KÜBİK ile Tüm Böbrek Üç Boyutlu Boyama
18 Temmuz 2022
Mevcut protokol, üç boyutlu (3D) böbrek görüntüleme için bir doku temizleme yöntemi ve tam montajlı immünofloresan boyama yöntemini tanımlamaktadır. Bu teknik, böbrek patolojisinde makroskopik perspektifler sunarak yeni biyolojik keşiflere yol açabilir.
Bu protokol, tam böbrekte üç boyutlu yapıların görselleştirilmesine izin verir, bu da makroskopik bir bakış açısı sağlayarak böbrek araştırmalarında yenilikçi keşiflere yol açabilir. Tüm organ boyama işlemi, antikor penetrasyonundaki zorluk nedeniyle zordur. Bu protokol, böbreklerin antikorlar tarafından yüksek kaliteli, tam montajlı boyanmasını göstermiştir.
Başlamak için, perfüzyon fiksasyonu ve böbrek örneklemesinden hemen sonra, böbreği 16 saat boyunca dört santigrat derecede% 4 paraformaldehit içine batırarak daldırma fiksasyonunu gerçekleştirin. PBS kullanarak her biri iki saat boyunca üç yıkama yapın. Sabit böbreği, oda sıcaklığında hafifçe sallanarak, 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe yedi milimetre% 50 CUBIC-L'ye batırarak renk giderme ve delipidasyon işlemini gerçekleştirin.
Altı saat sonra, böbreği 14 milimetrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe yedi mililitre CUBIC-L'ye batırın ve beş gün boyunca 37 santigrat derecede hafifçe sallayın. CUBIC-L'yi her gün yenileyin. Renk giderme ve delipidasyon tamamlandıktan sonra, numune işleme için bir dağıtım kaşığı kullanın ve böbreği iki saat boyunca oda sıcaklığında PBS ile üç kez yıkayın.
Boyama tampon çözeltisinde seyreltilmiş birincil antikorlarda delipide olmuş böbreği immünoboyar, yedi gün boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatör çalkalayıcısında hafifçe sallanır. Daha sonra, böbreği% 0.5Triton X-100 ile PBS'de, PBST olarak da bilinir, bir gün boyunca oda sıcaklığında yıkayın. İkincil antikorların boyanması için, böbreği boyama tamponunda, karanlıkta, yedi gün boyunca 37 santigrat derecede hafifçe sallayarak ikincil antikorlarla tedavi edin.
Lekelenmeyi bir gün boyunca oda sıcaklığında PBST yıkama ile sabitleyin. Fiksasyon sonrası, böbreği üç saat boyunca PB'de% 1 formaldehit içine batırın ve altı saat boyunca oda sıcaklığında PBS ile yıkayın. Böbreği% 50 CUBIC-R + 'nın yedi mililitrelik bir yuvarlak alt tüpüne bir gün boyunca sallayarak batırarak kırılma indisi eşleşmesini gerçekleştirin, ardından iki gün boyunca oda sıcaklığında sallanarak yedi mililitre CUBIC-R + ile tedavi edin.
İmmün boyama yöntemi yardımıyla bütün böbrekteki sempatik sinirler ve arterler 3D böbrek görüntülemede görselleştirildi. Ayrıca iskemi-reperfüzyon hasarı sonrası anormal renal sempatik sinirler görüntülendi. Bu protokol aynı zamanda tüm dalaktaki sempatik sinirlerin görselleştirilmesini kolaylaştırdı.
Üç boyutlu immünofloresan boyama için veri niceleme işlemi burada gösterilmektedir. Ek olarak, toplama kanalları, proksimal tübüllerin S1 segmenti ve glomerüller bütün bir böbrekte başarıyla görselleştirildi. Diyabetik böbrek hastalığının erken evrelerinde ilaç uygulamasından kaynaklanan baskılanmış glomerülomegali, 3D görüntülemede de görselleştirildi.
Bu protokol, tüm böbrek içindeki spesifik molekülü etiketleyebilir. Böylece, araştırmacılar vaskülatüründeki yapı değişikliğini analiz edebilir veya böbrek dokularında nadir olaylar bulabilirler.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, tüm böbrekte üç boyutlu yapıların görselleştirilmesini sağlayarak böbrek araştırmalarında yenilikçi keşiflere yol açabilecek makroskobik bir bakış açısı sunar. Yöntem, görüntüleme kalitesini artırmak için doku şeffaflaştırma ve tüm bağlama (whole-mount) immünofloresan boyama işlemlerini içerir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyoloji
- Patoloji
Arka Plan
- Antikor penetrasyon zorlukları nedeniyle, tüm organ boyama işlemi güçtür.
- Hassas 3D görüntüleme için yüksek kaliteli boyama kritik öneme sahiptir.
- Bu protokol, böbrek görüntülemedeki yaygın sorunları ele almaktadır.
- Makroskobik perspektifler, yeni biyolojik içgörülere yol açabilir.
Çalışmanın Amacı
- 3D böbrek görüntülemesi için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Böbrek yapılarının görselleştirmesini iyileştirmek.
- Böbrek patolojisinde yenilikçi keşifleri kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- 4°C'de 16 saat boyunca %4 paraformaldehit ile daldırma fiksasyonu.
- Her biri iki saat süren, üç kez PBS ile yıkama.
- %50 CUBIC-L kullanılarak renk giderme ve delipidasyon.
- Delipidasyon işlemi sırasında oda sıcaklığında hafif çalkalama.
Ana Sonuçlar
- Böbreklerin yüksek kaliteli whole-mount boyanması gerçekleştirilmiştir.
- Antikor penetrasyonunda iyileşme sağlanmıştır.
- Böbrek yapılarının net 3D görselleştirmesi sağlanmıştır.
- Böbrek patolojisinin daha iyi anlaşılması için makroskobik perspektifler elde edilmiştir.
Sonuçlar
- Bu protokol, böbrek görüntüleme tekniklerini başarıyla geliştirmektedir.
- Böbrek araştırmalarında yeni keşifler için yollar açmaktadır.
- Gelecekteki çalışmalar, daha fazla bilgi edinmek için bu yöntem üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
CUBIC ile yapılan üç boyutlu tüm böbrek boyama, konvansiyonel patolojinin kısıtlamalarını aşarak renal mikro yapıların kapsamlı bir şekilde görselleştirilmesine olanak tanır. Bu yetenek; kan damarlarının, tübüllerin, glomerüllerin ve sempatik sinirlerin yüksek çözünürlüklü haritalamasını destekleyerek, böbrek hastalığı araştırmalarında erken keşif ve mekanistik risk azaltma için kritik bilgiler sağlar. Yöntem, preklinik portföy ilerlemesindeki temel kırılma noktalarında öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Böbrek mimarisinin ve hücresel ağların tek hücre çözünürlüğünde incelenmesine olanak tanır.
- Yaralanma veya müdahale sonrası yapısal değişiklikleri görselleştirerek biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Sempatik sinirlerin ve glomerüllerin kapsamlı haritalaması yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını kolaylaştırır.
- Böbrek hastalığı hedeflerini önceliklendirmek için öngörü güvenilirliğini artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Alt akışa yönelik görüntüleme ve nicelleştirme iş akışları için valide edilmiş 3D biyolojik sistemler hazırlar.
- Çalışmalar genelinde tekrarlanabilir ve kantitatif çıktılar elde etmek için tüm organ boyamasını standardize eder.
- Böbrek dokusundaki nadir olayların ve yapısal değişikliklerin ölçeklenebilir görüntülemesini sağlar.
- Bileşiklerin renal mikroanatomi üzerindeki etkilerinin güvenilir şekilde değerlendirilmesini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- 3B görüntüleme çıktılarını, glomerulomegali gibi hastalıkla ilgili biyobelirteçlerle hizalar.
- Müdahale etkilerini görselleştirerek, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Kapsamlı doku analizine dayalı, riski ayarlanmış ilerleme kararlarına olanak tanır.
- Translasyonel renal araştırma programları için öngörücü risk azaltma sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu tüm böbrek 3D boyama protokolü, renal araştırmalarda hipotez testlerini, hedef doğrulamayı ve translasyonel biyobelirteç uyumunu destekleyerek, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Böbrek yapılarını ve hasar yanıtlarını haritalandırarak hipotez test etmeyi ve yolakların açıklığa kavuşturulmasını kolaylaştırır.
- Tarama: Deneysel koşulların kantitatif karşılaştırması için analize hazır, tekrarlanabilir 3D görüntüleme çıktıları sağlar.
- Analitikler: Yapısal değişikliklerin ölçülmesine ve miktarının belirlenmesine olanak tanıyarak güçlü istatistiksel analizleri destekler.
- Translasyonel Araştırma: Görüntüleme bulgularını hastalık modellerine ve erken biyobelirteç tanımlamasına bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Böbrek ve ilgili doku çalışmaları genelinde tüm organ görüntülemesi için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Renal hedef doğrulamada öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir 3D görüntüleme iş akışları sunar.
- Stratejik Değer: Kapsamlı doku analizine olanak tanıyarak go/no-go kararlarını ve sermaye verimliliğini geliştirir.
- Portföy Etkisi: Böbrek hastalığı programlarının riskle uyumlu önceliklendirmesini ve ilerlemesini destekler.
Uygulama Hususları
- Doku şeffaflaştırma, immünboyama ve 3D görüntüleme analizi konularında uzmanlık gerektirir.
- Gelişmiş görüntüleme cihazlarına ve hesaplamalı analiz araçlarına erişim gereklidir.
- Tekrar üretilebilirlik ve veri karşılaştırılabilirliği için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Farklı organ sistemleri veya antikor panelleri için adaptasyon gerektirebilir.
- Antikor penetrasyonu ve boyama süresi, tüm organ görüntülemesi için pratik sınırlamalardır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:37
Kidney Fixation, Decolorization, and De-Lipidation
1:45
Whole-Mount Immunofluorescent Staining and Refractive Index (RI) Matching
3:03
Results: Whole-Mount Immunofluorescent Staining for Three-Dimensional (3D) Kidney Imaging
4:00
Conclusion
