Name: Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Öğrenin, plazma ve solid dokulardan hücre dışı vezikül izolasyonu ve yüzey antijenlerinin akış sitometrisi ile analizi. Bu yöntem, kanser ve inflamatuar hastalıkların tanısında yüksek verim ve düşük kontaminasyon sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32000974, 81870796, 82170988 ve 81930025) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2019M663986 ve BX20190380) tarafından desteklenmiştir. Temel Tıp Ulusal Deneysel Öğretim Gösteri Merkezi'nin (AMFU) yardımı için minnettarız.

Hayvan deneyleri, Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Kılavuzları ve ARRIVE kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için 8 haftalık C57Bl / 6 fareleri (dişi veya erkek tercihi olmadan) kullanılmıştır. Plazma ve doku EV'lerinin izole edilmesinde yer alan adımlar Şekil 1'de gösterilmiştir. Plazma, vücut sıvılarından EV izolasyon prosedürünü tanımlamak için bir temsilci olarak alınır. Maksiller kemik, katı dokulardan EV izolasyon prosedürünü açıklamak için bir temsilci olarak alınır.
1. Plazma ve maksiller kemik örneklerinin hazırlanması
<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek plazma numunelerini hazırlayın.<ol><li>Standart bir laboratuvar terazisi kullanarak farenin vücut ağırlığını belirleyin.</li>
		<li>1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 20 μL, 2 mg/mL heparin ekleyin ve heparinin tüpün duvarına yapışmasını sağlamak için karıştırıcı cihazı kullanın ( bkz. NOT: Antikoagülasyon tüpleri doğrudan kan toplamak için de kullanılabilir.</li>
		<li>50 mg/kg pentobarbital sodyum intraperitoneal enjeksiyonu ile fareyi uyuşturun (bkz. Farenin boynunu başparmak ve işaret parmağınızla tutun, ardından kuyruğu ve sol arka bacağı küçük parmağınızla sabitleyin ve göbeği açığa çıkardıktan sonra pentobarbital sodyumu 1 mL'lik bir enjeksiyon şırıngasıyla enjekte edin.</li>
		<li>Ayak yastığı sıkıştığında kornea refleksinin yokluğuna ve uzuv reaksiyonuna bağlı olarak farenin uygun şekilde uyuşturulduğunu onaylayın.</li>
		<li>Yüzdeki saçları ve gözlerin kirpiklerini kavisli makasla tıraş edin.</li>
		<li>Farenin boyun derisini tutun ve göz küresinin çıkıntı yapması için gözlerin etrafındaki cildi boynun arkasına bastırın. Göz küresini hızlı bir şekilde sıkıştırmak için oftalmik cımbız kullanın ve adım 1.1.2'de hazırlanan 1.5 mL santrifüj tüpleri ile kan çıkışını toplayın. Servikal omurları yerinden oynatarak fareyi feda edin. DİKKAT: Tüylere ve kirpiklere dikkat edin, çünkü hemolize neden olabilirler.</li>
		<li>Kanın pıhtılaşmasını önlemek için tüpü birkaç kez yavaşça baş aşağı çevirin. DİKKAT: Tüpü mümkün olan en kısa sürede baş aşağı çevirin.</li>
		<li>Kan örneğini 4 ° C'de 1.200 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
		<li>Süpernatantı yeni ve temiz 1,5 mL santrifüj tüplerine dikkatlice aktarın ve plazma numunesini hemen kullanın veya birkaç saat boyunca 4 ° C'de saklayın.</li>
		<li>Süpernatantı eşit miktarda 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin ve iyice karıştırın. NOT: Plazmayı toplamak için yukarıda verilen protokol ölümcüldür. Kan, fareyi feda etmeden subklaviyen ven delinmesi11 yoluyla da toplanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek maksiller kemik örneklerini hazırlayın.<ol><li>Maksiller kemiği oftalmik cımbız ve makasla izole edin ve cımbızla yumuşak dokulardan kurtulmak için PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Maksiller kemiği 1,5 mL santrifüj tüplerine koyun ve kemiği makasla küçük parçalara ayırın (boyut çapı 1 mm'den az olmalıdır). Dokuyu örtmek için belirli miktarda Liberaz (5 μg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin (8 haftalık bir fareden alınan kemik örnekleri için genellikle 1 mL) ve ardından 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Numuneyi 800 x g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
		<li>Süpernatantı bir pipetle dikkatlice yeni ve temiz 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. EV'lerin çıkarılması
<ol><li>Büyük hücre kalıntılarını ve kalan trombositleri çıkarmak için numuneleri (adım 1.1.10 ve adım 1.2.4'te hazırlanan) 2.500 x g'de (4 ° C) 15 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatantları yeni ve temiz 1,5 mL santrifüj tüplerine dikkatlice aktarın ve 16.800 x g'de (4 ° C) 30 dakika boyunca santrifüj yapın. NOT: EV'leri çıkarmak için santrifüjleme hızı 10.000 x g'nin üzerine ayarlanabilir12. Santrifüjün hızı ne kadar yüksek olursa, o kadar fazla sayıda EV elde edilebilir. Kullandığımız santrifüjün hız sınırı 16.800 x g olduğu için ( Malzeme Tablosuna bakınız), bu protokolünde bu hızı seçtik.</li>
	<li>Süpernatantı atın ve her tüpteki peletleri 1 mL PBS ile yeniden askıya alın. 16.800 x g'de (4 °C) 30 dakika boyunca santrifüj.</li>
	<li>Süpernatantı atın ve her tüpteki peletleri 50 μL PBS ile yeniden askıya alın. Bu numuneleri 4 °C'de sadece 24 saatten daha kısa bir süre için saklayın veya tercihen aşağıdaki analizler için hemen kullanın (adım 3-5). DİKKAT: -80 ° C'de depolama kabul edilemez, çünkü bu, EV'lerin konsantrasyonunu azaltacak ve EV'lerin13'ünün partikül boyutlarını artıracak, böylece EV'lerin aşağıdaki analizini etkileyecektir.</li>
</ol>3. EV'lerin morfolojik olarak tanımlanması
<ol><li>NTA analizi gerçekleştirin.<ol><li>EV'lerin miktarına göre (kabaca peletlerin boyutuna göre değerlendirilir, 50 μL plazma parçacıkları minimumdur), 5-50 μL resuspension aktarın (adım 2.4), 10 mL tampon çözeltisinde seyreltin (PBS 0.22 μm filtre ile filtrelenmiştir) ve 1 mL mikro pipetleyici uçlarıyla yeterince karıştırın. Partikül ölçümü için bu son süspansiyonu kullanın.</li>
		<li>Algılama arayüzünde görüntülenen partikül sayısı beşten az olana kadar orta ve sabit bir hızda en az 5 mL damıtılmış su enjekte etmek için steril bir 1 mL şırınga kullanın. NOT: Tüm kanaldan 1 mL damıtılmış su enjekte edildikten sonra, partikül sayısı doğrudan algılama arayüzünde gösterilir. Sayı hala beşin üzerindeyse, kriterler karşılanana kadar 1 mL damıtılmış su enjekte etmeye devam edin.</li>
		<li>Birincil çözelti oluşturmak için 1 mL damıtılmış suda 1 μL kalibrasyon çözeltisini yeniden oluşturun ve daha sonra standart bir stok çözeltisi hazırlamak için birincil çözeltinin 100 μL'sini 25 mL damıtılmış suya alın (1:250.000). Bu çalışan reaktifi 1 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın.</li>
		<li>NTA cihazını standart stok çözeltisi ile kalibre edin (adım 3.1.3). Algılama arayüzünde görüntülenen partikül sayısı 50-400 arasında (tercihen 300 civarında) olana kadar makine kanalını yıkamak için 1-5 mL steril şırınga ile 1-5 mL çalışma kalibrasyon çözeltisi enjekte edin. Kalibrasyon programını çalıştırın.</li>
		<li>Her numune ölçümünden önce makine kanalını yıkamak için adım 3.1.2'yi tekrarlayın.</li>
		<li>Algılama arayüzünde görüntülenen partikül sayısı 10'dan az olana kadar makine kanalını sabit bir hızda yıkamak üzere en az 2 mL tampon çözeltisi enjekte etmek için steril bir 1 mL şırınga kullanın.</li>
		<li>Adım 3.1.1'de hazırlanan EV numunesinin 1 mL'sini orta ve sabit bir hızla enjekte edin (önerilen hız 0,5-1 mL / s'dir). NOT: Optimum partikül konsantrasyonu, algılama arayüzünde görüntülenen partikül sayısını 50-400 arasında, tercihen 300 civarında yapmaktır. Partikül sayısı çok yüksekse, kanal duvarında partikül tutulmasını önlemek için makine kanalını hemen yıkamak için adım 3.1.2'yi tekrarlayın ve adım 3.1.1 ile EV numunesinin konsantrasyonunu ayarlayın, ardından adım 3.1.5'ten itibaren tekrarlayın.</li>
		<li>Partikül analizini yapın ve analiz raporlarını üreticinin talimatlarına göre oluşturun (bakınız Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Numune değerliyse, EV numunesini 1 mL şırınga ile geri pompalayın ve bunları 1,5 mL santrifüj tüplerinde toplayın. EV'leri çıkarmak için adım 2.2'yi tekrarlayın.</li>
		<li>Tüm numuneleri tespit ettikten sonra, makine kanalına en az 2 mL tampon çözeltisi enjekte edin ve ardından algılama arayüzünde görüntülenen partikül sayısı beşten az olana kadar en az 5 mL damıtılmış su enjekte edin.</li>
		<li>Kanaldaki suyu çıkarmak için sabit bir hızda (önerilen hız 1 mL / s'dir) en az 10 mL hava enjekte etmek için steril bir 5 mL şırınga kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>TEM analizi yapın. NOT: Yeni EV süspansiyonlarıyla aşağıdaki adımları uygulayın. Formvar-karbon kaplı elektron mikroskobu ızgarasının iki tarafı vardır, çalışma tarafı merkez ızgaralarda aydınlıktır. Aşağıdaki prosedür için EV'leri çıkarmak için minimum plazma hacmi 50 μL'dir.<ol><li>EV numunesini (adım 2.4) eşit hacimde% 4 paraformaldehit (PFA) ile karıştırın. EV'lerin 4 μL'sini bir ızgaraya koyun ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Bir polietilen film tabakasına dört damla PBS (bir damla 50 μL'ye eşittir) koyun (bkz. Izgaraları temiz mikroskobik cımbızla aktarın ve ızgaranın çalışma tarafını PBS'de bir damladan diğerine yıkayın.</li>
		<li>Izgaralarda kalan fazladan PBS'yi kaldırmak için filtre kağıtları kullanın.</li>
		<li>Izgaranın çalışma tarafını 2 dakika boyunca% 1 fosfotungstik aside ( Malzeme Tablosuna bakınız) inkübe edin ve ardından adım 3.2.2'yi tekrarlayın. DİKKAT: Fosfotungstik asit zehirli olduğundan, bu prosedürün duman davlumbazında çalıştırılması gerekir ve gereksiz fosfotungstik asidin doğrudan atılmak yerine özel olarak geri dönüştürülmesi gerekir.</li>
		<li>Izgaraları yüzü yukarı bakacak şekilde filtre kağıtlarıyla kaplı 10 cm'lik bir kaba koyun. Şebekeler RT'de birkaç yıl saklanabilir.</li>
		<li>Üreticinin talimatlarını izleyerek elektron mikroskobu altında ızgaraları gözlemleyin (bkz. NOT: Tek parçacıkların gözlemlenmesini sağlamak için, EV'lerin konsantrasyonu ayarlanmalı ve süspansiyonun belirgin bulanıklık olmadan net olması gerekir. Düşürmeden önce, numune iyice karıştırılmalıdır. Temsili TEM ve NTA analizleri Şekil 2'de gösterilmiştir.</li>
	</ol></li>
</ol>4. EV'lerin menşe analizi
NOT: EV'lerin hücresel kökeninin tanımlanması, tipik hücre zarı belirteçleri için antikorların uygulanmasını gerektirir. Aşağıdaki prosedür için EV'leri çıkarmak için minimum plazma hacmi 300 μL'dir. EV'lerin lipit çift katmanlı yapılarına dayanarak, bunları işaretlemek için membran boyası kullanılabilir. Kan plazması örnekleri için, lenfositler14 için CD18 temsil için seçilir. Maksiller kemik örnekleri için, osteoklastlar15 için osteoklastla ilişkili reseptör (OSCAR) örnek olarak seçilmiştir. FC'den önce, akış sitometresinin EVs16'nın ölçümüne uyarlandığından emin olun, çünkü alt boyut sınırı farklı akış sitometreleri arasında büyük ölçüde farklıdır.
<ol><li>Numuneleri 500 μL PBS ile yeniden askıya alın (adım 2.4) ve 50 μL'yi boş bir kontrol (tüp A) olarak yeni ve temiz bir 1,5 mL santrifüj tüpüne ve başka bir 50 μL'yi FITC için basit bir boyama tüpü olarak yeni ve temiz bir 1,5 mL santrifüj tüpüne (tüp B) aktarın. Membran boyama için birincil tüpe 0,5 μL membran boyası ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Birincil tüpü 16.800 x g'de (4 ° C) 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve topakları 200 μL PBS ile yeniden askıya alın.</li>
	<li>Her 50 μL numuneyi, PE (tüp C), yüzey işaretleyici boyama (tüp D) ve yalnızca ikincil antikor kontrolleri (tüp E) için basit boyama tüpleri için dört adet 1,5 mL santrifüj tüpüne bölün.</li>
	<li>Kemik EV örneklerinde OSCAR'ın birincil antikorunu ve plazma EV örneklerinde CD18 antikorunu (bakınız Malzeme Tablosu) tüp B'ye (adım 4.1) ve tüp D'ye (adım 4.3) ayrı ayrı (1:100'de seyreltilmiş) ekleyin. 4 ° C'de 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Tüpleri 16.800 x g'de (4 ° C) 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın, topakları 500 μL PBS ile yeniden askıya alın ve daha sonra ekstra birincil antikorları çıkarmak için 16.800 x g'de (4 ° C) 30 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın.</li>
	<li>Süpernatantı atın ve peletleri 50 μL PBS ile yeniden askıya alın, ardından sırasıyla FITC-konjuge ikincil antikorlar ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) (1:200'de seyreltilmiş) (tüp E). Aynı ikincil antikorları tüp B'ye (adım 4.1) ve tüp D'ye (adım 4.3) ekleyin. Tüm tüpleri karanlıkta 4 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin. NOT: Doğrudan floresan konjuge etiketleme antikorları, FC tespitini uygun izotip kontrolleri ile işlemek için de kullanılabilir.</li>
	<li>Sırasıyla 0,2, 0,5 ve 1 μm boyutunda boncuk süspansiyonunun bir damlasını ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1 mL PBS'ye seyreltin ve EV'ler için seçilen kapıdan emin olmak için önce her boyuttaki boncukları çalıştırın. Uygun bir ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) kullanarak boncukları ve EV popülasyonunu aramak için akış sitometresinin eşiğini ayarlayın.<ol><li>Terminal koşulunu 100.000 membran boyalı parçacık hesaplamak olarak ayarlayın. Numuneyi, üreticinin talimatları altında bir akış sitometresi ile analiz edin (bkz. Temsili sonuçlar Şekil 3'te gösterilmiştir. NOT: Floresan kanallı NTA ekipmanı da menşe analizi için kullanılabilir ve numune hazırlama işlemi FC ile aynıdır.</li>
	</ol></li>
</ol>5. EV'lerin protein içeriği analizi
NOT: EV'ler içindeki protein içeriğinin analizi, batı lekesi yoluyla gerçekleştirilir. Örneğin, plazma ve kemik EV'leri, metabolik durum için 6-fosfoglukonat dehidrogenaz (PGD) ve piruvat kinaz M2'yi (PKM2) analiz etmek için seçildi. Golgin84 (Golgi organeli) negatif kontrol olarak kullanıldı ve Flotillin (membran proteini), Caveolin (caveolae'nin integral proteini) ve β-aktin (hücre iskeleti)17 , hücre örneklerine kıyasla EV'lerde pozitif bir kontrol olarak kullanıldı. Mitofilin ve α-Actinin-4 büyük EV belirteçleri olarak seçilirken, CD9 ve CD81, EV alt popülasyonlarını göstermek için küçük EV belirteçleri olarak seçildi18. Apoa1, plazma lipoppartikül belirteci19 olarak seçildi. İlgili reaktif detayları için Malzeme Tablosu'na bakınız.
<ol><li>Peletleri (adım 2.4) 50 μL RIPA lizis tamponunda tekrar askıya alın ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>96 delikli mikroplakadaki tüm numunelerin protein konsantrasyonlarını, üreticinin talimatlarını izleyerek BCA protein testi ile ölçün (bkz.<ol><li>2 mg/mL sığır serum albüminini (BSA) %0,9 normal salin (NS) ile (%0,9 (w/v) sodyum klorür içeren) 0,5 mg/mL'ye seyreltin. 0.5 mg / mL BSA ve% 0.9 NS'yi, Tablo 1'de gösterildiği gibi, belirli hacimlere sahip üç çoğaltılmış kuyucuğa ekleyin.</li>
		<li>Numunelerin 2 μL'sini bırakın (adım 5.1) ve ayrı ayrı çoğaltılmış üç kuyucuğa 18 μL NS ekleyin.</li>
		<li>BCA Reaktif A'yı Reaktif B (50:1 Reaktif A:B) ile karıştırarak bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Her bir oyuğa 200 μL çalışma çözeltisi ekleyin ve 30 s boyunca hafifçe çalkalayın.</li>
		<li>96 delikli mikroplakayı 37 ° C'de 20-25 dakika inkübe edin.</li>
		<li>OD'yi spektrofotometre ile 596 nm'de ölçün (bkz.</li>
		<li>Verileri dışa aktarın.</li>
		<li>Standart bir eğri çizin ve numunelerin protein konsantrasyonunu hesaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonuçlara göre, numuneleri %0,9 NS ve 5x SDS-PAGE yükleme tamponu (250 mM Tris· HCl, pH 6.8, %10 SDS, %30 (v/v) Gliserol, 10 mM DTT, %0.05 (w/v) Bromofenol mavisi, bakınız Malzeme Tablosu). Tüpleri filmle sıkıca kapatın ve 100 ° C'de 5 dakika ısıtın.</li>
	<li>Numuneleri ve protein merdivenini% 4 -% 20 Hepes-Tris jelinin gradyan konsantrasyonuna yükleyin (bakınız Malzeme Tablosu). NOT: İlgili proteinlerin moleküler ağırlığına göre jel yüzdesini seçin.</li>
	<li>Jeli, proteinler bir çizgi oluşturana kadar 80 V'ta çalışan tamponda çalıştırın ve ardından yükleme boyası jelin dibinde olana kadar 1 saat boyunca 120 V'a geçin. NOT: Çalışma süresi, kullanılan ekipmana veya jelin türüne ve konsantrasyonuna göre değişebilir.</li>
	<li>Jeli, 20 s boyunca metil alkolde önceden inkübe edilmiş poliviniliden florür (PVDF) membranına (bakınız Malzeme Tablosuna bakınız) aktarın. 200 mA'da 1 saat boyunca aktarmak için ıslak bir transfer sistemi kullanın. DİKKAT: Transfer sisteminin içinde kabarcık olmadığından emin olun ve PVDF membranını ıslak tutun. NOT: Transfer süresi, hedef proteinin moleküler ağırlığına göre değişebilir; 1 KD genellikle 1 dakikaya ihtiyaç duyar.</li>
	<li>50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 50 mL Tris tamponlu salin-Ara'ya (TBST) (2 L PBS çözeltisine 2 mL Tween eklenmiş) 2,5 g BSA ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek %5 BSA bloke edici tampon hazırlayın. Toz çözülene kadar çalkalayın. Bu tampondaki membranları RT'de 2 saat boyunca ajitasyonla bloke edin.</li>
	<li>Membranları, TBST ile seyreltilmiş spesifik primer antikorlarla uygun konsantrasyonda inkübe edin (Mitofilin, 1:1000; α-Aktin-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; Golgin84, 1:1000; Flotillin-1, 1:1000; Kaveolin-1, 1:1000; PGT, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-aktin, 1:3000) gece boyunca 4 °C'de.</li>
	<li>Membranları yıkama tamponunda (2 L PBS çözeltisine eklenen 2 mL Ara) dört kez (her seferinde 15 dakika) yıkayın ve membranları uygun ikincil antikorlarla 1:4000'de RT'de 1 saat boyunca çalkalama ile inkübe edin.</li>
	<li>Membranları yıkama tamponunda dört kez yıkayın (her seferinde 15 dakika) ve Kemilüminesans Kiti ve bir jel görüntüleme sistemi kullanarak membranları görüntüleyin (bkz.</li>
</ol>

<ol><li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+extracellular+vesicles%3A+biogenesis%2C+RNA+cargo+selection%2C+content%2C+release%2C+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).</li>
<li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li>
<li>Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).</li>
<li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%3A+novel+frontiers+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63(2018).</li>
<li>Thietart, S., Rautou, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+biomarkers+in+liver+diseases%3A+A+clinician%27s+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view.</a> Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).</li>
<li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damaged+brain+accelerates+bone+healing+by+releasing+small+extracellular+vesicles+that+target+osteoprogenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors.</a> Nature Communications. 12 (1), 6043(2021).</li>
<li>In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-educated+pletelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tumor-educated pletelets.</a> Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).</li>
<li>Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+microvesicle+release%2C+uptake%2C+and+microvesicle-mediated+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation.</a> Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).</li>
<li>Brahmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((endothelial+cells+and+leukocytes+contribute+to+the+exercise-triggered+release+of+extracellular+vesicles+into+the+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820(2019).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+collection+through+subclavian+vein+puncture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Blood collection through subclavian vein puncture in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59556(2019).</li>
<li>Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+the+tumor+microenvironment%3A+old+stories%2C+but+new+tales%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 59(2019).</li>
<li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles%3A+A+systematic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162(2022).</li>
<li>Forsyth, C. B., Mathews, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+utilize+CD11b%2FCD18+for+adhesion+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans.</a> Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).</li>
<li>Kodama, J., Kaito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+multinucleation%3A+review+of+current+literature%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Osteoclast multinucleation: review of current literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685(2020).</li>
<li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIFlowCyt-EV%3A+a+framework+for+standardized+reporting+of+extracellular+vesicle+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526(2020).</li>
<li>Durcin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+adipocyte-derived+extracellular+vesicle+subtypes+identifies+distinct+protein+and+lipid+signatures+for+large+and+small+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677(2017).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li>
<li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+extracellular+vesicle+protein+cargo+with+race+and+clinical+markers+of+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17582(2019).</li>
<li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+exosomal+isolation+methods%3A+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466(2020).</li>
<li>Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS-based+proteomic+analysis+of+serum+and+plasma%3A+problem+of+high+abundant+components+and+lights+and+shadows+of+albumin+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).</li>
<li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).</li>
<li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li>
<li>Görgens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+storage+conditions+stabilizing+extracellular+vesicles+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238(2020).</li>
<li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+storage+temperature+on+airway+exosome+integrity+for+diagnostic+and+functional+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478(2017).</li>
<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109(2021).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+apoptotic+bodies+maintain+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+and+ameliorate+osteopenia+via+transferring+multiple+cellular+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors.</a> Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).</li>
<li>Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).</li>
<li>Dawson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+lipid+rafts+%28detergent-resistant+microdomains%29+and+comparison+to+extracellular+vesicles+%28exosomes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes).</a> Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Natural+liver-accumulating+drug+delivery+vehicles+for+the+treatment+of+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030(2020).</li>
<li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

EV'lerin özelliklerini, kaderini ve işlevini incelerken, EV'leri yüksek verim ve düşük kontaminasyonla izole etmek çok önemlidir. EV'leri çıkarmak için yoğunluk gradyanı santrifüjleme (DGC), boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve immünoyakalama testleri 4,20 gibi çeşitli yöntemler mevcuttur. Burada en sık kullanılan yöntemlerden biri olan diferansiyel santrifüjleme kullanılmıştır; Bunun avantajları, zaman alıcı olmaması, sınırlı numunelerden kolay izolasyon ile yü...

Hücre dışı veziküllerin (EV'ler), çeşitli fizyolojik ve patolojik olaylarda önemli rol oynayan hücre dışı yapılarıtanımlamak için hücre dışı veziküller (EV'ler) önerilmiştir2. Sağlıklı hücreler tarafından salınan EV'ler genel olarak iki ana kategoriye ayrılabilir: hücre içi endositik trafik yolu3 yoluyla oluşan eksozomlar (veya küçük EV'ler) ve hücre4'ün plazma zarının dışa doğru tomurcuklanmasıyla gelişen mikro-parçacıklar (veya büyük EV'ler). Birçok çalışma, in vitro5 kültürlü hücrelerden toplanan EV'lerin işlevine odaklanırken, dolaşımdan veya dokulardan türetilen EV'ler, organizmanın gerçek durumunu in vivo6'da yansıtma avantajına sahip olan daha karmaşık ve heterojendir. Ayrıca, hemen hemen her türlü doku in vivo EV'ler üretebilir ve bu EV'ler doku içinde haberci olarak hareket edebilir veya sistemik iletişimi kolaylaştırmak için çeşitli vücut sıvıları, özellikle periferik kan tarafından aktarılabilir7. Dolaşımdaki EV'ler ve dokular da hastalık tanı ve tedavisi için hedeflerdir8.
Eksozomlar son yıllarda yoğun bir şekilde çalışılırken, mikro-parçacıklar ayrıca ultrasantrifüjleme olmadan kolayca ekstrakte edilebilen önemli biyolojik fonksiyonlara sahiptir, böylece temel ve klinik araştırmaları teşvik eder9. Özellikle, dolaşımdan ve dokulardan izole edilen EV'lerle ilgili kritik bir konu, farklı hücre tiplerinden türetilmiş olmalarıdır10. Mikro-parçacıklar plazma zarından kesildiğinden ve bol miktarda hücre yüzey molekülü9 ile öne çıktığından, bu EV'lerin hücresel kökenini tanımlamak için ana hücre zarı belirteçlerinin kullanılması mümkündür. Spesifik olarak, membran belirteçlerini tespit etmek için akış sitometrisi (FC) tekniği uygulanabilir. Dahası, araştırmacılar EV'leri izole edebilir ve fonksiyonel kargolara dayanarak daha fazla analiz yapabilirler.
Mevcut protokol, EV'leri in vivo örneklerden çıkarmak ve karakterize etmek için kapsamlı bir prosedür sunmaktadır. EV'ler diferansiyel santrifüjleme yoluyla izole edilir ve EV'lerin karakterizasyonu, nanopartikül izleme analizi (NTA) ve iletim elektron mikroskobu (TEM) yoluyla morfolojik tanımlamayı, FC yoluyla orijin analizini ve batı lekesi yoluyla protein kargo analizini içerir. Farelerin kan plazması ve maksiller kemiği temsilci olarak kullanılır. Araştırmacılar, diğer kaynaklardan EV'ler için bu protokole başvurabilir ve ilgili değişiklikleri yapabilirler.

<table><tbody><tr><td>% 4 paraformaldehit&nbsp;</td><td>Biosharp</td><td>143174</td><td>Transmisyon elektron mikroskobu</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 anti-keçi ikincil antikoru</td><td>Yeason</td><td>34306ES60</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 anti-tavşan ikincil antikoru</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>Anti-CD18 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab131044</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>Anti-CD81 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab109201</td><td>Batı lekesi</td></tr><tr><td>anti-CD9 antikoru</td><td>Huabio</td><td>ET1601-9</td><td>Batı lekesi</td></tr><tr><td>Anti-Mitofilin antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab110329</td><td>Batı lekesi</td></tr><tr><td>APOA1 Tavşan pAb</td><td>Abklonu</td><td>A14211</td><td>Batı lekesi</td></tr><tr><td>BCA protein tahlil kiti</td><td>TIANGEN</td><td>PA115</td><td>Batı</td></tr><tr><td>lekesi BLUeye Önceden Boyanmış Protein Merdiveni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94964-500UL</td><td>Batı lekesi</td></tr><tr><td>Sığır serumu albümini</td><td>MP Biyomedikal</td><td>218072801</td><td>Batı lekesi</td></tr><tr><td>Caveolin-1 antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-53564</td><td>Batı lekesi</td></tr><tr><td>CellMask Turuncu plazma zarı lekesi</td><td>Invitrogen</td><td>C10045</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>Kemilüminesans</td><td>Amersham Biosciences</td><td>N/A</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Kavisli ameliyat makası</td><td>JZ Cerrahi Alet</td><td>J21040</td><td>EV izolasyonu</td></tr><tr><td>Elektronik denge</td><td>Zhi Ke</td><td>ZK-DST</td><td>EV izolasyonu</td></tr><tr><td>Epoch spektrofotometre</td><td>BioTek</td><td>N/A</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Eppendorf tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td>EV izolasyonu</td></tr><tr><td>Flotillin-1 antikoru</td><td>PTM BIO</td><td>PTM-5369</td><td>Batı lekesi</td></tr><tr><td>Jel görüntüleme sistemi</td><td>Tanon</td><td>4600</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Golgin84</td><td>Novus</td><td>nbp1-83352</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Izgaraları - Formvar / Karbon Kaplı - Bakır 200 mesh</td><td>Polysciences</td><td>24915</td><td>Transmisyon elektron mikroskobu</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Çözeltisi StemCell&nbsp;</td><td>7980</td><td>EV izolasyonu</td></tr><tr><td>Liberaz Araştırma Sınıfı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401127001</td><td>EV izolasyonu</td></tr><tr><td>Mikroskobik cımbız</td><td>JZ Cerrahi Alet</td><td>JD1020</td><td>EV izolasyonu</td></tr><tr><td>NovoCyte akış sitometresi</td><td>ACEA</td><td>N/A</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>Omni-PAGE Hepes-Tris Jeller Hepes %4~20, 10 kuyu</td><td>Epizyme</td><td>LK206</td><td>Batı lekesi</td></tr><tr><td>OSCAR ( D-19) antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-34235</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>PBS (2x)</td><td>ZHHC</td><td>PW013</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodyum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-33-0</td><td>Anestezitizasyon</td></tr><tr><td>Peroksidaz AffiniSaf Keçi Anti-Fare IgG (H + L)</td> <td>Jacson</td><td>115-035-003</td><td>Batı lekesi</td></tr><tr><td>Peroksidaz AffiniSaf Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L)</td> <td>Jacson</td><td>111-035-003</td><td>Batı lekesi</td></tr><tr><td>Fosfotungstik asit</td><td>RHAWN</td><td>12501-23-4</td><td>Transmisyon elektron mikroskobu</td></tr><tr><td>PKM2 (d78a4) xp tavşan ve nbsp; mab ve nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>4053t</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Polietilen (PE) film</td><td>Xiang yi</td><td>200150055</td><td>Transmisyon elektron mikroskobu</td></tr><tr><td>Poliviniliden florür membranları ve nbsp;</td><td>Roche</td><td>3010040001</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörleri</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Rekombinant anti-PGD antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab129199</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>RIPA lizis tamponu</td><td>Beyotime</td><td>P0013</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>SDS-PAGE yükleme tamponu (5x)</td><td>Cwbio</td><td>CW0027S</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Boyut boncuklar</td><td>Invitrogen</td><td>F13839</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>Masaüstü Yüksek Hızlı Mikro Santrifüjler</td><td>Hitachi</td><td>CT15E</td><td>EV izolasyonu</td></tr><tr><td>Transmisyon elektron mikroskobu</td><td>HITACHI</td><td>H-7650</td><td>Transmisyon elektron mikroskobu</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MP Biyomedikal</td><td>19472</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Vorteks Karıştırıcı Genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI0425</td><td>EV izolasyonu</td></tr><tr><td>ZetaView BASIC NTA - Nanopartikül İzleme Video Mikroskobu PMX-120</td><td>Parçacık Metrix</td><td>N/A</td><td>Nanopartikül izleme analizi</td></tr><tr><td>&alfa;-Aktinin-4 Tavşan mAbklonu</td><td></td><td>A3379</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>&beta;-aktin</td><td>Cwbio</td><td>CW0096M</td><td>Western blot</td></tr></tbody></table>

plazma ve solid dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş hücre dışı veziküllerin İzlenmesi ve analizi

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Dolaşımdaki ve dokuda yerleşik hücre dışı veziküller (EV'ler) yeni teranostik biyobelirteçler olarak umut verici hedefleri temsil eder ve organizma homeostazının korunmasında ve geniş bir hastalık spektrumunun ilerlemesinde önemli oyuncular olarak ortaya çıkarlar. Mevcut araştırma, endozomal kökenli endojen eksozomların karakterizasyonuna odaklanırken, plazma zarından dökülen mikro-parçacıklar, ana hücrelerin zar imzasını özetleyen yüzey moleküllerinin bolluğu ile öne çıkan sağlık ve hastalıkta artan bir dikkat kazanmıştır. Burada, EV'leri plazmadan ve kemik gibi katı dokulardan çıkarmak ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeye dayanan tekrarlanabilir bir prosedür sunulmaktadır. Protokol ayrıca, yüzey antijenlerinin ve EV'lerin protein yüklerinin daha sonraki profillemelerini açıklamaktadır, bu nedenle türevleri için izlenebilir ve potansiyel fonksiyonla ilgili bileşenlerle tanımlanmıştır. Bu yöntem, biyolojik, fizyolojik ve patolojik çalışmalarda EV'lerin korelasyonlu, fonksiyonel ve mekanik analizi için yararlı olacaktır.

Deneysel iş akışına göre, EV'ler periferik kan ve katı dokulardan çıkarılabilir (Şekil 1). 8 haftalık bir farenin maksiller kemiği yaklaşık 0.1 ± 0.05 g'dır ve fareden yaklaşık 300 μL plazma toplanabilir. Protokol adımlarını takiben, sırasıyla 0.3 mg ve 3 μg EV toplanabilir. TEM ve NTA ile analiz edildiği gibi, EV'lerin tipik morfolojik özellikleri, çapı 50-300 nm arasında değişen yuvarlak fincan şeklindeki membran vezikülleridir (Şekil 2). FC, membran boyası et...

Bu protokol, periferik kan ve katı dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması ve daha sonra yüzey antijenlerinin ve protein kargolarının profillenmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Bu protokol, çoğu kan ve katı dokudan doğru hücre dışı vezikülleri izole etmek ve toplamak, özellikle kaynaklarını ve protein içeriklerini analiz etmek için uygun bir yol sağlar, bu da daha fazla fonksiyonel deneye yardımcı olur. Yüksek verim ve düşük kontaminasyonun yanı sıra, bu protokolün temel avantajı, fizyolojik ve patolojik çalışmalar için yararlı olan EV'lerin yüzey antijenlerinin ve protein yüklerinin analizidir. Bir akış sitometresi ile hücre dışı veziküllerin ebeveyn hücrelerinin yüzey belirteçlerinin tespiti yoluyla enflamatuar hastalıklar ve osteoporoz gibi hastalıkların kanserlerinin teşhisini kolaylaştırır.Doku hücre dışı vezikül miktarı aşağıdaki deneyler için kritik öneme sahiptir. Hücre dışı vezikül konsantrasyonunun yüksek olmadığından emin olun. Seyreltmeyi gerçekleştirmek için sabırlı olun.Başlamak için, maksiller kemiği oftalmik cımbız ve makasla izole ederek maksiller kemik örneklerini hazırlayın ve cımbızla yumuşak dokulardan kurtulmak için PBS ile yıkayın. Daha sonra maksiller kemiği 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine koyun ve kemiği makasla çapı bir milimetre olan küçük parçalara bölün. Dokuyu örtmek için belirli miktarda Liberaz ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin.Daha sonra, numuneyi 800 G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı bir pipetle dikkatlice yeni ve temiz bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Büyük hücre kalıntılarını ve kalan trombositleri çıkarmak için hazırlanan plazma ve kemik örneklerini 2.500 G ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, süpernatantları yeni ve temiz 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine dikkatlice aktarın ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 16.800 G'de santrifüj. Daha sonra, süpernatantı atın ve her tüpteki peletleri bir mililitre PBS ile yeniden askıya alın.Daha önce gösterildiği gibi süpernatantı santrifüj ettikten ve attıktan sonra, yine, her tüpteki peletleri 50 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın ve bu numuneleri 24 saatten daha az bir süre boyunca dört santigrat derecede saklayın veya tercihen analizler için hemen kullanın. Numuneleri 500 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın ve 50 mikrolitreyi, A tüpü olarak etiketlenmiş boş bir kontrol olarak yeni ve temiz bir 1,5 mililitre santrifüj tüpüne ve 50 mikrolitreyi, B tüpü olarak etiketlenmiş FITC için basit bir boyama tüpü olarak başka bir temiz 1,5 mililitre santrifüj tüpüne aktarın. Birincil tüpü 16.800 G'de 30 dakika santrifüj ettikten ve süpernatanı attıktan sonra, peletleri 200 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın.Her 50 mikrolitrelik numuneyi, tüp C olarak etiketlenmiş PE için basit boyama tüpleri, tüp D olarak etiketlenmiş yüzey işaretleyici boyama ve tüp E olarak etiketlenmiş ikincil antikor kontrolleri için dört adet 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne bölün.Osteoklast ilişkili reseptör ve kemik hücre dışı vezikül örneklerinin birincil antikorunu ve ayrıca CD-18 antikoru ve plazma hücre dışı vezikül örneklerini B tüpüne ve tüp D'ye ayrı ayrı ekleyin, dört santigrat derecede bir saat boyunca inkübasyon. Tüpleri santrifüj edin ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı atın ve peletleri 500 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın. Yine, ekstra birincil antikorları çıkarmak için 16, 800 G ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca santrifüj.Süpernatantı attıktan sonra peletleri 50 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın, ardından tüpte sırasıyla FITC konjuge ikincil antikorlar ekleyerek E.Tüm tüpleri karanlıkta dört santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Bir damla 0.2, 0.5 ve bir mikrometre boyutunda boncuk süspansiyonunu sırasıyla bir mililitre PBS'ye seyreltin. Daha sonra, hücre dışı veziküller için seçilen kapıdan emin olmak için her bir boncuk boyutunu çalıştırın ve uygun bir ileri saçılma kullanarak boncukları ve hücre dışı vezikül popülasyonunu aramak için akış sitometresinin eşiğini ayarlayın.Terminal koşulunu 100.000 membran boyalı partikülün hesaplanması olarak ayarlayın ve numuneyi makalede açıklandığı gibi bir akış sitometresi ile analiz edin. Peletleri 50 mikrolitre RIPA-lizis tamponunda tekrar askıya alın ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. BCA protein testi ile 96 kuyucuklu mikroplakadaki tüm numunelerin protein konsantrasyonlarını ölçmek için, BSA'nın mililitresi başına iki miligramı% 0.9 normal salin ile mililitre başına 0.5 miligrama seyreltin.Mililitre BSA başına 0.5 miligramda ve normal salinin% 0.9'unda, belirli hacimlerde çoğaltılmış üç kuyucuğa. Daha sonra numunelerin iki mikrolitresini bırakın ve ayrı ayrı çoğaltılmış üç kuyucuğa 18 mikrolitre normal salin ekleyin. BCA reaktifi A'yı B reaktifi ile karıştırarak bir çalışma çözeltisi hazırladıktan sonra, her bir oyuğa 200 mikrolitre çalışma çözeltisi ekleyin ve 30 saniye boyunca hafifçe çalkalayın.Daha sonra 96 kuyucuklu mikroplakayı 37 santigrat derecede 20 ila 25 dakika boyunca inkübe edin ve spektrofotometre ile 596 nanometrede optik yoğunluğu ölçün. Ardından, verileri dışa aktarın, standart bir eğri çizin ve numunelerin protein konsantrasyonunu hesaplayın. Sonuçlara göre, numuneleri% 0.9 normal salin ve SDS-PAGE yükleme tamponunun konsantrasyonunun beş katı ile mikrolitre başına bir mikrograma seyreltin ve tüpleri filmle sıkıca kapatın ve 100 santigrat derecede beş dakika ısıtın.Numuneleri protein merdivenine% dört ila% 20 HEPy'nin tris jelinin gradyan konsantrasyonuna yükleyin. Jeli, proteinler bir çizgi oluşturana kadar 80 voltta çalışan tamponda çalıştırın. Ardından, yükleme boyası jelin dibinde olana kadar bir saat boyunca 120 volta geçin.Jeli, 200 miliamperde bir saat boyunca aktarmak için ıslak bir transfer sistemi kullanarak 20 saniye boyunca metil alkolde önceden inkübe edilmiş poliviniliden florür membranına aktarın. 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 2,5 gram BSA ve 50 mililitre TBST ekleyerek %5 BSA bloke edici tampon hazırlayın. Bu tampondaki membranları oda sıcaklığında iki saat boyunca ajitasyonla bloke edin.Membranları, TBST ile seyreltilmiş spesifik primer antikorlarla inkübe edin, gece boyunca dört santigrat derecede uygun konsantrasyona getirin. Membranları yıkama tamponunda dört kez yıkayın ve çalkalama ile oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun ikincil antikorlarla inkübe edin. Membranları yıkama tamponunda dört kez yıkadıktan sonra, bir jel görüntüleme sistemindeki kemilüminesans kitini kullanarak membranları görüntüleyin.İletim elektron mikroskobu ve nanopartikül izleme analizi, hücre dışı veziküllerin tipik morfolojik özelliklerinin 500 ila 300 nanometre arasında değişen bir çapa sahip yuvarlak ve fincan şeklinde olduğunu ortaya koymuştur. Akış sitometrisi analizi, hücre dışı veziküller üzerinde eksprese edilen spesifik membran belirteçlerinin yüzdelerini gösterir ve bu da ana hücrelerden kökenlerini ima eder. Western blot analizi, PGD ve PKM2'nin ekspresyonunu, protein içeriği ve plazma hücre dışı veziküllerin ve kemik hücre dışı veziküllerin bir temsilcisi olarak gösterir ve metabolik durumu gösterir.Hücre dışı veziküllerde Golgin-84'ün negatif ekspresyonu, mitofilin, Alfa-aktinin-4, Flotillin-1, Kaveolin-1 ve Beta-aktin'in vezikül markeri CD9 ile birlikte varlığı ile tespit edilirken, CD81 ekspresyonu, plazma hücre dışı veziküllerinde APO-A-1 varlığı eksikliği ile düşük veya yoktur. Araştırmacılar, bu nedenle adım 2.2'nin doku örneklerinin hazırlanması ve sindiriminin yeterli bir şekilde yapılması gerektiğini akılda tutarak. Aksi takdirde, dokulardan çıkarılan hücre dışı veziküllerin sayısı sınırlıdır.Hücre dışı veziküllerin floresan boyası etiketli belirteç, potansiyel fonksiyona bağlı fazı tedavi etmek için ağıza enjekte edilebilir.

isolation-analysis-traceable-functionalized-extracellular-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kanda bulunan hücre dışı veziküller çeşitli hastalıklar için yeni biyobelirteçler olarak önerilmiştir. Burada, periferik kan örneklerinden büyük plazma zarından türetilmiş mikroparçacıkların izolasyonu ve bunların konvansiyonel akış sitometrisi ve Western Blot ile müteakip analizleri için bir protokol sunuyoruz.

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

Bu karaciğerden doku ekstrasellüler (EVs) izole etmek için bir protokoldür. Protokol, kollajenaz perfüzyonunu içeren iki aşamalı bir süreci ve ardından karaciğer dokusu EVs'lerini izole etmek için diferansiyel ultrasantrifüji tanımlıyor.

Karaciğerden Doku Ekstrasellüler İzoles İzolasyon

Bu protokol için hızlı izole edilmesi insan tam kan üzerinden ekstraselüler veziküller ve belirli işaretleri karakterizasyonu için tam iş akışı floresans tabanlı nanopartikül izleme analizi ile açıklanmaktadır. Sunulan sonuçlar tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde göstermek ve hücre kültür supernatants için ayarlanabilir.

İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu

Burada, küçük hücre dışı veziküller (EVs) tüm dokular, beyin ve tümör örnekleri de dahil olmak üzere gelen yalıtmak için detaylı bir protokol sağlar. Bu yöntem daha da aşağı akım analizleri için sağlam doku EVs ayıklamak için tekrarlanabilir bir teknik sunar.

Hücre dışı veziküller çekme--dan tüm doku

Bu rapor, mikroglia veya kan makrofajlarından ekstrasellüler vezikül (EV) izolasyonu için kronolojik gereksinimleri vurgulamaktadır. Mikroglia kaynaklı EV'ler nötral büyümenin düzenleyicisi olarak değerlendirilirken, c6 glioma hücre invazyonunun kontrolünde in vitro tahlillerde kan makrofajlı eV'ler incelendi. Amaç, belirli mikroortamlarda bağışıklık arabulucusu olarak bu EV fonksiyonlarını daha iyi anlamaktır.

İmmün Hücre Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu ve Hücre Çevresi Üzerindeki Fonksiyonel Etkisinin İncelenmesi

Buradaki protokol, hücre dışı veziküllerin, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak şartlandırılmış hücre kültürü ortamından yeterince ayrılabileceğini göstermektedir.

Hücre Dışı Vezikülleri Şartlandırılmış Hücre Kültürü Ortamından Ayırmak için Boyut Dışlama Kromatografisi

En yeni nesil EV karakterizasyon araçları, aynı anda birden fazla parametre arasında tek EV analizi yapabilir. Nano-akış sitometrisi, etiketleme yapmadan 45 nm'den büyük tüm biyolojik parçacıkları ölçer ve çeşitli floresan etiketleme teknikleriyle alt popülasyonların spesifik özelliklerini tanımlar.

Nano-Flow Sitometri ile Tek Hücre Dışı Vezikül Transmembran Protein Karakterizasyonu

Mevcut protokol, fonksiyonelleştirilmiş manyetik boncuklar kullanılarak idrar hücre dışı veziküllerin etkili izolasyonu için ayrıntılı açıklamalar sağlar. Ayrıca, western blotlama, proteomik ve fosfoproteomik dahil olmak üzere sonraki analizleri kapsar.

Proteomik ve Fosfoproteomik Analizler için Biyoakışkanlardan Hücre Dışı Veziküllerin Kimyasal Afiniteye Dayalı İzolasyonu

Bu makale, insan plazmasından türetilmiş hücre dışı veziküllerin (EV) izolasyonu, karakterizasyonu ve miktar tayinifisi için bir metodolojiyi açıklar ve sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) kullanılarak EV proteomunun etiketsiz analizi için bir iş akışı sunar.

Kardiyovasküler Biyobelirteç Keşfi için Plazma Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Proteomik Analizi

Burada, insan deneklerin gözyaşı ve tükürük gibi biyolojik sıvılarından toplanan hücre dışı veziküller (EV'ler) için karakterizasyon yöntemini gösteriyoruz. Bu yöntemde kullanılan tarayıcı, numunenin 1 μL'sinden EV'lerin fenotipini, boyutunu ve toplam partikül sayısını tespit etme yeteneğine sahiptir.

Biyolojik Sıvılardan Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu

Bu protokol, enzimatik sindirim ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak morin iskelet kası ve kemik iliğinden küçük ekstrasellüler veziküllerin izole edilmesini açıklar; böylece yapısal olarak karmaşık, düşük verimli dokulardan vezikülle zenginleştirilmiş fraksiyonların tekrarlanabilir şekilde geri kazanılmasını mümkün kılarak sonraki moleküler analiz için mümkün olur.

Boyut Dışlama Kromatografisi ile Küçük Ekstrasellüler Veziküllerin Fare, İskelet Kası ve Kemik Iliğinden İzole Edilmesi

Öğrenin, plazma ve solid dokulardan hücre dışı vezikül izolasyonu ve yüzey antijenlerinin akış sitometrisi ile analizi. Bu yöntem, kanser ve inflamatuar hastalıkların tanısında yüksek verim ve düşük kontaminasyon sağlar.

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

Daha fazla video keşfet