Uzunluk Ölçekleri Arasında Kromozom Konformasyonunu Yakalama

Bu protokol, düşük bir arka plan sinyaliyle birden fazla uzunluk ölçeğinde kromozom katlama özelliklerini doğru bir şekilde algılar. Örneğin, promotör arttırıcı etkileşimleri, kromozom bölmeleri bağlamında analiz edilebilir. Kısıtlama endonükleazlarının kullanımı, girdi materyalinin sindirim seviyesini optimize etmeyi engeller.

Ligasyon ürünlerini yakalamak için jel izolasyonu ile seçim gerekmez. En yaygın sorun, DSG fiksasyonundan sonra hücrelerin kaybı ve yüksek kaliteli kütüphaneler üretmek için yeterli DNA'nın yakalanmasıdır. Başlamak için, ortamı 5 x 10 içeren 150 milimetrelik plakadan altıncı hücrelere kadar bir vakum kapanına bağlı bir Pasteur pipetle aspire edin.

Hücreleri 10 mililitre HBSS ile iki kez yıkayın. Hücreleri çapraz bağlamak için,% 1'lik formaldehit çözeltisinin 23.125 mililitresini 15 santimetrelik plakaya dökün. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin, plakayı her iki dakikada bir elle hafifçe sallayın.

Daha sonra, 1.25 mililitre 2.5 molar glisin ekleyin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe etmeden önce, çapraz bağlanma reaksiyonunu söndürmek için plakayı yavaşça döndürün. Çapraz bağlamayı durdurmak için 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübasyona devam edin. Hücreleri plakadan bir hücre kazıyıcı veya kauçuk polisi ile kazıyın ve hücre süspansiyonunu pipetli 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.

Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.000 kez G'de santrifüj yapın ve süpernatantı aspirasyonla atın. Peleti bir kez 10 mililitre Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini veya DPBS ile yıkayın. Ardından, DSG çapraz bağlamaya geçmeden önce tekrar santrifüj yapın.

DSG ile çapraz bağlantı için, peletlenmiş hücreleri 9.9 mililitre DPBS içinde yeniden askıya alın. Ardından, 100 mikrolitre 300 milimolar DSG ekleyin. Tüpü ters çevirerek karıştırın ve hücreleri oda sıcaklığında bir rotatorda 40 dakika boyunca çapraz bağlayın.

Çapraz bağlamadan sonra, 1.925 mililitre 2.5 molar glisin ekleyin, karıştırmak için ters çevirin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra, hücreleri 15 dakika boyunca 2.000 kez G'de santrifüj edin ve peleti 1.7 mililitrelik bir tüpe aktarmadan önce bir mililitre% 0.05 sığır serum albümin DPBS'sinde yeniden askıya alın. Hücreleri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 2.000 kez G'de santrifüj edin ve süpernatanı atın.

Kromozom onay yakalamaya geçmeden önce peleti sıvı azot içinde anında dondurun. Çapraz bağlı hücre alikotunu, 10 mikrolitre proteaz inhibitörü kokteyli içeren bir mililitre buz gibi soğuk lizis tamponunda yeniden askıya alın ve buz üzerinde 15 dakikalık inkübasyon için bir Dounce homojenizatörüne aktarın. Hücreleri homojenize etmek için havaneli A'yı yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirin ve hücrelerin 30 vuruştan önce soğumasını sağlamak için bir dakika boyunca inkübe edin.

Son vuruştan sonra, lizatı 1.7 mililitrelik bir tüpe aktarın. Lised süspansiyonu beş dakika boyunca 2.500 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve ıslak peleti yeniden askıya almak için hafifçe veya girdap yapın.

Minimum kümelerle yoğurt benzeri bir madde elde etmek için süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Santrifüjlemeden önce peleti 500 mikrolitre buz gibi soğuk kısıtlama tamponunda yeniden askıya alın. İkinci yıkamadan sonra, hücre boyutuna bağlı olarak, peletin taşıma hacmine yaklaşık 340 mikrolitre ekledikten sonra pipetle pipetleyerek peleti 360 mikrolitre kısıtlama tamponunda yeniden askıya alın.

Kromatin bütünlüğünü test etmek için 18 mikrolitre lizat ayırın veya kalan lizatı CI.To, toplam 380 mikrolitre hacim oluşturmak için hi-C tüpüne 38 mikrolitre% 1 sodyum dodesil sülfat ekleyin ve kabarcıklar sokmadan pipetle dikkatlice karıştırın. Kromatini açmak için numuneleri 10 dakika boyunca sallamadan 65 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, tüpü hemen buzun üzerine yerleştirin.

Triton X-100 ile sindirim karışımını hazırladıktan sonra, toplam 487 mikrolitre hacim yapmak için bu karışımın 107 mikrolitresini hi-C tüpüne ekleyin ve kromatini aralıklı çalkalama ile bir termomikserde gece boyunca 37 santigrat derecede sindirin. Ertesi gün, kalan endonükleaz aktivitesini devre dışı bırakmak için örnekleri 20 dakika boyunca 65 santigrat dereceye aktarın. Numuneyi buz üzerine yerleştirdikten sonra, 10 mikrolitre sindirim kontrolü veya DC ayırın ve dört santigrat derecede saklayın.

Yoğuşmayı kapaktan pipetle veya eğirerek çıkarın. Daha sonra, toplam 535 mikrolitre hacim oluşturmak için 58 mikrolitre biyotin doldurma karışımı ekleyin. Bir termomikserde dört saat boyunca 23 santigrat derecede inkübe etmeden önce kabarcık oluşturmadan yavaşça pipet alın.

Kuluçkadan sonra, 665 mikrolitre ligasyon karışımı ekleyerek numune hacmini 1.200 mikrolitre yapın. Numuneyi pipetleyerek, karıştırın ve bir termomikserde dört saat boyunca 16 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, hi-C numune tüpüne iki fraksiyonda 50 mikrolitre proteinaz-K ekleyin ve aralıklı sallama ile 65 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin.

DNA saflaştırması için,% 100 buz gibi soğuk etanol ekleyin ve tüpleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 18.000 kez G'de santrifüj edin. Süpernatantı pelet olmayan taraftan tamamen çıkarın ve numuneyi 10 dakika boyunca veya peletler gözle görülür şekilde kuruyana kadar havayla kurutun. Peletler kuruduktan sonra, pipetleme veya döndürme yoluyla 450 mikrolitre Tris low-EDTA'da çözünür.

Çözünür süspansiyonu, üç kilodalton moleküler ağırlık kesimi ile 0,5 milimetre santrifüj filtre ünitesine veya CFU'ya aktarın. CFU'yu 10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj yapın ve akışı atın. İkinci yıkamadan sonra, kolona 80 mikrolitre Tris düşük EDTA ekleyin.

Kolonu maksimum hızda iki dakikalık santrifüjleme için yeni bir toplama tüpüne dönüştürün. Son olarak, numuneleri% 0.8'lik bir agaroz jeli üzerine yükleyin. PCR titrasyon sonuçlarına sahip Agarose jeli, çoğu kütüphanenin beş ila sekiz döngü nihai PCR amplifikasyonu gerektirdiğini göstermiştir.

Son güçlendirilmiş PCR kütüphanesinin hücre sindirimi, bir agaroz jeli üzerindeki daha küçük parçalar tarafından gözlemlendiği gibi, uygun ligasyon bağlantılarının varlığını doğrular ve sıralamadan önce bir kalite kontrolü görevi görür. Sıralamadan sonra, haritalanan veriler, DpnII ve DdeI kombinasyonunun, geleneksel formaldehit çapraz bağlamaya DSG eklenmesiyle kısa menzilli temasları önemli ölçüde artırdığını göstermiştir. Geliştirilmiş bir sinyal, doğrudan 2D etkileşim matrislerinden uzun ve kısa mesafelerde de gözlemlenebilir.

Kompartman sinyalleri uzun mesafelerde CRISPR'dir ve kromatin döngüleri tarafından oluşturulan noktalar kısa mesafelerde daha belirgindir. Formaldehit'e ek olarak, DSG ile çapraz bağlanma, rastgele ligasyonları azaltır ve cis'teki göreceli kapsamı iyileştirir. Çapraz bağlama sırasında ve sonrasında hücreleri kaybetmemek önemlidir.

Hücre peletleri gevşek veya görünmez olabilir ve hücreler bazı tamponlardaki pipet uçlarına yapışabilir.