activates+expression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes.+Nuclear+factor-%CE%BAB+activation+by+TNF-%CE%B1+is+obligatory%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li>
<li>Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+signaling+in+normal+and+insulin-resistant+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191(2014).</li>
<li>Hotamisligil, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRS-1-mediated+inhibition+of+insulin+receptor+tyrosine+kinase+activity+in+TNF-alpha-+and+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance.</a> Science. 271 (5249), 665-668 (1996).</li>
<li>Copps, K. D., White, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+insulin+sensitivity+by+serine%2Fthreonine+phosphorylation+of+insulin+receptor+substrate+proteins+IRS1+and+IRS2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2.</a> Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).</li>
<li>Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+western+blots%3A+pitfalls+of+densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Quantifying western blots: pitfalls of densitometry.</a> Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).</li>
<li>Skurk, T., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+human+adipocyte+precursor+cells%3A+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).</li>
<li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).</li>
<li>Macotela, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+differences+in+adipocyte+precursor+cells+from+different+white+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots.</a> Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+white+adipocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+Reviews%22%5BJournal%5D)">The biology of white adipocyte proliferation.</a> Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).</li>
<li>Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenesis+and+aging%3A+does+aging+make+fat+go+MAD%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Geronotology%22%5BJournal%5D)">Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD.</a> Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).</li>
<li>Guo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+results+in+paradoxical+susceptibility+of+fat+cell+progenitors+to+lipotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).</li>
<li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F.Tumor+necrosis+factor-a+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activatesexpression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes%3A+nuclear+factor-kappaB+activation+by+TNF-a+is+obligatory%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li>
<li>Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1b-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+throughdown-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li>
<li>Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-6+%28IL-6%29+induces+insulinresistance+in+3T3-L1+adipocytes+and+is%2C+like+IL-8+and+tumor+necrosis+factor-a%2Coverexpressed+in+human+fat+cells+from+insulin-resistant+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).</li>
<li>Isidor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+rewires+the+metabolic+gene+program+and+glucose+utilization+in+human+white+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes.</a> International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).</li>
<li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu yazıda, TNF-α ile tedavi edilen kültürde primer adipositleri kullanan insülin direncini incelemek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu model, birincil adipositlerin, hücresel çevresel faktörlerin sıkı bir kontrolü ile tanımlanmış koşullar altında uzun süre kültürlenebilmesi avantajına sahiptir26. Tahlil süresi 15-20 gündür, ancak deneyler arasında farklılaşmış adipositlerin yüzdesinde değişiklikler meydana gelebilir. Primer adipositler, kültürde sürekli olarak genişlemedikleri ve türetildikleri do...

İnsülin, pankreas adacığı β hücreleri tarafından üretilen anabolik bir hormondur ve glikoz ve lipit metabolizmasının anahtar düzenleyicisidir. Birçok işlevi arasında, insülin glikoz alımını, glikojen sentezini, glukoneogenezi, protein sentezini, lipogenezi ve lipoliz1'i düzenler. Reseptörü (IR) ile insülin etkileşiminden sonraki ilk moleküler sinyal, IR2'nin intrinsik tirozin protein kinaz aktivitesinin aktivasyonudur, bu da otofosforilasyon3 ile sonuçlanır ve daha sonra adaptör proteinlerine bağlanan insülin reseptör substratları (IRS) olarak bilinen bir protein ailesinin aktivasyonudur. protein kinazları4 . İnsülin iki ana sinyal yolunu aktive eder: fosfatidilinositol 3-kinaz (PI3K)-protein kinaz B (AKT) ve Ras-mitojen ile aktive edilmiş protein kinaz (MAPK). Birincisi, yakıt homeostazının düzenlenmesi de dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik fonksiyonlarda yer alan çok sayıda aşağı akış efektörünün aktivasyonu için ana bir dal noktası veya düğüm 4,5 oluştururken, ikincisi hücre büyümesini ve farklılaşmasını düzenler 4,6. İnsülin eylemleri sonuçta hücre tipine ve fizyolojik bağlama bağlıdır7.
İnsüline duyarlı ana metabolik dokulardan biri yağ dokusudur. Beyaz yağ dokusu, insanlarda ve kemirgenlerde, deri altı yağ (cilt ve kaslar arasında) ve viseral yağ (karın boşluğundaki organların etrafında) içinde dağılmış en bol yağ türüdür. Büyük hacimleri göz önüne alındığında, adipositler veya yağ hücreleri yağ dokusunda en bol bulunan hücre tipidir. Bu yağ hücreleri kahverengi/bej (termojenik), pembe (meme bezinde) ve beyaz 8,9 olabilir. Beyaz adipositler vücuttaki ana enerji rezervlerini insüline bağımlı bir süreç olan trigliseritler şeklinde tutar. İnsülin glikoz taşınımını ve lipogenezi teşvik ederken, lipoliz veya lipit parçalanmasını inhibe eder 7,10. Aynı zamanda preadipositlerin adipositlere farklılaşmasını kolaylaştırır - olgun yağ depolayan hücreler11.
İnsülin direnci, normal bir insülin seviyesi zayıflatılmış bir biyolojik yanıt ürettiğinde ortaya çıkar ve telafi edici hiperinsülinemi12 ile sonuçlanır. İnsülin direnci, aşırı kilolu ve obezite5 ile ilişkili bir durumdur, kombine edildiğinde tip 2 diyabet (T2D) ve diğer metabolik hastalıklara yol açar13. Hiperinsülinemi, normal kan şekeri seviyelerini korumak için periferik dokulardaki insülin direncini telafi eder14. Bununla birlikte, nihai β hücre kaybı veya tükenmesi, şiddetlenmiş insülin direnci ile birlikte, T2D5 ile tutarlı yüksek kan şekeri seviyelerine yol açar. Bu nedenle, insülin direnci ve hiperinsülinemi obezite kaynaklı metabolik hastalıkların gelişimine katkıda bulunabilir15. Ayrıca, obezite yağ dokusunda insülin direncini artıran kronik düşük dereceli lokal inflamasyona neden olabilir15,16,17. Ek olarak, yağ dokusunda fibroz, inflamasyon ve azalmış anjiyogenez ve adipogenez gibi obezite kaynaklı değişiklikler, adiponektin serum seviyelerinin (bir insülin duyarlılaştırıcı) düşmesine ve plazminojen aktivatör inhibitörü 1 (PAI-1), serbest yağ asitleri ve eksozomlar gibi faktörlerin kan dolaşımına salgılanmasının artmasına neden olarak insülin direncini şiddetlendirir17.
İnsülin direncinin altında yatan birçok yön bilinmemektedir. İn vitro ve in vivo modeller, yağ dokusu da dahil olmak üzere ana hedef dokularda insülin direncine aracılık eden mekanizmaları incelemek için geliştirilmiştir. İn vitro modellerin avantajı, araştırmacıların çevresel koşullar üzerinde daha fazla kontrole sahip olmaları ve spesifik hücre tiplerinde insülin direncini değerlendirebilmeleridir. Özellikle, adiposit öncü hücreleri (APC'ler), fizyolojiyi adiposit hücre hatlarından daha iyi yansıtabilecek donör dokunun bireysel fenotipine sahiptir. İn vitro insülin direncini indükleyen ana faktör tümör nekroz faktörü-α'dir (TNF-α). TNF-α, adipoz doku18'de adipositler ve makrofajlar tarafından salgılanan proinflamatuar bir sitokindir. Uygun yağ dokusu yeniden şekillenmesi ve genişlemesi için gerekli olsa da19, TNF-α'ye uzun süreli maruz kalma, in vivo yağ dokusunda ve in vitro20 adipositlerde insülin direncini indükler. Çeşitli hücre tiplerinin kronik TNF-α tedavisi, hem IR hem de IRS-1'in serin fosforilasyonunun artmasına neden olur, böylece azalmış tirozin fosforilasyonunu teşvik eder21. IRS-1'in serin kalıntıları üzerindeki fosforilasyonunun artması, IR tirozin kinaz aktivitesini inhibe eder ve kronik TNF-α tedavisinin insülin etkisini bozduğu anahtar mekanizmalardan biri olabilir22,23. TNF-α, nükleer faktör ĸB kinaz β (IKKβ) ve c-Jun N terminal kinazın (JNK)24'ün serin/treonin kinaz inhibitörünü içeren yolları aktive eder. JNK, karmaşık bir proinflamatuar transkripsiyonel programı indükler, ancak aynı zamanda IRS-16'yı doğrudan fosforile eder.
İnsülin direncinin patogenezini anlamak, T2D'ye karşı gelecekteki tedavilerin geliştirilmesine rehberlik etmek için giderek daha önemli hale gelmiştir. APC'lerin, insüline duyarlılık ve direnç de dahil olmak üzere yağ hücresi biyolojisinin incelenmesi ve sistemik ortamdan bağımsız olarak adipositlerin içsel özelliklerinin tanımlanması için mükemmel bir model olduğu kanıtlanmıştır. APC'ler farklı yağ depolarından kolayca elde edilebilir ve uygun koşullar altında olgun adipositlere ayrılabilir. Bu yöntemle adipositlerde insülin direnci/duyarlılığı üzerine doğrudan etkiler değerlendirilebilir.

<table><tbody><tr><td><Güçlü>1. İzolasyon fare adiposit öncü hücreleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACK parçalama tamponu&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Biotin Mikroboncuklar&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>eBioscience</td><td>13-0311-85</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro Ayırıcı</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bodrum membran matrisi (matrigel)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>Büyüme faktörü</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Equitech-Bio, Inc.</td><td>BAC63-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Monoklonal Antikor (30-F11) - Biotin&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz, Tip 1</td><td>Worthington Biyokimya</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>DMEM düşük glikoz</td><td>GIBCO</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Büyüme faktörü</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>ITS karışımı</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>L-askorbik asit 2-fosfat</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td>Büyüme faktörü</td></tr><tr><td>Linoleik asit-albümin</td><td>Sigma</td><td>L9530</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 201 orta</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-2</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>315-18</td><td>Büyüme faktörü</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomisin</td><td>BioWest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>Ön Ayırma Filtreleri (70 & mikro; m)</td> <td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Sıçan Anti-Fare CD16 / CD32&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>2. Adiposit farklılaşması ve insülin direnci indüksiyonu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-İzobutil-1-metilksantin [IBMX]</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>Farklılaşma kokteyli</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>5020-BP-010</td><td>Farklılaşma kokteyli</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td>Farklılaşma kokteyli</td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Cayman</td><td>71742</td><td>Farklılaşma kokteyli</td></tr><tr><td>TNF & alfa;</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>210-TA-005&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><Güçlü>3. İnsülin sinyal yolunun western blot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-beta tubulin antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab6046</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td> ile değerlendirilmesi <td>BioRad</td><td>161-0404</td><td>Laemmli tampon</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>RIPA tampon</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td>RIPA tampon</td></tr><tr><td>FluorChem E sistemi</td><td>ProteinBasit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>Laemmli tamponu</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td>Çalıştırma ve Transfer tamponu</td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>RIPA tamponu</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Laemmli tamponu</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>JT Baker</td><td>907007</td><td>Transfer tamponu</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td>TBS-T</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>77F-0379</td><td>RIPA tamponu</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>3722-19</td><td></td></tr><tr><td>Na4P2O7</td><td>Sigma</td><td>114F-0762</td><td>RIPA tamponu</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>RIPA tamponu</td></tr><tr><td>Nitroselüloz membran ve nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız kuru süt</td><td>BioRad</td><td>1706404</td><td>Bloke edici çözelti</td></tr><tr><td>Önceden boyanmış protein standardı&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610395</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8340-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Peroksidaz AffiniPure Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-035-132</td><td></td></tr><tr><td>Fosfo-İnsülin Reseptörü ve beta; &nbsp;</td><td>Hücre sinyalizasyonu</td><td>3024</td><td></td></tr><tr><td>Fosfo-Akt (Ser473) Antikoru</td><td>Hücre sinyali</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>Fosfo-IRS1 (Tyr608)</td><td>antikoru Millipore</td><td>9432</td><td></td></tr><tr><td>Sakkaroz&nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>407205</td><td>RIPA tamponu</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>1610302</td><td>Çalışan ve laemmli tamponu</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS Kemilüminesan Yüzey</td><td>Thermo Scientific</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>Çalıştırma, aktarma ve laemmli tamponu</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>JT Baker</td><td>4103-02</td><td>RIPA tamponu - TBS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>TBS-T</td></tr></tbody></table> Serisi

primer kültürde diferansiye fare adipositleri: İnsülin direncinin bir modeli

Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

İnsülin direnci, insülinin hedef hücreleri üzerindeki azaltılmış bir etkisidir ve genellikle azalmış insülin reseptör sinyalizasyonundan kaynaklanır. İnsülin direnci, tip 2 diyabet (T2D) ve dünya çapında yüksek prevalansı olan diğer obezite kaynaklı hastalıkların gelişimine katkıda bulunur. Bu nedenle, insülin direncinin altında yatan mekanizmaları anlamak büyük önem taşımaktadır. İnsülin direncini hem in vivo hem de in vitro olarak incelemek için çeşitli modeller kullanılmıştır; Primer adipositler, insülin direncinin mekanizmalarını incelemek ve bu duruma ve insülin duyarlılaştırıcı ilaçların moleküler hedeflerine karşı koyan molekülleri tanımlamak için çekici bir seçenektir. Burada, tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) ile tedavi edilen kültürde primer adipositleri kullanarak bir insülin direnci modeli oluşturduk.
Manyetik hücre ayırma teknolojisi ile kollajenaz ile sindirilmiş fare deri altı yağ dokusundan izole edilen adiposit öncü hücreleri (APC'ler), primer adipositlere ayrılır. İnsülin direnci daha sonra insülin sinyal kaskadı üyelerinin tirozin fosforilasyonunu / aktivasyonunu azaltan proinflamatuar bir sitokin olan TNF-α ile tedavi ile indüklenir. İnsülin reseptörünün (IR), insülin reseptör substratının (IRS-1) ve protein kinaz B'nin (AKT) azalmış fosforilasyonu, batı lekesi ile ölçülür. Bu yöntem, yağ dokusunda insülin direncine aracılık eden mekanizmaları incelemek için mükemmel bir araç sağlar.

Son birkaç yılda, obezite ve T2D prevalansının artması, yağ dokusunda insülin direncine aracılık eden mekanizmalar için yoğun bir araştırmaya yol açmıştır. Burada açıklanan protokolle, APC'ler insülin direncini ve duyarlılığını değerlendirmek için olgun adipositlere ayrılabilir. APC'ler birleşime ulaştıklarında, olgun adipositlere farklılaşmalarını ve TNF-α aracılı insülin direnci indüksiyonlarını tamamlamak 10 gün sürer (Şekil 1).
APC'ler, düz ve uzun şekilleri v...

Bu protokol, fare preadipositlerinin deri altı yağdan izolasyonunu, olgun adipositlere farklılaşmasını ve insülin direncinin indüklenmesini açıklar. İnsülin etkisi, batı lekesi boyunca insülin sinyal yolunun üyelerinin fosforilasyonu / aktivasyonu ile değerlendirilir. Bu yöntem, primer adipositlerde insülin direncinin/duyarlılığının doğrudan belirlenmesini sağlar.

Primer Kültürde Diferansiye Fare Adipositleri: İnsülin Direncinin Bir Modeli

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

İnsülin direnci primer adipositlerde değerlendirilebilir, bu da donörlerin yağsız ve obez veya farklı yağ depolarından hücreler gibi farklı fizyopatolojik bağlamlar altında incelenmesine izin verir. Primer adipositler, içsel özelliklerinin çoğunu korur ve hücresel çevresel faktörlerin sıkı bir kontrolü ile uzun bir süre boyunca tanımlanmış koşullar altında kültürlenebilir. Farklılaşma sürecini başlatmak için, hücreler% 80 birleşimde olmalıdır.Farklılaşma daha düşük veya daha yüksek bir birleşimde başlarsa, hücreler daha az farklılaşır veya farklılaşma kapasitelerini kaybeder. Hayvanı feda ettikten sonra,% 70 etanol ile ovalayarak fareleri dezenfekte edin. Kasık altı yağ dokusunu her fareden diseke edin ve buz üzerinde 15 mililitre tip bir kollajenaz çözeltisi içeren 15 mililitrelik bir konik tüpte toplayın.Yağ dokusunu steril cerrahi makasla küçük parçalara ayırın ve numuneleri 30 dakika boyunca 150 RPM'de bir orbital çalkalayıcıda 37 santigrat derecede tip bir kollajenaz çözeltisi ile inkübasyona tabi tutarak sindirin. Çalıştığından emin olmak ve aşırı sindirimi önlemek için sindirimi her 10 dakikada bir kontrol edin. Kollajenaz ile sindirilmeyen dokuyu ortadan kaldırmak için 200 mikrometrelik bir ağ şırıngası kullanarak filtreleyin ve çözeltiye mümkün olduğunca çok hücre boşaltmak için filtreyi tüpün kenarından geçirin.Sindirimi durdurmak için 15 mililitre soğuk DMEM %1 BSA ekleyin ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 400 G'de santrifüj yapın. Olgun adipositleri içeren üst tabakayı ve sıvı tabakanın çoğunu aspire edin. Üzerine 20 mililitre soğuk PBS% 2 FBS ekleyin ve peleti yeniden askıya alın.Beş dakika boyunca tekrar santrifüj yaptıktan sonra, kalan adipositleri ve yağları ortadan kaldırmak için üst tabakayı aspire ederek süpernatantı çıkarın. Peletleri bir mililitre ACK lizing tamponunda tekrar askıya alın. Beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.10 mililitre PBS% 2 FBS ekleyin ve karıştırın. Beş dakika boyunca santrifüj yaptıktan ve süpernatanı aspire ettikten sonra, peleti 200 mikrolitre anti-FC çözeltisinde yeniden askıya alın. Beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve hücre süspansiyonunu, manyetik hücre ayırıcısının önceden soğutulmuş raflarına uyan beş mililitrelik bir tüpe aktarın.Beş dakika boyunca santrifüj yaptıktan ve süpernatanı ortadan kaldırdıktan sonra, CD 31 monoklonal antikor biyotin ve CD 45 monoklonal antikor biyotin karışımından 200 mikrolitre ekleyin. İyice karıştırın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra 400 mikrolitre PBS% 2 FBS ekleyin ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 400 G'de tekrar santrifüj yapın.Süpernatantı aspire edin ve buz üzerinde 15 dakika boyunca 100 mikrolitre anti-biyotin mikroboncuk içinde inkübe edin. 400 mikrolitre PBS% 2 FBS ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi dört santigrat derecede beş dakika boyunca 400 G'de tekrar santrifüj yapın. Süpernatanı attıktan sonra, pelet 350 mikrolitre PBS% 2 FBS içinde yeniden askıya alın.Hücre agregalarını veya büyük parçacıkları, 70 mikrometrelik bir ön ayırma filtresine sahip tek hücre süspansiyonlarından çıkarmak için, filtreyi 100 mikrolitre PBS% 2 FBS ile etkinleştirin. Hücre süspansiyonunu filtreden geçirin ve temiz bir tüpte toplayın. Ardından filtreyi 100 mikrolitre PBS% 2 FBS ile yıkayın.Negatif ayırma stratejisini kullanarak hücrelerin manyetik ayrımını gerçekleştirmek için, etiketlenmemiş ve etiketlenmiş hücreleri kurtarmak için numuneyi soğutulmuş rafın A konumuna ve B ve C konumlarındaki iki boş tüpü yerleştirin. Daha sonra yıkama tamponunu ve çalışma tamponunu ilgili şişelere yükleyin. Ayırma bölümünde, ayrılacak örnek sayısını seçin ve tükenme protokolünü seçin.Çalıştır'a basın ve ayırmayı başlatın. Programın sonunda, etiketlenmemiş hücreleri kurtarın. Daha sonra, her bir kuyucuğun tüm yüzeyini kaplamak için 400 mikrolitre% 2.5 bazal membran matrisi ekleyerek 12 delikli bir plakayı bazal membran matrisi ile kaplayın.Fazla çözeltiyi çıkarın ve plakanın laminer akış davlumbazının içinde en az bir saat kurumasını bekleyin. Beş dakika boyunca santrifüj yaptıktan ve süpernatanı attıktan sonra, pelet 500 mikrolitre büyüme ortamında tekrar askıya alın. Adiposit öncü hücrelerini veya APC'leri, daha önce% 2.5 bazal membran matrisi ile kaplanmış 12 delikli plakanın bir kuyucuğuna tohumlayın.% 5'lik bir karbondioksit atmosferinde 37 santigrat derecede inkübe edin ve hücreler% 80 birleşime ulaşana kadar ortamı her 48 saatte bir değiştirin. Ortamı tamamen çıkardıktan sonra, hücreleri 350 mikrolitre PBS% 2 FBS ile yıkayın. Hücreleri 350 mikrolitre% 0.05 tripsin EDTA ile 37 santigrat derecede iki dakika boyunca hasat edin ve iki mililitre büyüme ortamı ekleyin.Hücreleri yeni bir 50 mililitrelik konik tüpte toplayın ve beş dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin. APC'leri daha önce %2,5 bazal membran matrisi ile kaplanmış 12 delikli plakalara geçirin ve %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler% 80 birleşime ulaşana kadar ortamı her 48 saatte bir değiştirin.% 80 birleşimde, herhangi bir büyüme ortamını aspire edin ve her bir kuyucukta 3.3 nanomolar kemik morfogenetik protein içeren 500 mikrolitre farklılaşma ortamı ile değiştirin. 48 saat sonra, ortamı kuyu farklılaştırma ortamı başına 500 mikrolitre ve farklılaştırma kokteyli ile değiştirin. Ortamı 72 saat sonra çıkarın ve 500 mikrolitre taze farklılaşma ortamına 100 nanomolar insülin ekleyin.48 saat sonra, mililitre başına dört nanogram tümör nekroz faktörü alfa veya TNF alfa ile insülin direncini indükler. Herhangi bir farklılaşma ortamını aspire edin ve TNF alfa ile 500 mikrolitre basit ortam% 2 FBS ile değiştirin. 24 saat inkübe ettikten sonra, basit bir ortamda% 0 FBS'de mililitre TNF alfa başına dört nanogram ekleyin.24 saat sonra 100 nanomolar insülin ekleyerek insülin sinyal yolunu aktive edin ve daha önce gösterildiği gibi% 5'lik bir karbondioksit atmosferinde 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı çıkarın ve 500 mikrolitre PBS ile yıkayın, insülin tedavisi olmadan bir kontrol kuyusu ekleyin. Proteini çıkarın ve insülin sinyal belirteçlerinin fosforilasyonunu Western blot ile ölçün.Bu şekilde, 12 kuyucuklu kültür plakalarında diferansiyasyonu indüklemeden önce %80 birleşimde subkutan adiposit öncü hücreleri ve yedi günlük diferansiyasyon indükledikten sonra primer adipositler gösterilmiştir. Subkutan primer adipositlerde TNF alfa tarafından indüklenen insülin direnci, insülin reseptörünün, insülin reseptör substratının ve protein kinaz B veya AKT'nin insülin kaynaklı fosforilasyonunun azalması ile gösterilmiştir. Membran anti-fosforile insülin reseptörü, anti-fosforile insülin reseptörü substratı bir, anti-fosforile AKT ve yükleme kontrolü olarak anti-beta tübülin ile incelendi.Sinyal kemilüminesans tespiti ile görselleştirildi. Temsili lekeler ve üç bağımsız deneyden elde edilen niceliklendirme burada gösterilmiştir. Bu prosedürü denerken, dikkat edilmesi gereken bir şey, TNF alfa ile insülin direncinin indüklenmesinin 24 saat boyunca% 2 FBS ve son 24 saat boyunca% 0 FBS ile olmasıdır.

differentiated-mouse-adipocytes-primary-culture-model-insulin

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, kemik iliği stromal hücrelerinin (BMSC'ler) adipositlere farklılaşmasını göstermektedir. İki aşamalı süreçte, spesifik büyüme faktörleri ve hormonların varlığında, farklılaşmamış BMSC'ler önce preadipositlere farklılaşır. Glikoz ve insülin ile tedaviyi içeren ikinci adım, çoklu lipid damlacıkları ile olgun adipositlerin oluşumuna yol açar.

İn Vitro Fare Kemik İliği Stromal Hücrenin Adipositlere Farklılaşması

Farelerde beyaz adipoz dokulardan izole İlköğretim beyaz preadipositlerden bej / brite hücrelerine ayırt edilebilir. Burada sunulan beyaz yağ "esmerleşme" moleküler düzenlenmesi okumak için güvenilir hücresel modeli sistemidir.

Bej / Brite Hücreler Stromal Vasküler Hücre İzolasyonu ve Farklılaşma

Membran olgun adiposit agrega kültürü (MAAC) kültür olgun insan adipositler için yeni bir yöntemdir. Burada insan yağlarından adipositleri nasıl izole edebileceğimizi ve MAAC'ı nasıl kurabileceğimizi ayrıntılarıyla anlatıyoruz.

Membran Olgun Adiposit Agrega Kültürleri (MAAC) Kullanarak İnsan Olgun Adipositlerin İzolasyon ve Kültürü

Burada sunulan, protein ve mikro-RNA ekspresyonunun modüle etmek için küçük müdahaleci RNA (siRNA), mikro-RNA mimikleri (miRs) veya anti-mikro-RNA (anti-miR) gibi oligonükleotidleri olgun adipositlere ulaştırmak için bir protokoldür.

Protein ve Mikro-RNA Modülasyonunun Adipozit İşlevi Üzerindeki Etkisini Incelemek için Bir Adiposit Hücre Kültürü Modeli

Bu rapor, birincil kahverengi ve beyaz preadipositlerin yenidoğan farelerden eşzamanlı izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. İzole hücreler kültürde yetiştirilebilir ve tamamen olgun beyaz ve kahverengi adipozitlere farklılaşmaya teşvik edilebilir. Yöntem, kültürdeki primer yağ hücrelerinin genetik, moleküler ve fonksiyonel olarak karakterizeini sağlar.

Primer Beyaz ve Kahverengi Preadipositlerin Yenidoğan Farelerden İzolasyonu ve Farklılaşması

Preadipositler, yenidoğan farelerden alınan interskapular kahverengi yağ dokusunun stromal vasküler fraksiyonundan izole edilir ve lipid damlacıkları biriktiren, moleküler belirteçleri eksprese eden ve olgun kahverengi adipositlerin mitokondriyal morfolojisini gösteren hücrelere farklılaşır. Bu hücreler ayrıca immünofloresan ve transmisyon elektron mikroskobu ile analiz edilir.

Yenidoğan Farelerden İnterskapular Yağ Dokusunun Stromal Vasküler Fraksiyonundan Kahverengi Adipositlerin Farklılaşması ve Görüntülenmesi

Bu protokol, preadipositleri elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu sağlamak için stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan yarı otomatik izolasyonunu tanımlar. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanmak deneysel varyasyonu azaltır ve tekrarlanabilirliği arttırır.

Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu

Olgun adipositlerin büyüklüğü ve kırılganlığı, çalışmaları ve izolasyonları için mevcut teknik ve araçları sınırlamıştır. Burada, farklı yağ depoları ve fare diyetleri için kolayca uyarlanabilen olgun murin adipositlerinin izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır.

Yağsız ve Obez Farelerden Primer Murin Adipositlerinin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

Yumurtalık kanseri Ortotopik hayvan modellerinde daha iyi insan hastalığı çoğaltmak ve bu nedenle kanser progresyonu ve tedaviye tümör yanıt anlayışımızı geliştirmek. Bir fare modelinde lusiferaz ifade over tümör hücrelerinin bir İntrabursal enjeksiyon alır. Tedavi ağızdan sonda ile yönetilmektedir. Tümör büyüme...

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Öğrenin fare primer adipositlerinde insülin direncini incelemeyi; subkutan yağ dokusundan preadiposit izolasyonu, diferansiyasyon ve Western blot ile sinyal yolu analizi yapın. Bu yöntem metabolik hastalık modelleri için değerlidir.

Primer Kültürde Diferansiye Fare Adipositleri: İnsülin Direncinin Bir Modeli

Daha fazla video keşfet