Name: COVID-19 ile İlişkili Orta Kulak Patolojisinin Değerlendirilmesi için Yüksek Hızlı İnsan Temporal Kemik Kesiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: Öğrenin, çift elmas bıçaklı mikrotestere kullanarak insan temporal kemik kesiti için hızlı işleme tekniğini. Bu yöntem, COVID-19 ile ilişkili orta kulak patolojisinin değerlendirilmesini hızlandırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mohamed Lehar'a bu projedeki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (T32DC000027, NSA) tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol IRB (IRB00250002) onayı ile ve insan dokusu ve enfeksiyöz materyal kullanımına yönelik kurumsal politikalara uygun olarak geliştirilmiştir. Her temporal kemik donörü ölümden önce yazılı onay verdi veya doğumdan sonra donörün ailesinden onay alındı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar ve yazılımlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Temporal kemik hasadı
<ol><li>Bu protokolü kullanmadan önce yerel kurumsal inceleme kurulu (IRB) kurulu onayını alın, insan ve bulaşıcı materyallerin kullanımı için kurumsal politikaları gözden geçirin ve doku bağışı için onay alın.</li>
	<li>COVID-19 pozitif temporal kemik bağışçılarından gelen dokularla çalışmadan önce uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) takın. KKD'nin bir N-95 solunum cihazı ve yüz siperliği (veya alternatif olarak pozitif basınçlı hava temizleme sistemi), önlük ve iki çift eldivenden oluştuğundan emin olun. Bu protokole başlamadan önce KKD'yi düzgün bir şekilde takma ve çıkarma tekniklerini gözden geçirin10.</li>
	<li>Donör ölümünden sonraki 12-24 saat içinde temporal kemik dokusunu toplayın. Vücut soğutulmamışsa, hasatın ölümden sonraki 8 saat içinde gerçekleştiğinden emin olun.<ol>
<li>Otopsi sırasında osteotom7 ile dört kesi, blok yöntemi kullanılarak temporal kemiklerin toplanması.<ol>
<li>Kraniotomiden sonra, beyni çıkarın ve kraniyal sinirleri iç işitsel kanala keskin bir şekilde bölün.</li>
			<li>Osteotom ile ilk kemik insizyonunu temporal kemiğin skuamöz kısmına paralel ve sadece medial yapın.</li>
			<li>İkinci kemik kesisini temporal kemiğin medial sınırında birincisine paralel olarak yapın.</li>
			<li>Ardından, üçüncü kesiyi 3-4 cm ön ve petroz sırtına paralel yapın.</li>
			<li>Dördüncü insizyonu kabaca üçüncüye paralel, petroz sırtına 2 cm posterior yapın. NOT: Tüm insizyonların kafatası tabanından uzandığından emin olun.</li>
			<li>Daha sonra, numunenin alt kenarı boyunca yumuşak doku ekini serbest bırakmak için keskin diseksiyon kullanarak temporal kemiği çıkarın. Mumyalama temporal kemik hasadını takiben yapılacaksa, karotis arterin kütüğünü bağlayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Doku fiksasyonu, kireçlenme ve kesitleme
<ol><li>Dokuyu derhal 200-300 mL% 10 tamponlu formalin (formaldehit) içine yerleştirin, böylece doku tamamen suya batırılır. Dokuyu oda sıcaklığında en az 72 saat formaldehit içinde bırakın ve çözeltileri günlük olarak değiştirin. Dokuyu hava geçirmez bir kapta saklayın ve virüsün yayılmasını önlemek için uygun KKD giyerken bir duman başlığı altında çözelti değişiklikleri yapın. NOT: 72 saatlik fiksasyon periyodunu takiben, örneklerin artık bulaşıcı olarak kabul edilmesine gerek yoktur.</li>
	<li>Daha hızlı doku kireçlenmesine izin vermek için her bir numuneyi üç "kalın" bölüme ayırmak için ikiz elmas bıçaklı hassas bir mikro testere kullanın. İkiz elmas bıçakları 5 mm'lik bir mesafeye ayarlayın, böylece temporal kemiğin orta kısmı 5 mm kalınlığındadır. Her iki uçtaki doku bölümlerinin 3-5 mm kalınlığında olduğundan emin olun.</li>
	<li>Kalın kesitleri, doku parafin gömme için yeterince yumuşak olana kadar, oda sıcaklığında 7-10 gün boyunca% 23 w / w formik asit kireç çözücü çözeltinin 200-300 mL'sine yerleştirin. Çözümleri günlük olarak değiştirin. Yumuşak hissetmesi gereken numuneyi palpe ederek yeterli doku dekalsifikasyonunu kontrol edin. NOT: Dekalsifikasyon röntgen ile de doğrulanabilir.</li>
	<li>Numuneleri, akan musluğun altındaki büyük bir beherin içine yerleştirerek 24 saat boyunca akan musluk suyunda durulayın.</li>
	<li>Dokuyu artan konsantrasyonda bir dizi alkolde dehidrateedin 7. Dokuyu 1.5 saat boyunca 100-200 mL% 70 etanol içine batırın, ardından sırasıyla% 95'te üç yıkama ve% 1.5 saat boyunca% 100 etanol ile yıkayın. Daha sonra, dokuyu 3 x 1,5 saat Ksilen içinde yıkayın.</li>
	<li>Kalın bölümleri parafine yerleştirin, her biri 45 dakikalık dört işlemle.</li>
	<li>İnce (10 μm) bölümleri kesmek için bir kriyotom kullanın. Dokuyu, doku eksenel düzlemde kesilecek şekilde konumlandırın. İsterseniz daha kalın (20 μm) kesitler kesin.</li>
</ol>3. İmmünohistokimya ve görüntüleme
<ol><li>Geleneksel hematoksilin ve eozin boyama isteniyorsa (burada tarif edilmemiştir), bölümleri cam slaytlara monte etmeden önce boyamayapın 7.</li>
	<li>Bölümleri pozitif yüklü cam slaytlara monte edin.</li>
	<li>Kızakları sıcak bir tabakta 60 ° C'de 20 dakika pişirin.</li>
	<li>Slaytları bir tutucuya yerleştirin ve dokuyu deparafiniz, rehidratlamak ve maskesini çıkarmak için organik bir çözücü (bu durumda dietanolamin) ve etanol içeren ticari bir ön işlem çözeltisine batırın. NOT: Bu adım, formalin ile sabitlenmiş ve parafin gömülü doku için immünohistokimya ile tatmin edici sonuçlar elde etmek için gereklidir.</li>
	<li>Kızakları düdüklü tencerede 20 dakika boyunca yüksek basınçta ısıtın.</li>
	<li>Slaytları nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin ve dokuyu ticari bir blokaj çözeltisi ile bloke edin.</li>
	<li>Primer antikor içeren doku kesitlerini anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (ACE2; 1:50), transmembran proteaz serin 2 (TMPRSS2, 1:1.000) ve Furin proteazına (1:250) karşı araştırın. NOT: ACE2, TMPRSS2 ve Furin antikorları kullanılır, çünkü bu proteinlerin SARS-CoV-2 enfeksiyonu11,12'de rol oynadığına inanılmaktadır ve bu protokol SARS-CoV-2'nin orta kulağı enfekte edebileceği olası mekanizmaları araştırmaya çalışmıştır13.</li>
	<li>HRP konjuge anti-tavşan sekonder antikoru (ACE2, Furin; 1:100 seyreltme) veya anti-keçi (TMPRSS2, 1:100 seyreltme) sekonder antikoru ile tedavi edin.</li>
	<li>Slaytları suda% 70 hematoksilin ile karşı lekeleyin.</li>
	<li>Monte edilmiş bir dijital kamera ile ışık mikroskobunda görüntüler elde edin. Orta kulak mukozasının ve östaki tüpünün görüntülerini sırasıyla 20x ve 10x büyütmede elde edin.</li>
</ol>

<ol><li>Nogueira, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+otorhinolaryngology%3A+Otology%2C+laryngology+and+rhinology%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Otorhinolaryngology%22%5BJournal%5D)">A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology.</a> Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).</li>
<li>Pappas, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otology+through+the+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology-Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Otology through the ages.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).</li>
<li>Schuknecht, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otopathology%3A+The+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Auris+Nasus+Larynx%22%5BJournal%5D)">Otopathology: The past, present, and future.</a> Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).</li>
<li>Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otopathology+in+the+United+States%3A+History%2C+current+situation%2C+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives.</a> Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).</li>
<li>Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+pathology+of+high-tone+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nervous+and+Mental+Disease%22%5BJournal%5D)">Observations on the pathology of high-tone deafness.</a> Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480(1934).</li>
<li>Andresen, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+presbycusis+from+the+first+temporal+bone+laboratory+within+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States.</a> Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).</li>
<li>Schuknecht, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchuknecht%2C+H+%22Pathology+of+the+Ear%22">Pathology of the Ear</a>. , Lea and Febiger. Philadelphia, PA. (1993).</li>
<li>Chole, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labs+in+crisis%3A+Protecting+the+science--and+art--of+otopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology.</a> Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).</li>
<li>Nager, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNager%2C+GT+%22Pathology+of+the+Ear+and+Temporal+Bone%22">Pathology of the Ear and Temporal Bone</a>. , Williams and Wilkins. Baltimore, MD. (1993).</li>
<li>COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html">https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html</a> (2022).</li>
<li>Essalmani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+roles+of+Furin+and+TMPRSS2+in+SARS-CoV-2+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity.</a> Journal of Virology. 96 (8), 0012822(2022).</li>
<li>Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACE2%2C+TMPRSS2%2C+and+Furin+expression+in+the+nose+and+olfactory+bulb+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Rhinology%22%5BJournal%5D)">ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans.</a> Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).</li>
<li>Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+virus+isolated+from+the+mastoid+and+middle+ear%3A+Implications+for+COVID-19+precautions+during+ear+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Otolaryngology+-+Head+%26+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery.</a> JAMA Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).</li>
<li>Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+decalcification+of+human+temporal+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Microwave decalcification of human temporal bones.</a> Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).</li>
<li>Stephenson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+location+of+Na%2B%2C+K%2B-ATPase+%CE%B11+subunit+in+the+human+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear.</a> Hearing Research. 400, 108113(2021).</li>
<li>McCall, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extralabyrinthine+manifestations+of+DFNA9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Extralabyrinthine manifestations of DFNA9.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).</li>
<li>Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+hearing+loss+is+dominated+by+damage+to+inner+ear+sensory+cells%2C+not+the+cellular+battery+that+powers+them%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).</li>
<li>Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+26+immunohistochemistry+in+temporal+bones+with+cochlear+otosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+%26+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis.</a> Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).</li>
<li>Lopez, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+techniques+for+the+human+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical techniques for the human inner ear.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

İnsan temporal kemik araştırması, iç ve orta kulak patolojisini incelemek için kritik öneme sahiptir, ancak zaman ve kaynak yoğun bir çaba olmaya devam etmektedir. Bu makalede, daha fazla bölümlemeden önce hızla dekalsifiye edilebilen kalın temporal kemik kesitleri oluşturmak için elmas mikro testere kullanan bir teknik açıklanmaktadır, böylece doku hasadından çalışmaya kadar geçen süre 9-10 aydan 10-14 güne düşürülebilir. Bu teknik, temporal kemik işleme için gereken kaynakları azaltabilir ve bu protokolün geliştirilmes...

İnsan temporal kemik araştırması, iç ve orta kulağın patolojisini ve patofizyolojisini incelemek için paha biçilmez bir kaynak sağlar. 19. yüzyıldan önce, otolojik hastalık 1,2,3 hakkında çok az şey biliniyordu. Otolojik hastalığı daha iyi anlamak ve "işitsel cerrahiyi şarlatanların elinden kurtarmak" için Joseph Toynbee (1815-1866), insan temporal kemiğinin histolojik bölümlerini incelemek için yöntemler geliştirdi3. Bu çalışma, Viyana'da ve 19. yüzyılın geri kalanında Avrupa'daki diğer kişilerde Adam Politzer (1835-1920) tarafından ilerletildi ve kulak 2,3,4'ü etkileyen birçok yaygın durumun histopatolojisini tanımlamak için temporal kemik kesitlerini kullandı.
Amerika Birleşik Devletleri'ndeki ilk insan temporal kemik laboratuvarı, Stacy Guild'in (1890-1966)temporal kemik kesiti 5,6 için yöntemler geliştirdiği Johns Hopkins Hastanesi'nde 1927'de açıldı. Guild tarafından geliştirilen yöntemler, ölüm sonrası hasat, fiksasyon, nitrik asitte kireçlenme, etanolde dehidrasyon, celloidin gömme, kesitleme, boyama ve montajı içeren 9-10 aylık bir süreçten oluşuyordu. Bu teknikte değişiklikler daha sonra Harold Schuknecht (1917-1996)7 tarafından yapılmıştır; Bununla birlikte, bu sürecin temel bileşenleri esasen değişmeden kalır.
Bir temporal kemik laboratuvarını sürdürmek için gereken önemli kaynaklar, temporal kemik araştırması için bir zorluk oluşturmuş ve muhtemelen son 30 yılda azalan popülaritesine katkıda bulunmuştur 4,8. Temporal kemik laboratuar kaynaklarının önemli bir kısmı 9-10 aylık temporal kemik preparasyonu sürecine ayrılmalıdır. Hazırlıkta en çok zaman alan adımlardan biri, insan vücudundaki en yoğun kemik olan temporal kemiğin kireçlenmesidir. Dekalsifikasyon tipik olarak nitrik asit veya etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içinde gerçekleştirilir ve çözeltilerin sık sık değiştirilmesini gerektirirken haftalar ila aylar sürer 7,9. Ayrıca, COVID-19 pandemisi ile ilgili olanlar gibi insan kulağının zamana duyarlı çalışmaları, bu yavaş hazırlık süreci tarafından engellenebilir. Bu yazıda, temporal kemik hasadından sonraki 10-14 gün içinde hızlı dekalsifikasyon ve doku analizine izin veren kalın kesitler oluşturmak için elmas mikro testere kullanan yüksek hızlı temporal kemik kesitleme tekniği açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Anti-ACE-2 Antikoru (1:50 uygulanan seyreltme)</td><td>Novus Biologicals</td><td>SN0754</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Furin Antikoru (1:250 seyreltme)</td><td>Abcam</td><td>EPR 14674</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TMPRSS2 Antikoru (1:1.000 seyreltme)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-20984</td><td></td></tr><tr><td>BX43 Manuel Sistem Mikroskobu</td><td>Olympus Yaşam Bilimleri Çözümleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CBN/Elmas Hibrit Gofret Blade</td><td>Pace Technologies</td><td>WB-007GP</td><td></td></tr><tr><td>Collin Mallet - 8''</td><td>Surgical Mart</td><td>SM1517</td><td></td></tr><tr><td>DS-Fi3 Mikroskop Kamera</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çift Endojen Enzim Bloğu (ticari engelleme çözümü)</td> <td>Dako</td><td>S2003</td><td></td></tr><tr><td>Eaosin Leke</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>548-24-3</td><td></td></tr><tr><td>Formalin çözeltisi, nötr tamponlu %10</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Formical-4 Kireç Çözücü (formik asit kireç çözme solüsyonu)</td><td>StatLab</td><td>1214-1 GAL</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen Lekesi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>HRP-Konjuge Anti-Tavşan İkincil Antikoru (1:100 seyreltme)</td><td>Leica Biosystems</td><td>PV6119</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS HRP At Anti-Keçi igG Tespit Kiti, Peroksidaz (1:100 seyreltme)</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>Lambotte Osteotom</td><td>Cerrahi Mart</td><td>SM1553</td><td></td></tr><tr><td>Metalografik PICO 155P Hassas Testere</td><td>Pace Technologies</td><td>PICO 155P</td><td>mikro testere</td></tr><tr><td>NIS Elemanları Yazılım Sürümü 4.6</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683</td><td>parafin</td></tr><tr><td>Beyaz Buzlu Uçlu Pozitif Yüklü Mikroskop Slaytları</td><td>Walter Ürünleri</td><td>1140B15</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Shandon Crytome FSE Kriyostat Mikrotom</td><td>New Life Scientific Inc.</td><td>A78900104</td><td>kriyotom</td></tr><tr><td>Triyoloji Ön İşlem Çözeltisi (ticari ön işlem çözümü)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>920P-05</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>920P-05</td><td></td></tr></tbody></table>

covid-19 ile İlişkili orta kulak patolojisinin değerlendirilmesi için yüksek hızlı İnsan temporal kemik kesiti

High-Speed Human Temporal Bone Sectioning for the Assessment of COVID-19-Associated Middle Ear Pathology

İnsan temporal kemik kesitlerinin histopatolojik analizi, iç ve orta kulak patolojisini incelemek için temel bir tekniktir. Temporal kemik kesitleri postmortem temporal kemik hasadı, fiksasyon, dekalsifikasyon, gömme ve boyama ile hazırlanır. Temporal kemiğin yoğunluğu nedeniyle, dekalsifikasyon zaman alıcı ve kaynak yoğun bir işlemdir; tam doku hazırlığı ortalama 9-10 ay sürebilir. Bu, otopatoloji araştırmalarını yavaşlatır ve COVID-19 pandemisiyle ilgili olanlar gibi zamana duyarlı çalışmaları engeller. Bu yazıda, doku işlemeyi hızlandırmak için temporal kemik kesitlerinin hızlı hazırlanması ve kireçlenmesi için bir teknik anlatılmaktadır.
Temporal kemikler standart teknikler kullanılarak postmortem olarak toplandı ve% 10 formalin ile sabitlendi. Her bölümü üç kalın bölüme ayırmak için ikiz elmas bıçaklı hassas bir mikro testere kullanıldı. Kalın temporal kemik kesitleri daha sonra parafine gömülmeden önce 7-10 gün boyunca kireç çözücü çözeltide dekalsifiye edildi, bir kriyotom kullanılarak ince (10 μm) bölümlere ayrıldı ve yüksüz slaytlara monte edildi. Doku örnekleri daha sonra deparafinize edildi ve antikor boyama (ACE2, TMPRSS2, Furin) için rehidre edildi ve görüntülendi. Bu teknik, hasattan doku analizine kadar geçen süreyi 9-10 aydan 10-14 güne indirdi. Yüksek hızlı temporal kemik kesitleme, otopatoloji araştırmalarının hızını artırabilir ve doku hazırlığı için gerekli kaynakları azaltabilirken, COVID-19 ile ilgili olanlar gibi zamana duyarlı çalışmaları da kolaylaştırabilir.

Orta kulak mukozası ve östaki tüpünün hematoksilin ve eozin boyaması, işlem sonrasında orta kulak mukozasının ve submukozal orta kulak dokusunun korunduğunu gösterdi (Şekil 1). İmmünohistokimyasal görüntülerde orta kulak mukozası ve östaki tüpü içinde ACE2, TMPRSS2 ve Furin proteinlerinin ekspresyonu görüldü (Şekil 1). Bu proteinlerin orta kulaktaki varlığı, SARS-CoV-2'nin orta kulaktaki solunum epitelini enfekte edebileceği olası bir yol sağlar<sup class="xref"...

Bu makalede, temporal kemik immünohistokimyasının hızlı dekalsifikasyonu ve analizi için ince dilimler oluşturmak üzere ikiz elmas bıçaklı bir mikro testere kullanan hızlı insan temporal kemik kesitleme tekniği açıklanmaktadır.

COVID-19 ile İlişkili Orta Kulak Patolojisinin Değerlendirilmesi için Yüksek Hızlı İnsan Temporal Kemik Kesiti

Histopathologic analysis of human temporal bone sections is a fundamental technique for studying inner and middle ear pathology. Temporal bone sections ...

Bu protokol, temporal kemik işleme süresini 9 ila 10 aydan 10 ila 14 güne düşürür. Bu tekniğin temel avantajı, bizim durumumuzda COVID-19 ile ilişkili orta kulak patolojisinin değerlendirilmesi ile ilgili olan otopatolojinin hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin vermesidir. Bu teknik, temporal kemiğin zamana duyarlı çalışmaları için özellikle yararlı olabilir.Gelecekte, iç kulak patolojisini incelemek için kullanım için daha da optimize edilebilir. Otopsi sırasında hasada başlayın ve kraniyal sinirleri keskin bir şekilde iç işitsel kanala bölün. Osteotom ile ilk kemik insizyonunu temporal kemiğin skuamöz kısmına paralel ve sadece medial yapın.Ardından, temporal kemiğin medial sınırında birincisine paralel olarak ikinci kemik kesisini gerçekleştirin. Üçüncü kesiyi üç ila dört santimetre ön tarafta ve petroz sırtına paralel olarak yapın. Daha sonra, dördüncü insizyonu petrous sırtının iki santimetre gerisinde kabaca üçüncüye paralel yapın.Numunenin alt kenarı boyunca tutturulmuş yumuşak dokuyu serbest bırakmak ve temporal kemiği çıkarmak için keskin diseksiyon kullanın. Hasattan sonra, dokuyu hemen 200 ila 300 mililitre% 10 tamponlu formalin içine batırın. Ardından, ikiz elmas bıçaklı hassas bir mikro testereyi beş milimetrelik bir mesafeye ayarlayın.Hızlı doku dekalsifikasyonu için, her bir numuneyi temporal kemiğin orta kısmı beş milimetre kalınlığında ve her iki uçtakiler üç ila beş milimetre kalınlığında olacak şekilde üç bölüme ayırın. Bölümleri yumuşatma için oda sıcaklığında yedi ila 10 gün boyunca 200 ila 300 mililitre 0.37 molar EDTA'ya yerleştirin. Orta kulak mukozası ve östaki tüpünün hematoksilin ve eozin boyaması, bu protokol kullanılarak işlendikten sonra dokunun korunduğunu göstermiştir.İmmünohistokimyasal analizler, bu dokularda ACE2, transmembran proteaz serin ve furin proteinlerinin varlığını gösterdi ve orta kulağın solunum epitelinde SARS-CoV2 enfeksiyonu için olası bir kök sağladı. Temporal kemik dokusunun elmas testere içinde uygun şekilde konumlandırılması önemlidir. Bu yöntemle birleştirilebilecek alternatif teknikler arasında farklı proteinler için immünohistokimya, farklı doku lekeleri ve transkriptomikler bulunur.Bu teknik, COVID-19 pandemisi sırasında orta kulakta SARS-CoV2 enfeksiyonunda rol oynayan proteinlerin varlığını hızlı bir şekilde değerlendirmemizi sağladı.

high-speed-human-temporal-bone-sectioning-for-assessment-covid-19

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Immünhistokimya ve konfokal mikroskobu ile Corti organı, kesit vibratome basit bir prosedür açıklanmıştır. Bu prosedür, Corti memeli organı ince hücre mimarisini geliştirilmiş koruma sağlar ve dolayısıyla hücre tipleri doğru ölçümü için izin verir.

Corti Memeli Organ hücre mimarisini Gelişmiş Koruma için Vibratome Kesit

Hayvan modellerinin koklealarına ototoksik ajanlar eklemek için çeşitli yöntemler mevcuttur. Sunulan, ototoksik ajanların yuvarlak pencere nişine verilmesi için cerrahi bir protokoldür. Prosedür güvenilirdir, hedefe yönelik intra-koklear lezyonlar oluşturur ve mikromimaride mekanik hasarı önler. Koklear kendi kendine onarım/rejenerasyon muayenesi mümkündür.

Koklear Hücre Dejenerasyonu Inducing için hızlı ve Güvenilir Teknik: Ototoksik Ajan Teslimat için Fare Yuvarlak pencere Yaklaşımı

Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve üs) olarak Corti yetişkin organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlar ile immün için bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte bu teknikler kokleadaki bulunan saç hücreleri, destek hücreler ve diğer hücre türleri çalışma sağlar.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

Tüm mount ve histolojik analiz için postnatal farelerden işitsel bül, kapsül ve kemikçikleri izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Doğum sonrası Farelerde İşitsel Bulla diseksiyonu: Orta Kulak Kemikler ve histolojik analiz izolasyonu

Bu makalenin amacı sadece endoskopik kadavra orta kulak diseksiyon metodolojisi tarif etmektir. Ayrıca, biz endoskopik orta kulak anatomisi için kapsamlı bir rehber sağlamayı amaçlamaktadır.

Transcanal endoskopik kulak cerrahi ile orta kulak anatomisi keşfetmek: diseksiyon el kitabı

Bu iletişim kuralının amacı decellularize ve fare cochleae doku mühendisliği uygulamaları için iskele olarak kullanımı için decalcify için etkili bir yöntem göstermektir.

Fare Cochleae iç kulak doku mühendisliği için Decellularizing için bir iletişim kuralı

PCD tanısı için başarılı ve yüksek kaliteli siliyer fonksiyonel analizi garanti etmek için, solunum epitel örneklemesi ve işlenmesi için hassas ve dikkatli bir yöntem şarttır. COVID-19 pandemisi sırasında PCD tanı hizmeti vermeye devam etmek için, siliyer videomikroskopi protokolü uygun enfeksiyon kontrol önlemlerini içerecek şekilde güncellenmiştir.

Dijital Yüksek Hızlı Siliyer Videomikroskopi Kullanarak Burun Fırçalama Örneklemesi ve İşleme – COVID-19 Pandemisine Adaptasyon

Bu makale, kadavra temporal kemiğinden insan kokleasını farklı anatomik işaretleri takip ederken delme yoluyla çıkarmak için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.

İnsan Temporal Kemiğinden Kokleanın Çıkarılması: Kadavra Protokolü

Burada, farelerden birincil koklear saç hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Başlangıçta, Corti'nin organı yenidoğan (3-5 günlük) murin koklealarından mikroskop altında diseke edildi. Daha sonra, hücreler enzimatik olarak tek hücreli bir süspansiyona sindirildi ve kültürde birkaç gün sonra immünofloresan kullanılarak tanımlandı.

Yenidoğan Farelerden Primer Koklear Saç Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Burada, labirentektomi sırasında fizyolojik koşullar altında insan vestibüler uç organlarının toplanması ve bunların immün boyama kullanılarak analizi için bir teknik tanımlanmıştır.

Labirentektomi Sırasında Fizyolojik Koşullar Altında Vestibüler Uç Organların Çıkarılması

Öğrenin, çift elmas bıçaklı mikrotestere kullanarak insan temporal kemik kesiti için hızlı işleme tekniğini. Bu yöntem, COVID-19 ile ilişkili orta kulak patolojisinin değerlendirilmesini hızlandırır.

COVID-19 ile İlişkili Orta Kulak Patolojisinin Değerlendirilmesi için Yüksek Hızlı İnsan Temporal Kemik Kesiti

Daha fazla video keşfet